本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種溫度對刺參胚胎發(fā)育和生長的影響研究方法。
背景技術(shù)：
刺參生態(tài)苗種繁育是一種基于生態(tài)學(xué)原理,充分利用自然環(huán)境條件,采用高效設(shè)施和生態(tài)增養(yǎng)殖模式,通過科學(xué)管理而生產(chǎn)出的優(yōu)質(zhì)健康苗種的方法。由于刺參從早期浮游幼蟲階段便進(jìn)入到野生環(huán)境下生存,與室內(nèi)培育條件相比更加復(fù)雜和多變。受到晝夜交替、潮汐、降水等環(huán)境因素的影響,水體的溫度、鹽度、濁度、浮游生物等的變化更為劇烈,對刺參幼蟲發(fā)育和生長勢必造成影響。因此在選擇適宜生態(tài)苗種繁育的海區(qū)之前,首先需要弄清各種環(huán)境因子對刺參幼蟲發(fā)育的影響,而在這些環(huán)境因子中,與室內(nèi)培育相比溫度、鹽度、光照、濁度等環(huán)境因素差異最為明顯。
溫度是影響刺參胚胎發(fā)育至關(guān)重要的一個環(huán)境因子。我國不少學(xué)者對刺參幼蟲培育的最適溫度進(jìn)行過相關(guān)研究,隋錫林研究表明幼蟲培育的最適溫度為18~22°c，劉廣斌和li等研究指出幼蟲生長和發(fā)育的最適溫度為21~24°c,最適于幼蟲變態(tài)附著的溫度為18~21°c。溫度升高到27°c時孵化率顯著降低,而在19.7~24°c之間沒有差異。最適溫度的探討對于室內(nèi)苗種培育的溫度選擇提供了理論依據(jù)。然而,隨著近年來刺參生態(tài)育苗模式的興起,研究刺參幼蟲發(fā)育的溫度閾值對于生產(chǎn)實(shí)踐意義重大,為此,申請人設(shè)計了一系列溫度梯度實(shí)驗(yàn),彌補(bǔ)了低溫對刺參胚胎發(fā)育影響研究的缺失,并計算了胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度,以期對刺參生態(tài)育苗的環(huán)境選擇以及刺參胚胎發(fā)育研究提供借鑒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明旨在提供一種方法，可以研究溫度對刺參胚胎發(fā)育和生長的影響。
一種溫度對刺參胚胎發(fā)育和生長的影響研究方法，步驟如下：性腺發(fā)育成熟的親參經(jīng)升溫刺激后排放精和卵，4h后取樣觀察，選擇受精率>99%，直徑大于160μm受精卵的用于實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)開始時受精卵已于22.5°c的水體中孵化約6–7h，處于囊胚初期；將囊胚分別放入預(yù)先準(zhǔn)備好的各溫度梯度海水中，所用海水為沙濾后又經(jīng)800濾水袋過濾的自然海水，鹽度~31，ph7.8~8.2；各溫度梯度設(shè)置如下:5、10、12、15、19、21、25、28、31和34°c；實(shí)驗(yàn)各組培養(yǎng)于2l燒杯中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；每組設(shè)置兩個平行，溫度波動在0.5°c以內(nèi)，白天室內(nèi)自然光照，夜間無光照；各組培養(yǎng)密度為0.5ind/ml，兩天換水一次，每次1/2，不充氣，胚胎發(fā)育至小耳幼蟲后以海洋紅酵母為餌料；隔天取樣15~30只幼蟲進(jìn)行觀察和測量，觀察使用olympus-c21普通顯微鏡，拍照使用cannonpowershot-a4000數(shù)碼相機(jī)。
本發(fā)明的方法設(shè)計合理，溫度梯度設(shè)置巧妙，可以方便、有效的測定出溫度變化對刺參胚胎發(fā)育和生長的影響。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
一種溫度對刺參胚胎發(fā)育和生長的影響研究方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計如下：
性腺發(fā)育成熟的親參經(jīng)升溫刺激后排放精和卵，4h后取樣觀察，選擇受精率>99%，直徑大于160μm受精卵的用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始時受精卵已于22.5°c的水體中孵化約6–7h，處于囊胚初期。將囊胚分別放入預(yù)先準(zhǔn)備好的各溫度梯度海水中，所用海水為沙濾后又經(jīng)800濾水袋過濾的自然海水，鹽度~31，ph7.8~8.2。各溫度梯度設(shè)置如下:5、10、12、15、19、21、25、28、31和34°c。實(shí)驗(yàn)各組培養(yǎng)于2l燒杯中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每組設(shè)置兩個平行，溫度波動在0.5°c以內(nèi)，白天室內(nèi)自然光照，夜間無光照。各組培養(yǎng)密度為0.5ind/ml，兩天換水一次，每次1/2，不充氣，胚胎發(fā)育至小耳幼蟲后以海洋紅酵母為餌料。隔天取樣15~30只幼蟲進(jìn)行觀察和測量，觀察使用olympus-c21普通顯微鏡，拍照使用cannonpowershot-a4000數(shù)碼相機(jī)。
經(jīng)過一周的培養(yǎng)，結(jié)果表明：刺參囊胚在10°c及以上溫度組中均能夠發(fā)育，發(fā)育速度隨溫度的升高而加快，在25°c達(dá)到最快；溫度繼續(xù)升高到28°c時，雖然前期發(fā)育較快，但由于死亡率升高，平均體長快速增長后迅速減小；在溫度31°c條件下，刺參幼蟲經(jīng)過一周的培養(yǎng)全部死亡;培養(yǎng)在34°c條件下的刺參幼蟲在24h內(nèi)全部死亡。培養(yǎng)于10°c中的囊胚發(fā)育很慢，但能夠正常孵化并發(fā)育至耳狀幼蟲，在21°c條件下發(fā)育僅需約36h可以達(dá)到的小耳幼蟲，在該溫度下經(jīng)歷了約兩周。處于囊胚初期(64~256細(xì)胞)的刺參胚胎在5°c條件下不能正常發(fā)育，囊胚胚層加厚，并逐漸萎縮，最終死亡消解。刺參幼蟲在溫度15~21°c條件下死亡率并沒有明顯變化，在25°c或更高的溫度下死亡率明顯升高。在低于15°c的各處理中，由于胚胎發(fā)育緩慢，畸形胚胎相對增多，難于界定死亡與存活以及正常與畸形，因而在本實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行統(tǒng)計。