一種分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，包括：選擇形態(tài)特征好、遺傳多樣性高的草魚作為親本，標(biāo)記為G1，注射激素進(jìn)行催熟，人工授精獲得受精卵，進(jìn)行1齡種魚培育；同年12月優(yōu)選G1中具有生長優(yōu)勢的個體進(jìn)行抗性實(shí)驗(yàn)，存活的個體通過草魚親子鑒定的技術(shù)找出對應(yīng)的親本G1A，通過對G1A及其第二年子代g1A進(jìn)行驗(yàn)證確定優(yōu)良品系。使用本發(fā)明的草魚優(yōu)良品系選育及驗(yàn)證方法，周期短，且可根據(jù)不同的養(yǎng)殖環(huán)境需要選育出具有相應(yīng)抗性的優(yōu)良草魚品系。
【專利說明】一種分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及草魚優(yōu)良品種選育及效果驗(yàn)證的方法，具體地說，是一種分子輔助選 育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 草魚是我國四大家魚之一，在我國已有近兩千年的養(yǎng)殖歷史。早期草魚養(yǎng)殖用魚 苗主要是從天然水體中捕撈，靠天吃飯一直限制草魚養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展；草魚人工繁殖技術(shù) 突破后，我國出現(xiàn)了大規(guī)模草魚養(yǎng)殖狀況；目前，草魚產(chǎn)量已多年保持在淡水養(yǎng)殖第一位。 但目前草魚養(yǎng)殖行業(yè)仍面臨較多困擾，最重要的問題是草魚種質(zhì)資源正在不斷衰退。不注 重親魚的選育與更新、甚至進(jìn)行逆向選育或近親繁殖，是導(dǎo)致草魚種質(zhì)資源不斷衰退的主 要原因。
[0003] 草魚選育工作中最重要的環(huán)節(jié)是親本的選擇。在傳統(tǒng)選育方法中，親本的選擇主 要依據(jù)其形態(tài)特征，但親本之間的親緣關(guān)系不容易確定，會導(dǎo)致選育結(jié)果的不穩(wěn)定性；且草 魚性成熟年齡較長，傳統(tǒng)選育過程消耗大量的人力物力，選育結(jié)果也很難驗(yàn)證；尤為重要的 是，我國草魚養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，不同時(shí)間、地域有其獨(dú)特性，需要有不同的優(yōu)良品系，而傳統(tǒng)選 育方法自身特點(diǎn)很難滿足這一要求。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞、生化、分子等技術(shù)也 逐漸應(yīng)用于草魚選育工作，已出現(xiàn)了抗性強(qiáng)或生長快的轉(zhuǎn)基因草魚品系。但大眾對轉(zhuǎn)基因 的認(rèn)同率普遍較低，轉(zhuǎn)基因草魚的發(fā)展受到一定限制。
[0004] 中國專利文獻(xiàn)200910197874. X，公開了一種養(yǎng)殖草魚家系的構(gòu)建和良種選育方 法，該種方法能選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的草魚新品種，但其需要分別對魚種的夏花、1齡魚、 2齡魚、3齡魚、4齡魚五個階段進(jìn)行優(yōu)選，耗時(shí)長，而且該種方法沒有涉及對草魚的抗病毒、 耐鹽、耐低氧等優(yōu)良品系的選育。因此，開發(fā)一種能針對不同地域環(huán)境，快速選育出具有生 長優(yōu)勢及不同抗性的草魚選育的方法是十分必要的。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及 選育效果驗(yàn)證的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0007] 一種分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)親本的選擇：選擇體型勻稱，活潑健康，體重高于平均體重15?20%，并達(dá)到 性成熟的草魚作為待選親本；使用pit標(biāo)記對每條待選親本進(jìn)行編號，并剪取每條魚的胸 鰭，用12對微衛(wèi)星對剪下來的胸鰭進(jìn)行STR分型，對分型結(jié)果用Cervus 3.0軟件分析這 些待選親本的遺傳多樣性；對遺傳多樣性較低的待選親本進(jìn)行舍去，有較高遺傳多樣性的 作為親本，并標(biāo)記為G tl;所述G ^為待選親本中遺傳多樣性較高，用于后續(xù)選育實(shí)驗(yàn)的基本群 體；所述12對微衛(wèi)星序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 24所示。
[0009] (2)建立家系：Gtl親本性腺成熟后，一次人工注射激素進(jìn)行催熟，人工授精獲得受 精卵；每個家系的受精卵放入一個孵化桶，室溫下進(jìn)行孵化，孵化桶底部進(jìn)入流水，水從桶 上面流出；不同家系受精卵的卵膜破裂4天后，每家系隨機(jī)取500條混于相同大小池塘飼 養(yǎng)，池塘提前進(jìn)行消毒，提前一周使用畜糞培育生物餌料，飼養(yǎng)過程中隨時(shí)關(guān)注塘內(nèi)生物餌 料的變化情況，及時(shí)補(bǔ)充肥料；至夏花階段，同一家系魚苗平均分配到兩個或兩個以上池塘 進(jìn)行1齡種魚培育，并標(biāo)記為G 1;所述G為G ^第一年子代。
[0010] (3)優(yōu)良品系的篩選：同年12月對G1的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并挑選個體較大、活潑 健康的G1進(jìn)行抗性試驗(yàn)，取存活下來種魚，并標(biāo)記為G A ;取G1A的部分胸鰭，用無水乙醇保 存，草魚親子鑒定技術(shù)找出G1A相對應(yīng)的親本，并標(biāo)記為G/，G 1中除去G A所剩下的群體標(biāo) 記為G1B, Gtl中除去G /所剩下的群體標(biāo)記為GtlB ;所述G1A為G1中具有生長優(yōu)勢且抗性試驗(yàn) 存活的群體；所述GtlA為G 1A對應(yīng)的親本。
[0011] ⑷優(yōu)良品系的驗(yàn)證：第2年分別兩個群體進(jìn)行人工授精、建立家系、受 精卵孵化和1齡種魚培育（方法同步驟2)，分別標(biāo)記為 glA和glB ;同年12月份分別對glA 和glB兩個群體的體長、體寬、體高和體重進(jìn)行測量，比較glA群體的生長優(yōu)勢；glA和 glB各 隨機(jī)取1000尾種魚進(jìn)行抗性試驗(yàn)（方法同步驟3)，比較glA群體的抗性優(yōu)勢；所述的 glA、 S1B分別為GtlA和GtlB兩群體親本第二年對應(yīng)的子后。
[0012] (5)優(yōu)良品系的確定：通過對待選親本的篩選和驗(yàn)證，GtlA群體中同時(shí)滿足下列兩 個條件的即可作為兼具生長優(yōu)勢、抗性的優(yōu)良品系：a.第一年子代與G 1B相比有生長優(yōu)勢 和抗性；b.第二年子代與glB相比兼具生長優(yōu)勢和抗性。
[0013] 所述的抗性試驗(yàn)為抗嗜水氣單胞菌攻毒試驗(yàn)、抗鹽試驗(yàn)、抗低氧試驗(yàn)、耐高溫試 驗(yàn)。
[0014] 步驟（1)中所述的Gtl親本的雌雄比例為1. 5?2. 0:1。
[0015] 步驟（2)中所述的人工受精是用干毛巾擦拭雄性草魚的腹部和生殖孔，使用干凈 的注射器吸取精液，并低溫保存；用干毛巾擦拭雌性草魚的腹部和生殖孔，輕壓腹部，用干 燥的臉盆收集卵子；快速將需要建立的不同家系的精子、卵子混合，并用干燥的羽毛攪拌， 加入少量清水?dāng)嚢?，即可獲得不同家系的受精卵。
[0016] 步驟（2)中所述的激素為促黃體生成素釋放激素類似物和地歐酮；所述激素的 注射量為雌魚每kg體重注射促黃體生成素釋放激素類似物3 μ g，當(dāng)水溫偏低或性腺發(fā) 育較差時(shí)，每千克體重加3mg地歐酮；雄魚每kg體重注射促黃體生成素釋放激素類似物 1. 5 μ g，當(dāng)水溫偏低或性腺發(fā)育較差時(shí)，每千克體重加 I. 5mg地歐酮。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0018] 1、本發(fā)明的草魚選育及驗(yàn)證方法周期短，只需通過第一年篩選和第二年的驗(yàn)證即 可確定優(yōu)良品系，大大縮短了選育年限。
[0019] 2、本發(fā)明的草魚選育及驗(yàn)證方法簡單可靠，且可根據(jù)不同的養(yǎng)殖環(huán)境需要選育出 相應(yīng)抗性的優(yōu)良草魚品系。
[0020] 3、本發(fā)明的草魚選育及驗(yàn)證方法切實(shí)可行，不涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，社會認(rèn)同度高。 【【具體實(shí)施方式】】
[0021] 下面對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0022] 實(shí)施例1具有生長優(yōu)勢及抗嗜水氣單胞菌的草魚優(yōu)良品系的選育及效果驗(yàn)證
[0023] (1)收集600對珠江水系草魚，從中選出體型勻稱，活潑健康，體重高于平均體重 15?20%，并達(dá)到性成熟的雌雄草魚250對作為待選親本；使用PIT標(biāo)記（上海逐海儀 器設(shè)備有限公司，HPT8)對每條待選親本進(jìn)行編號，并剪取每條魚的胸鰭，使用12對微衛(wèi) 星（表1)對剪下來的胸鰭進(jìn)行STR分型，對分型結(jié)果用Cervus 3.0軟件分析這些待選親 本的遺傳多樣性（參見文獻(xiàn)，任昆等，草魚的微衛(wèi)星親權(quán)鑒定，南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013, 44(8): 1367-1371);選出100對有較高遺傳多樣性的作為親本，并標(biāo)記為Gp
[0024] 表1 12對用于草魚親子鑒定的多重PCR微衛(wèi)星序列
[0025]
【權(quán)利要求】
1. 一種分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，包括以下步驟： (1) 親本的選擇：選擇體型勻稱，活潑健康，體重高于平均體重15?20%，并達(dá)到性成 熟的草魚作為待選親本；使用PIT標(biāo)記對每條待選親本進(jìn)行編號，并剪取每條魚的胸鰭，用 12對微衛(wèi)星對剪下來的胸鰭進(jìn)行STR分型，對分型結(jié)果用Cervus 3. 0軟件分析這些待選親 本的遺傳多樣性；對遺傳多樣性較低的待選親本進(jìn)行舍去，有較高遺傳多樣性的作為親本， 并標(biāo)記為Gy所述G ^為待選親本中遺傳多樣性較高，用于后續(xù)選育實(shí)驗(yàn)的基本群體；所述 12對微衛(wèi)星序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 24所示； (2) 建立家系：G。親本性腺成熟后，一次人工注射激素進(jìn)行催熟，人工授精獲得受精卵； 每個家系的受精卵放入一個孵化桶，室溫下進(jìn)行孵化，孵化桶底部進(jìn)入流水，水從桶上面流 出；不同家系受精卵的卵膜破裂4天后，每家系隨機(jī)取500條混于相同大小池塘飼養(yǎng)，池塘 提前進(jìn)行消毒，提前一周使用畜糞培育生物餌料，飼養(yǎng)過程中隨時(shí)關(guān)注塘內(nèi)生物餌料的變 化情況，及時(shí)補(bǔ)充肥料；至夏花階段，同一家系魚苗平均分配到兩個或兩個以上池塘進(jìn)行1 齡種魚培育，并標(biāo)記為G1;所述G :為G ^第一年子代； (3) 優(yōu)良品系的篩選：同年12月對匕的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并挑選個體較大、活潑健康 的h進(jìn)行抗性試驗(yàn)，取存活下來種魚，并標(biāo)記為G ;取G:A的部分胸鰭，用無水乙醇保存，草 魚親子鑒定技術(shù)找出G:A相對應(yīng)的親本，并標(biāo)記為G/，匕中除去G A所剩下的群體標(biāo)記為 GiB，^中除去G /所剩下的群體標(biāo)記為GJ ;所述G:A為匕中具有生長優(yōu)勢且抗性試驗(yàn)存活 的群體； (4) 優(yōu)良品系的驗(yàn)證：第2年分別對G/、G#兩個群體進(jìn)行人工授精、建立家系、受精 卵孵化和1齡種魚培育（方法同步驟2)，分別標(biāo)記為glA和glB ;同年12月份分別對glA和 兩個群體的體長、體寬、體高和體重進(jìn)行測量，比較gA群體的生長優(yōu)勢；glA和glB各隨 機(jī)取1000尾種魚進(jìn)行抗性試驗(yàn)（方法同步驟3)，比較glA群體的抗性優(yōu)勢；所述的glA、 glB 分別為G/和G#兩群體親本第二年對應(yīng)的子后； (5) 優(yōu)良品系的確定：通過對待選親本的篩選和驗(yàn)證，G/群體中同時(shí)滿足下列兩個條 件的即可作為兼具生長優(yōu)勢、抗性的優(yōu)良品系：a.第一年子代與G#相比有生長優(yōu)勢和抗 性；b.第二年子代與glB相比兼具生長優(yōu)勢和抗性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，其特征 在于，所述的抗性試驗(yàn)為抗嗜水氣單胞菌攻毒試驗(yàn)、抗鹽試驗(yàn)、抗低氧試驗(yàn)、耐高溫試驗(yàn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，其特征 在于，步驟（1)中所述的心親本的雌雄比例為1.5?2.0:1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，其特征 在于，步驟（2)中所述的人工受精是用干毛巾擦拭雄性草魚的腹部和生殖孔，使用干凈的 注射器吸取精液，并低溫保存；用干毛巾擦拭雌性草魚的腹部和生殖孔，輕壓腹部，用干燥 的臉盆收集卵子；快速將需要建立的不同家系的精子、卵子混合，并用干燥的羽毛攪拌，加 入少量清水?dāng)嚢?，即可獲得不同家系的受精卵。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子輔助選育草魚優(yōu)良品系及選育效果驗(yàn)證的方法，其特征 在于，步驟（2)中所述的激素為促黃體生成素釋放激素類似物和地歐酮；所述激素的注射 量為雌魚每kg體重注射促黃體生成素釋放激素類似物3 y g，當(dāng)水溫偏低或性腺發(fā)育較差 時(shí)，每千克體重加3mg地歐酮；雄魚每kg體重注射促黃體生成素釋放激素類似物1. 5 y g， 當(dāng)水溫偏低或性腺發(fā)育較差時(shí)，每千克體重加1. 5mg地歐酮。
【文檔編號】A01K61/00GK104488759SQ201410667437
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】李家樂, 張猛, 沈玉幫, 傅建軍, 孫俊龍, 徐曉雁, 黨云飛 申請人:上海海洋大學(xué)