一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液及凍存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液，由基礎(chǔ)凍存液和胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒鈉按體積比100：1—2混合而成；所述基礎(chǔ)凍存液由體積百分比為10％的二甲基亞砜、30-50％的DMEM/F12培養(yǎng)基和40–60％胎牛血清混合而成，上述三組分體積百分比總和為100％。使用本發(fā)明凍存液的凍存方法步驟少、工藝簡化、成本低，乳腺上皮細胞復(fù)蘇后的抗凋亡、抗氧化和增殖能力強，能提高凍存乳腺上皮細胞的復(fù)蘇率，復(fù)蘇后細胞的活力高達95％以上，保證細胞生長質(zhì)量，縮短細胞復(fù)蘇的增殖周期，能長期保存奶山羊乳腺上皮細胞。
【專利說明】一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液及凍存方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及組織與細胞工程、細胞生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種保存奶山羊乳腺 上皮細胞的凍存液和凍存方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 奶山羊乳腺上皮細胞不僅可以作為研宄乳蛋白基因表達、細胞凋亡的模型，還可 以作為乳腺特異性表達載體的檢測系統(tǒng)。目前，奶山羊乳腺上皮細胞體外分離培養(yǎng)方法雖 已經(jīng)基本建立，但是還沒有公認的奶山羊乳腺上皮永生細胞系。奶山羊乳腺上皮細胞為原 代培養(yǎng)的細胞，需要經(jīng)過細胞的純化和傳代培養(yǎng)來獲得功能性的乳腺上皮細胞，不僅培養(yǎng) 周期長，而且還造成大量試劑、材料的浪費；而且傳代細胞的壽命也有限，隨著細胞培養(yǎng)代 數(shù)增加，細胞增殖能力會下降，對試驗結(jié)果也會造成影響。因此，必須利用凍存實現(xiàn)對獲得 的乳腺上皮細胞的長期保存，為實驗室研宄工作提供便利，滿足利用乳腺上皮細胞的研宄 需要。
[0003] 雖然國內(nèi)外先后有學(xué)者對奶山羊乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)做了研宄，但研宄主 要是在培養(yǎng)方法學(xué)、形態(tài)學(xué)及激素對乳腺細胞的調(diào)控等方面，對于冷凍保存的研宄并不 多，主要還是利用傳統(tǒng)的保存方法，而且人們使用的細胞凍存條件不一致，細胞復(fù)蘇后的 細胞活力也都較低，一般情況下都低于75%，使得奶山羊乳腺上皮細胞無法實現(xiàn)長期保 存。中國專利CN101861857A公開了反芻動物乳腺上皮細胞的保存方法，凍存液為10% 的DMS0、40%胎牛血清和50%細胞懸液，采用逐步慢速降溫法進行凍存，由4°C依次降 至-8°C、-20°C、_120°C，再將_120°C的冷凍保護液直接利用液氮降溫，直至降溫至_196°C 采用液氮冷凍保存。該專利只說明乳腺上皮細胞的活力天數(shù)至少為450天，但未對細胞復(fù) 蘇率和復(fù)蘇后的細胞活力、形態(tài)、增殖情況等進行研宄。上述方法，細胞凍存液中保護成份 單一，步驟較多，間隔時間長，每一個步驟的疏忽都會嚴(yán)重影響細胞的存活。
[0004] 胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一硒鈉添加劑包含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒3種成份。其中胰島 素是一種蛋白質(zhì)激素，由胰島β細胞分泌，具有促進糖原、脂肪和蛋白質(zhì)合成的作用，乳腺 上皮細胞能夠產(chǎn)生和分泌胰島素結(jié)合蛋白，通過與胰島素結(jié)合促進細胞的增殖。轉(zhuǎn)鐵蛋白 能促進上皮細胞的有絲分裂，還能結(jié)合鐵離子，減少其毒性和促進細胞的利用。硒元素是一 種理想的抗氧化劑，可以組成抗氧化酶，能保護細胞膜免受氧化損傷，保持其通透性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種步驟少、工藝簡化、成本低，乳腺上皮細胞復(fù) 蘇后的抗凋亡、抗氧化和增殖能力強，能提高凍存乳腺上皮細胞的復(fù)蘇率，復(fù)蘇后細胞的活 力高達95%以上，保證細胞生長質(zhì)量，縮短細胞復(fù)蘇的增殖周期，能長期保存奶山羊乳腺上 皮細胞的凍存液及凍存方法。
[0006] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：
[0007] 一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液，由基礎(chǔ)凍存液和胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一硒 鈉按體積比100 :1-2混合而成；
[0008] 所述基礎(chǔ)凍存液由體積百分比為10%的二甲基亞砜、30-50%的DMEM/F12培養(yǎng)基 和40 - 60%胎牛血清混合而成，上述三組分體積百分比總和為100%。
[0009] 使用權(quán)利要求1所述的保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液的凍存方法，包括以下 步驟：
[0010] (1)、取對數(shù)生長期的奶山羊乳腺上皮細胞，加入質(zhì)量濃度為0. 25%的胰蛋白酶和 0. 02%的EDTA混合溶液，置于37°C、5% 0)2的恒溫培養(yǎng)箱中進行消化，待細胞質(zhì)回縮、細胞 間隙增大、細胞縮成圓形時，用含體積百分比10%胎牛血清的終止培養(yǎng)基終止消化，離心， 棄去上清，得到奶山羊乳腺上皮細胞；
[0011] (2)、所得奶山羊乳腺上皮細胞加入所述凍存液，吹打均勻，形成細胞懸液，將細胞 懸液置于凍存管中；
[0012] (3)、將上述凍存管封閉于泡沫凍存盒中，將泡沫凍存盒在_80°C低溫條件下放置 15h ；
[0013] (4)、將泡沫凍存盒浸入液氮中保存。
[0014] 所述步驟（1)中離心轉(zhuǎn)速為1500rpm,離心時間lOmin。
[0015] 所述步驟⑵中細胞懸液的細胞濃度為0. 5-1 X IO7個/mL。
[0016] 所述泡沫凍存盒的上表面有孔，孔的深度大于所述凍存管的高度，所述凍存管插 入孔中，孔口用泡沫塊封閉。
[0017] 本發(fā)明的顯著進步有：
[0018] 1、與現(xiàn)有技術(shù)比較，省略了步驟，簡化了工藝，壓縮了成本；
[0019] 2、本發(fā)明凍存方法將凍存管封閉于泡沫凍存盒中，既能避免凍存管直接與低溫環(huán) 境接觸，又能使凍存管內(nèi)細胞迅速降溫，保證復(fù)蘇后細胞的活力高達95%以上。
[0020] 3、采用含有胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一硒鈉的細胞凍存液，能提高奶山羊乳腺上皮細胞 抗冷凍傷害能力以及復(fù)蘇后細胞的抗凋亡、抗氧化能力，復(fù)蘇后細胞的活力高、形態(tài)正常、 折光性好，活力旺盛，倍增時間短，生長曲線符合細胞生長的一般生物學(xué)規(guī)律；復(fù)蘇細胞胞 漿內(nèi)有大量的角蛋白5和角蛋白8的陽性顆粒，乳腺上皮細胞中β -酪蛋白基因的表達量 是常規(guī)凍存細胞中的10倍，保證了奶山羊乳腺上皮細胞的生物學(xué)特性不變，促進保持復(fù)蘇 細胞的乳蛋白分泌功能；實現(xiàn)復(fù)蘇后細胞的活力高達95%以上，且縮短了細胞復(fù)蘇的增殖 周期，保證了細胞生長質(zhì)量，使細胞能長期保存。
[0021] 4、采用本方法，乳腺上皮細胞的活力天數(shù)至少為700天。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明實施例1凍存液凍存的乳腺上皮細胞復(fù)蘇后的細胞形態(tài)圖，放大倍 數(shù)為200倍；
[0023] 圖2是對比實驗例凍存液凍存的乳腺上皮細胞復(fù)蘇后的細胞形態(tài)圖，放大倍數(shù)為 200 倍；
[0024] 圖3是本發(fā)明實施例1一3及對比實驗例凍存液凍存的乳腺上皮細胞復(fù)蘇的生長 曲線圖；其中，曲線Α1、Α2、Α3、Α4分別為與實施例1、實施例2、實施例3、對比實驗例相對應(yīng) 的生長曲線；
[0025] 圖4是本發(fā)明實施例1凍存液凍存的乳腺上皮細胞的復(fù)蘇細胞分裂相圖；觀察條 件為油鏡、放大倍數(shù)為1000倍；
[0026] 圖5是本發(fā)明實施例1凍存液凍存的乳腺上皮細胞的復(fù)蘇細胞角蛋白免疫組化鑒 定圖；
[0027] 圖6是作為圖5的山羊成纖維細胞角蛋白表達陰性對照圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合圖1-6對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明保護范 圍的限制。
[0029] 實施例1 :
[0030] 一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液，由ImL的胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一硒鈉稀釋 到IOOmL的基礎(chǔ)凍存液中，所述基礎(chǔ)凍存液由以下各組分混合而成：
[0031] DMEM/F12 培養(yǎng)液 30mL ;
[0032] 胎牛血清 60mL ;
[0033] 二甲基亞砜 10mL。
[0034] 實施例2 :
[0035] 一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液，由I. 5mL的胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一硒鈉稀 釋到IOOmL的基礎(chǔ)凍存液中，所述基礎(chǔ)凍存液由以下各組分混合而成：
[0036] DMEM/F12 培養(yǎng)液 40mL ;
[0037] 胎牛血清 50mL ;
[0038] 二甲基亞砜 10mL。
[0039] 實施例3 :
[0040] 一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液，由2mL的胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一硒鈉稀釋 到IOOmL的基礎(chǔ)凍存液中，所述基礎(chǔ)凍存液由以下各組分混合而成：
[0041] DMEM/F12 培養(yǎng)液 50mL ;
[0042] 胎牛血清 40mL ;
[0043] 二甲基亞砜 10mL。
[0044] 對比實驗例：
[0045] 普通凍存液，也是目前常用的凍存液，具體組分為：
[0046] DMEM/F12 培養(yǎng)液 50mL
[0047] 胎牛血清 40mL
[0048] 二甲基亞砜 IOmL
[0049] (一）、分別使用實施例1 一3和對比實驗例的凍存液凍存奶山羊乳腺上皮細胞，凍 存方法包括以下步驟：
[0050] (1)、取對數(shù)生長期的細胞，用質(zhì)量濃度0.25 % Trypsin和質(zhì)量濃度0.02 % EDTA 混合溶液于37°C，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中消化奶山羊乳腺上皮細胞，待細胞質(zhì)回縮、細胞 間隙增大、細胞縮成圓形時，用含體積百分比10%胎牛血清的終止培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)入 IOmL的離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速1500rpm,離心時間lOmin，棄去上清；
[0051] (2)、加入上述自制的細胞凍存液，并吹打均勻，形成細胞濃度為0. 5-1 X IO7個/mL 的細胞懸液，將細胞懸液按每管I. 5mL裝到凍存管中；
[0052] (3)、將凍存管封閉于泡沫凍存盒內(nèi)，將泡沫凍存盒放在_80°C低溫冰柜中放置 15h ；
[0053] (4)、將泡沫凍存盒浸入液氮中保存。
[0054] 泡沫凍存盒是邊長為IOcm的立方體泡沫塊，在其上表面均勻的打3個孔，孔深為 8cm，將高度為5cm凍存管插入孔內(nèi)后，再用泡沫小塊封閉孔口，把凍存管封閉于泡沫盒中 間，避免凍存管直接與低溫環(huán)境接觸。
[0055] (二）上述凍存的細胞復(fù)蘇方法：
[0056] (1)、從液氮中取出凍存管，在37°C的水浴中保溫l_2min，使其完全融化；
[0057] (2)、用細胞培養(yǎng)液稀釋凍存液，轉(zhuǎn)入IOmL的離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速1500rpm，離 心時間lOmin，棄去上清；
[0058] (3)、加入細胞培養(yǎng)液形成細胞懸液，并將細胞懸液的濃度調(diào)整至5X IO5個/ml，置 37°C，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0059] (三）上述凍存的細胞復(fù)蘇效果檢測：
[0060] 1、檢測細胞復(fù)蘇率
[0061] 取細胞復(fù)蘇后的細胞懸液，按每mL細胞懸液加10 μ L的0. 1 %臺盼藍溶液，混合均 勻，靜置l〇min。吸取混合液，滴入細胞計數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下觀察計數(shù)。凡折光性強而不著 色者為活細胞，染藍色者為死細胞，計數(shù)1000個細胞，計算細胞存活力，具體公式為：
[0062] 活細胞率（％ )=活細胞總數(shù)八活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）X 100 ;
[0063] 復(fù)蘇效果顯示，采用實施例1的凍存液凍存的乳腺上皮細胞復(fù)蘇率為96%，采用 實施例2的凍存液凍存的乳腺上皮細胞復(fù)蘇率為96%，采用實施例3的凍存液凍存的乳腺 上皮細胞復(fù)蘇率為98%，而采用對比實驗例的凍存液凍存的乳腺上皮細胞復(fù)蘇率為70%。
[0064] 2、細胞復(fù)蘇后的形態(tài)學(xué)觀察
[0065] 采用實施例1、2、3的凍存液凍存的細胞，在細胞復(fù)蘇過程，培養(yǎng)2h乳腺上皮細胞 開始貼壁，在倒置顯微鏡下觀察復(fù)蘇后的細胞狀態(tài)，生長過程中仍舊保持幾個至十幾個細 胞聚集生長的特性，細胞形態(tài)良好；培養(yǎng)24h后，可見95 %以上的乳腺上皮細胞大面積貼壁 生長，無懸浮細胞，細胞呈鋪路石樣生長，大小均勻，折光性好，顯示活力旺盛，如圖1所示。 采用對比實驗例的凍存液，復(fù)蘇培養(yǎng)24h后，懸浮細胞較多，貼壁生長的細胞形狀不規(guī)則， 折光性較差，活力較低，如圖2所示。
[0066] 3、復(fù)蘇細胞的生物學(xué)性狀檢測：
[0067] (1)復(fù)蘇細胞倍增時間的測定
[0068] 將復(fù)蘇后的乳腺上皮細胞以5X104個/mL接種于六孔培養(yǎng)板，在37°C、5% CO2、飽 和濕度培養(yǎng)，接種后120h消化細胞并計數(shù)。具體計算公式為：
[0069] T= tlog2/(logNt/N0)
[0070] 其中，T為細胞群體倍增時間，t為培養(yǎng)時間（h)，NO為初種細胞數(shù)，Nt為t時間的 細胞數(shù)。
[0071] 測定結(jié)果如表1所示：
[0072] 表1山羊乳腺上皮細胞在不同凍存液中復(fù)蘇后的群體倍增時間
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液，其特征在于，由基礎(chǔ)凍存液和胰島素一轉(zhuǎn) 鐵蛋白一砸納按體積比100 :1-2混合而成； 所述基礎(chǔ)凍存液由體積百分比為10%的二甲基亞砜、30-50 %的DMEM/F12培養(yǎng)基和 40 - 60%胎牛血清混合而成，上述三組分體積百分比總和為100%。
2. 如權(quán)利要求1所述的保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液的凍存方法，其特征在于， 包括以下步驟： (1) 、取對數(shù)生長期的奶山羊乳腺上皮細胞，加入質(zhì)量濃度為〇. 25%的胰蛋白酶和質(zhì)量 濃度為〇. 02%的EDTA混合溶液，置于37°C、5% C02的恒溫培養(yǎng)箱中進行消化，待細胞質(zhì) 回縮、細胞間隙增大、細胞縮成圓形時，用含體積百分比10%胎牛血清的終止培養(yǎng)基終止消 化，離心，棄去上清，得到奶山羊乳腺上皮細胞； (2) 、所得奶山羊乳腺上皮細胞加入所述凍存液，吹打均勻，形成細胞懸液，將細胞懸液 置于凍存管中； (3) 、將上述凍存管封閉于泡沫凍存盒中，將泡沫凍存盒在-80°C低溫條件下放置15h ; (4) 、將泡沫凍存盒浸入液氮中保存。
3. 如權(quán)利要求2所述的利用權(quán)利要求1所述的保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液的凍 存方法，其特征在于，所述步驟（1)中離心轉(zhuǎn)速為1500rpm,離心時間lOmin。
4. 如權(quán)利要求2所述的利用權(quán)利要求1所述的保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液的凍 存方法，其特征在于，所述步驟（2)中細胞懸液的細胞濃度為0. 5-1 X 107個/mL。
5. 如權(quán)利要求2所述的利用權(quán)利要求1所述的保存奶山羊乳腺上皮細胞的凍存液的凍 存方法，其特征在于，所述泡沫凍存盒的上表面有孔，孔的深度大于所述凍存管的高度，所 述凍存管插入孔中，孔口用泡沫塊封閉。
【文檔編號】A01N1/02GK104488852SQ201410814668
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】曹艷紅, 關(guān)志惠, 黃俊翔, 周恒 , 莫柳忠, 韋明松 申請人:廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所