亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

皺紋盤鮑的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法與流程

文檔序號:12766632閱讀:506來源:國知局

本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種皺紋盤鮑的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法。



背景技術(shù):

人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育有利于快速建立純系,因此對于遺傳育種及基礎(chǔ)生物學(xué)的研究具有重要意義。在海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類方面,該領(lǐng)域的研究相對滯后,目前僅在近十種海洋經(jīng)濟(jì)貝類中進(jìn)行了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究。這些研究主要是通過使用各種輻射或化學(xué)方法滅活精子,從而誘導(dǎo)卵子的雌核發(fā)育。研究中常用的同源精子滅活法難以排除外源精子基因組的干擾,所以近年來有學(xué)者嘗試采用異源精子誘導(dǎo)來消除這種干擾,如在櫛孔扇貝和盤鮑等貝類中的研究。然而,異源精子誘導(dǎo)依賴于物種的特異性,且受多種環(huán)境因素的影響,如精卵的不同成熟度等,另外卵子的激動也往往不同步,而且如果滅活不充分的話,其實(shí)仍有精子污染的問題,因此限制了其在雌核發(fā)育中的應(yīng)用。

與傳統(tǒng)的同源或異源精子誘導(dǎo)法相比,電刺激誘導(dǎo)法在整個過程中不需要精子的參與,能徹底排除外源精子基因組的干擾,是理想的誘導(dǎo)方法。該方法已在兔、豬、鼠和牛等哺乳動物中被廣泛應(yīng)用并取得了很大的成功。其機(jī)制是采用電刺激的方式,使卵母細(xì)胞膜上形成可逆微孔,緩沖液中的鈣離子順細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度而進(jìn)入卵胞質(zhì),引發(fā)鈣庫釋放鈣離子或者胞質(zhì)鈣離子的迅速轉(zhuǎn)移,從而模擬正常受精時鈣離子規(guī)律性的波動現(xiàn)象啟動卵子發(fā)育。但迄今為止,該方法在海洋生物雌核發(fā)育研究中,尚無報(bào)道。本研究首次嘗試采用電刺激法誘導(dǎo)皺紋盤鮑雌核發(fā)育,對其誘導(dǎo)參數(shù)及雌核發(fā)育過程中的細(xì)胞學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探索,旨在建立電刺激誘導(dǎo)皺紋盤鮑雌核發(fā)育的技術(shù)方法。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

針對上述問題,本發(fā)明旨在建立電刺激誘導(dǎo)皺紋盤鮑雌核發(fā)育的技術(shù)方法。

一種皺紋盤鮑的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法,采用電刺激法,電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù),用吸管吸取1ml卵子放入電擊杯中,即可進(jìn)行電刺激處理;

所述電刺激緩沖液為zimmerman氏緩沖液,具體成分為:0.1mmol/lca(c2h3o2)2h2o,1mmol/lk2hpo4,0.5mmol/lmg(c2h3o2)2·4h2o,0.1mmol/l還原型谷胱甘肽,1%bsa,0.30mmol/l蔗糖;

所述電脈沖儀參數(shù)為場強(qiáng)0.88kv/cm,電容10μf,3次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為7.50×104個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)方法為:經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑15cm培養(yǎng)皿中,用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng),水溫保持20℃,培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約2×105個卵子;培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次,以后每3~4h攪動一次,以促進(jìn)其孵化。

電刺激處理后2小時統(tǒng)計(jì)各組的卵裂率,24小時統(tǒng)計(jì)胚胎存活率;

卵裂率或雌核發(fā)育誘導(dǎo)率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%;

胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%。

本發(fā)明的方法簡單有效,經(jīng)電刺激誘導(dǎo)后,皺紋盤鮑的卵裂率可達(dá)到28%以上,胚胎存活率可達(dá)到98%以上。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

親本的暫養(yǎng)與精卵的收集

皺紋盤鮑取回后洗刷干凈,暫養(yǎng)于14℃循環(huán)海水中,雌雄個體分開暫養(yǎng)。投喂餌料。暫養(yǎng)期間每天升溫1℃,至16~17℃恒溫待產(chǎn)。采用陰干升溫法催產(chǎn)獲得卵子,具體操作如下:挑選性腺飽滿的成熟雌貝,洗刷干凈后陰干50min,然后將其放入水桶中,在20℃海水中催產(chǎn)。待卵子產(chǎn)出后,先用300目篩絹過濾卵子,然后用500目的篩絹過濾收集卵子,稀釋后顯微鏡下觀察定量卵子的密度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整卵子的密度。采用同樣的方法催產(chǎn)雄貝,獲得精子,精卵受精時,調(diào)節(jié)好精卵的比例。

皺紋盤鮑卵子的電刺激處理

卵子雌核發(fā)育的誘導(dǎo):采用電刺激法,電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù),用吸管吸取1ml卵子放入電擊杯中,即可進(jìn)行電刺激處理。

所述電刺激緩沖液為zimmerman氏緩沖液,具體成分為:0.1mmol/lca(c2h3o2)2h2o,1mmol/lk2hpo4,0.5mmol/lmg(c2h3o2)2·4h2o,0.1mmol/l還原型谷胱甘肽,1%bsa,0.30mmol/l蔗糖。

所述電脈沖儀參數(shù)為場強(qiáng)0.88kv/cm,電容10μf,3次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為7.50×104個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)

經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑15cm培養(yǎng)皿中,用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng),水溫保持20℃,培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約2×105個卵子;培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次,以后每3~4h攪動一次,以促進(jìn)其孵化。

電刺激處理后2小時統(tǒng)計(jì)各組的卵裂率,24小時統(tǒng)計(jì)胚胎存活率。

卵裂率或雌核發(fā)育誘導(dǎo)率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%

胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%

經(jīng)統(tǒng)計(jì),上述電刺激誘導(dǎo)后,皺紋盤鮑的卵裂率為28.22%,胚胎存活率為98.16%。



技術(shù)特征:

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種皺紋盤鮑的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法,采用電刺激法,電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡?2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù),用吸管吸取?1ml?卵子放入電擊杯中,即可進(jìn)行電刺激處理;所述電刺激緩沖液為Zimmerman氏緩沖液,具體成分為:0.1?mmol/L?Ca(C2H3O2)2H2O,1?mmol/L?K2HPO4,0.5?mmol/L?Mg(C2H3O2)2·4H2O,0.1?mmol/L?還原型谷胱甘肽,1%?BSA,0.30?mmol/L蔗糖;所述電脈沖儀參數(shù)為場強(qiáng)0.88?kv/cm,電容10μF,3?次電脈沖。所述電刺激時的卵子密度為7.50×104個/ml。本發(fā)明的方法簡單有效,經(jīng)電刺激誘導(dǎo)后,皺紋盤鮑的卵裂率可達(dá)到28%以上,胚胎存活率可達(dá)到98%以上。

技術(shù)研發(fā)人員:褚方強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者:青島清泉生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日:2015.12.24
技術(shù)公布日:2017.07.04
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
1