本發(fā)明涉及一種利用高寒植物培育大棚制備具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料的方法。

背景技術：
冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一種蟲生子囊真菌，寄生于鱗翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的幼蟲，其無性型為中國被毛孢HirsutellasinensisLiu，Guo，Yu&Zeng。冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的一個世代包括卵、幼蟲、蛹和成蟲四個發(fā)育階段，幼蟲營地下隧道式穴居生活，雜食性，喜食圓穗蓼、頭花蓼、小大黃和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根莖。冬蟲夏草分布于青藏高原高海拔區(qū)域，其生長范圍局限，產量也極為有限。它是青藏高原特色名貴滋補中藥材，具有重要的藥用和經濟價值。由于冬蟲夏草的形成過程中仍有許多關鍵問題尚不清楚，中國被毛孢侵染鉤蝠蛾昆蟲的侵染活性較弱，原生態(tài)冬蟲夏草道地藥材的產業(yè)化迄今仍存在許多障礙難題。冬蟲夏草所生長的青藏高原高海拔高寒生境，其主要地理環(huán)境特點是凍土期長、晝夜溫差大、日照強烈、氧氣含量低。冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾的食料高寒植物存在著有效生長期短、生長發(fā)育繁殖緩慢等問題。通過在青藏高原建造自動化控制或人工控制的高原大棚，已是現(xiàn)代化高原農業(yè)生產的重要手段，通過大棚技術可以有效增加高寒植物的生長期和有效積溫，顯著促進高寒植物的生長發(fā)育與繁殖，同時可節(jié)約大量的人力物力成本，有效提高生產力和生產效率。目前采用常規(guī)冬蟲夏草菌種侵染寄主鉤蝠蛾昆蟲幼蟲還存在侵染率低、耗費時間長等問題。中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102696555A)公開了一種半野生人工培殖冬蟲夏草的方法，中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102405763A)公開了一種冬蟲夏草的培育方法，上述2個專利申請均采用含有中國被毛孢的菌液連續(xù)噴灑寄主幼蟲體表的方 法進行接種侵染；中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102696392A)公開了天然冬蟲夏草的增產方法，其中采用誘集液誘集蝙蝠蛾幼蟲后，向幼蟲噴灑蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉兩種菌種液體種；中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102106235A)公開了一種全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法，其中采用一端直徑小于0.2mm的不銹鋼實心針或空心針的針狀器具，沾取中國被毛孢菌體和孢子混懸液刺傷寄主幼蟲的方法進行接種侵染；中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102792855A)公開了一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法，采用冬蟲夏草菌皮作為菌種材料灌注、或拌入飼料喂食、或注射、或噴淋侵染寄主幼蟲。但上述方法存在侵染活性低、或損傷后存活率低、或耗費時間過長、或菌種材料產量有限等問題，是制約原生態(tài)冬蟲夏草道地藥材產業(yè)化的關鍵問題之一。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種利用高寒植物培育大棚制備具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料的方法。該方法利用在青藏高原建立冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲食料植物的高寒植物苗培育大棚，通過構建冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與活體高寒植物組織的共生體，促進中國被毛孢與高寒植物組織共生，激活中國被毛孢的侵染活性，得到對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料，達到高效侵染寄主鉤蝠蛾幼蟲的目的。發(fā)明人在通過分子探針跟蹤檢測研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢在自然界中與其適生地中的多種高寒植物的根、莖、葉等組織存在共生現(xiàn)象。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，經高寒植物組織根、莖、葉等組織共生，共生后比未共生的中國被毛孢的侵染活性高數(shù)十至數(shù)百倍，基于這一原理發(fā)明本方法。本發(fā)明利用高寒植物培育大棚制備具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料的方法包括：在青藏高原環(huán)境下建立高寒植物培育大棚，利用大棚營造合適的溫濕度及光照條件，通過適合高原大棚的農業(yè)園藝栽培技術進行水肥管理，栽培并獲得冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲取食的高寒植物苗；將冬蟲夏草菌源接種到培育大棚栽培的高寒植物苗組織上，利用大棚營造適宜的溫濕度及光照條件，使冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與活體高寒植物共生培育，形成菌物-植物共生體，將菌絲檢測結果為中國被毛孢的菌物-植物共生體作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料。本發(fā)明的具體步驟包括：1.在海拔2800～5200米的青藏高原高寒草甸，保留原有高寒草甸植被或將草甸開墾平整，以長10～20m×寬7.5～15m大小為建設單位，用薄膜或陽光板或玻璃等透明材料搭建頂棚及四周可控開關的大棚，采用通常農業(yè)園藝規(guī)劃方法在大棚內進行分區(qū)建壟，壟面大小為50～90cm×450～1920cm，在壟面上方高30～100cm處鋪設水肥管理管路，壟間設立寬20～30cm深5～10cm的區(qū)域便于排水和管理人員行走，培育大棚四周留下約35～50cm的空區(qū)。2.應用適合高原大棚的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)天氣空氣濕度及土壤濕度條件每個月噴淋水一至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在25～35％左右，每1至2個月在一次噴水中按體積比100∶5～100∶20濃度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥，施放量為干重每平方米約150～250g。3.通過人工或自動化控制大棚四周及頂部透明材料的開關，同時通過調節(jié)棚外輔助層(遮陰網或保溫被)的開關以及噴霧裝置調節(jié)大棚內溫度，使棚內最高氣溫不超過22℃，空氣濕度為55～100％，利用原生態(tài)光照條件栽培大棚內保留的原有高寒植物苗，或是將冬蟲夏草適生地的鉤蝠蛾幼蟲食料高寒植物移栽入棚，或是將高寒植物種子播入大棚中栽培，或是將快速擴繁的高寒植物組培苗移栽入大棚中，并使之旺盛生長獲得高寒植物苗。4.從青海玉樹或西藏那曲等冬蟲夏草主產區(qū)或培育大棚附近的冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草或其子囊孢子，采用合適嗜低溫菌物的工業(yè)微生物方法進行分離純化，經分子生物學方法或形態(tài)學方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，通過常規(guī)低溫發(fā)酵法在13±5℃條件下發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并進一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子按發(fā)酵物質量與水體積比1∶100～1∶1000稀釋成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源；或直接采用冬蟲夏草的新鮮子囊孢子稀釋制成每毫升含有100～1000個子囊孢子的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源；5.選擇外界氣溫日間溫度不超過18℃，夜間溫度不低于4℃的月份時段，將制備的冬蟲夏草菌源噴淋接種到培育大棚栽培的高寒植物苗上，每平方米噴施100～300ml菌懸液，連續(xù)噴施2～5天，每天噴施1～3次，噴施后遮陰，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，溫度超過18℃時，通過噴霧 裝置噴水霧通風降溫，空氣濕度65～95％，共生培育7～30天，促進中國被毛孢與高寒植物組織共生。6.采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成共生體，經分子檢驗菌絲為中國被毛孢后，可直接作為具有高侵染活性的菌種材料；亦可是將獲得的共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于2～4℃，保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明方法獲得的具有高侵染活性的菌種材料可用于高效侵染鉤蝠蛾幼蟲。使用時，可直接冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲投置到冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，亦可將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料。在寄主鉤蝠蛾幼蟲取食接觸菌種材料3～15天后，采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體，經統(tǒng)計，鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為90.8～94.9％。本發(fā)明所述的采用合適嗜低溫菌物的工業(yè)微生物方法進行分離純化所用的分離培養(yǎng)基可以是察氏培養(yǎng)基、或馬鈴薯培養(yǎng)基、或肉湯培養(yǎng)基、或酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基、或高氏一號培養(yǎng)基中的一種。所述的通常發(fā)酵方法可以是固體發(fā)酵，或是液體發(fā)酵，或是固液雙相發(fā)酵。所述固體發(fā)酵可以是大麥、小麥、大米、玉米等常規(guī)農作谷物中的一種或多種作為固體培養(yǎng)基。所述液體發(fā)酵可以是普通肉湯、或蛋白胨水、或酵母提取物等常規(guī)底料中的一種或多種作為液體培養(yǎng)基。所述固液雙相發(fā)酵可采用深層發(fā)酵產生菌絲或芽生孢子后，在固體培養(yǎng)基上再繼續(xù)發(fā)酵的方法，其培養(yǎng)基可以是上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的各一種。本發(fā)明所述的高寒植物苗可以是大棚內原有高寒草甸植被，亦可是將采集的高寒植物和/或種子移栽在大棚內；所述高寒植物的種類包括柔軟點地梅(Androsacemollis)、東俄洛紫菀(Astertongolensis)、川滇苔草(Carexschneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青綠苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一歲苔草(C.heterostachya)、薩嘎苔草(C.sagaensis)、舌葉垂頭菊(Cremanthodiumlinguiatum)、裂葉藍鐘花(Cyananthuslobatus)、麗江藍鐘花(C.lichiangensis)、大萼藍鐘花(C.macrocalyx)、發(fā)草(Deschampsiacaespitosa)、錫金柳葉菜(Epilobiumsikkimense)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、線葉嵩 草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularianyingchiensis)、聶拉木厚棱芹(Pachypleurumnyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇馬先蒿(Pedicularislongifora)、昌都馬先蒿(P.sherriffii)、草甸馬先蒿(P.roylei)、西藏糙蘇(Phlomistibetica)、長果車前(Plantagoasiatica)、細莖蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圓穗蓼(P.macrophyllum)、狹葉圓穗蓼(P.macrophyllum)、頭花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichummoupinense)、楔葉委陵菜(Potentillacuneata)、纖細委陵菜(P.gracillima)、多頭委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、雜色鐘報春(Primulaalpicola)、高原毛茛(Ranunculustanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黃(Rheumtibeticum)、小大黃(R.pumilum)、尼泊爾酸模(Rumexnepalensis)、雙齒風毛菊(Saussurealavrenkoana)、禾葉風毛菊(S.graminea)、星狀鳳毛菊(S.stella)、卵葉風毛菊(S.ovatifolia)、鉤柱唐松草(Thalictrumuncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和長果婆婆娜(Veronicachayuensis)中的一種或多種。本發(fā)明所述的冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾包括曲線鉤蝠蛾T.fusconebulosa(DeGeer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐鉤蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白線鉤蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏鉤蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、蟲草鉤蝠蛾Thitarodesarmoricanus(Oberthür，1909)(Hepialus)、斜脈鉤蝠蛾T.oblifurcus(ChuetWang，1985)(Hepialus)、樟木鉤蝠蛾T.zhangmoensis(ChuetWang，1985)(Hepialus)、康姬鉤蝠蛾T.kangdingroides(ChuetWang，1985)(Hepialus)、康定鉤蝠蛾T.kangdingensis(ChuetWang，1985)(Hepialus)、德欽鉤蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白馬鉤蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里鉤蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、貢嘎鉤蝠蛾T.gonggaensis(FuetHuang，1991)(Hepialus)、人支鉤蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康鉤蝠蛾T.markamensis(Yangetal.，1992)(Hepialus)、草地鉤蝠蛾T.pratensis(Yangetal.，1992)(Hepialus)、銹色鉤蝠蛾T.ferrugineus(Yangetal.，1993)(Hepialus)、金沙鉤蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白紋鉤蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎鉤蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里鉤蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支鉤蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、葉日鉤蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美麗鉤蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘鉤蝠蛾T.litangensis(Liang，1995) (Hepialus)、循化鉤蝠蛾T.xunhuaensis(YangetYang，1995)(Hepialus)、白帶鉤蝠蛾T.cingulatus(YangetZhang，1995)(Hepialus)、巴青鉤蝠蛾T.baqingensis(YangetJiang，1995)(Hepialus)、當雄鉤蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉樹鉤蝠蛾T.yushuensis(Wangetal.，1995)(Hepialus)、寬兜鉤蝠蛾T.latitegumenus(Shenetal.，1997)(Hepialus)comb.n.、雙帶鉤蝠蛾T.bibelteus(Shenetal.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如鉤蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南鉤蝠蛾T.hainanensis(ChuetWang，2004)(Hepialus)comb.n.、納木鉤蝠蛾T.namensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀則鉤蝠蛾T.xigazeensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、永勝鉤蝠蛾T.yongshengensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、定結鉤蝠蛾T.dinggyeensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林鉤蝠蛾T.nanmlinensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、亞東鉤蝠蛾T.yadongensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏鉤蝠蛾T.pui(Zhangetal.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金鉤蝠蛾T.xiaojinensis(Tuetal.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉鉤蝠蛾T.sejilaensis(Zouetal.，2011)、加查鉤蝠蛾T.jiachaensis(Zouetal.，2011)中的一種或多種。具體實施方式實施例一1.在青藏高原海拔2800米的高山灌叢草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，以長20m×寬10m為一個單位建設培育大棚，將大棚范圍內原有草甸植被除去并將土壤平整，用農用薄膜材料搭建頂棚及四周可控開關的大棚，采用通常農業(yè)園藝規(guī)劃方法在大棚內進行分區(qū)建壟，建成8個90cm×1900cm的培育壟，在壟面上方高100cm處鋪設水肥管理管路，壟間挖開寬、深分別為30cm×8cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，大棚四周分別留下約50cm的工作區(qū)。2.應用適合高原的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)空氣及土壤濕度條件每個月噴淋水三至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在30％左右，每2個月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶5濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥，施放量為干重每平方米約250g。3.在冬蟲夏草適生地區(qū)域采集圓穗蓼(Polygonummacrophytum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、高山唐松草(Thactriunalpinun)、矮火絨草(Leontopodiumalpinum)、委 陵菜(Potentillaanserine)、黑褐苔草(Carexatrofusca)等植物的種子收集后撒入培育大棚內，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部透明材料的開關，同時通過調節(jié)棚外輔助層(遮陰網或保溫被)的開關以及噴霧裝置調節(jié)大棚內溫度，使棚內最高氣溫不超過22℃，空氣濕度在55～100％；利用原生態(tài)光照條件栽培大棚內的高寒植物苗，并使之旺盛生長獲得高寒植物苗。4.從青海玉樹地區(qū)冬蟲夏草主產區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)察氏培養(yǎng)基分離純化菌種，經分子生物學方法或形態(tài)學方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，經通常蛋白胨水液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，最后按發(fā)酵液與水體積比1∶100進一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。5.每年9～11月，選擇日間溫度不超過18℃，夜間溫度不低于4℃的時段，將制備的冬蟲夏草菌源，利用噴淋管路或加壓噴槍均勻噴淋接種到培育大棚高寒植物苗上，每平方米噴入100ml菌懸液，連續(xù)噴施5天，每天黃昏時噴施1次，噴完后用黑色遮陰網蓋在大棚頂部及四周，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，濕度65～95％；溫度達到18℃時，通過噴霧裝置噴水霧通風降溫，遮陰共生培育7天后，采用顯微鏡檢查冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成共生體，經分子檢驗菌絲為中國被毛孢后，將獲得的共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于4℃，保存?zhèn)溆谩?.將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，每頭幼蟲投放5～10克，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為92.7％。實施例二1.在青藏高原海拔4000米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被，以長10m×7.5m為一個單位建設培育大棚，用陽光板 材料搭建頂棚及四周可控開關的大棚，培育大棚內規(guī)劃建設成6個90cm×920cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個壟中間高30cm處鋪設一條噴淋管及配套水泵設施，壟間挖開寬、深分別約為25cm×5cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，大棚四周分別留下約40cm的工作區(qū)。2.應用適合高原的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)空氣及土壤濕度情況，每個月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在33％左右，每2個月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶20濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約150g。3.在培育大棚附近冬蟲夏草適生地區(qū)域采集珠芽蓼(Polygonumviviparum)、大萼委陵菜(Potentillaconferta)、雜色鐘報春(Primulaalpicola)、大萼藍鐘花(Cyananthusmacrocalyx)、舌葉垂頭菊(Cremanthodiumlinguiatum)、錫金柳葉菜(Epilobiumsikkimense)等植物苗及種子移栽至培育大棚內，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部透明材料的開關，同時通過調節(jié)棚外輔助層(遮陰網或保溫被)的開關以及噴霧裝置調節(jié)大棚內溫度，使棚內最高氣溫不超過20℃，空氣濕度在55～100％；利用原生態(tài)光照條件栽培大棚內的原有植被及移栽高寒植物苗，并使之旺盛生長。4.從培育大棚附近冬蟲夏草產區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)馬鈴薯培養(yǎng)基分離純化菌種，經分子生物學方法及形態(tài)學方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進一步經大麥固態(tài)培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，將發(fā)酵獲得的菌團用攪拌器均勻打碎，并按發(fā)酵物質量與水體積比1∶400進一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑2mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源。5.每年6～11月，選擇日間溫度不超過18℃，夜間溫度不低于4℃的時段，將制備的冬蟲夏草菌源利用灌溉管路或加壓噴槍均勻噴淋接種到培育大棚高寒植物苗上，每平方米噴入200ml菌懸液，連續(xù)噴施2天，每天3次，分早中晚噴施，噴施后用黑色遮陰網蓋在大棚頂部及四周，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，濕度65％～95％；溫度達到18℃時，通過遮陰網和噴霧裝置噴水霧通風降溫，遮陰共生培育15天后，采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經分 子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為具有高侵染活性的菌種材料。6.每年8～10月，選擇白天溫度不超過18℃，夜間溫度不低于0℃的時段，寄主蒲氏鉤蝠蛾(Thitarodespui)幼蟲在黃昏時段投置到冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，每平方米約控釋50頭，使蒲氏鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，14天后將蒲氏鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，蒲氏鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為93.6％。實施例三1.在青藏高原海拔4300米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被；以20m×10m為一個單位建設培育大棚，用陽光板材料搭建頂棚及四周可控開關的大棚；培育大棚內規(guī)劃建設成19個75cm×920cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個壟上方高50cm處鋪設一條噴淋管及配套水泵設施，用于噴施水肥管理；壟間挖開寬、深分別為27cm×10cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，大棚四周分別留下約45cm的工作區(qū)。2.應用適合高原的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)空氣及土壤濕度情況，每月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在25％，每2個月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶15濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥，施放量為干重每平方米約175g。3.通過人工或自動化控制大棚四周及頂部陽光板的開關，同時通過調節(jié)棚外輔助層(遮陰網或保溫被)的開關以及噴霧裝置調節(jié)大棚內溫度，使棚內最高氣溫不超過19℃，空氣濕度在55～100％；利用原生態(tài)光照條件促進培育大棚內原有的珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾葉風毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)等植物旺盛生長。4.在每年的6～8月在培育大棚附近的冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成菌懸液，通過顯微鏡計數(shù)使每毫升懸浮液中含有100個子囊孢子，作為 冬蟲夏草菌源。5.每年6～8月，選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于4℃的時段，將制備的冬蟲夏草菌源，利用灌溉管路或加壓噴槍均勻噴淋接種到培育大棚高寒植物苗上，每平方米噴入300ml菌懸液，連續(xù)噴施3天，每天2次，分早中晚噴施，噴施后用黑色遮陰網蓋在大棚頂部及四周，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部陽光板的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，濕度65～95％；溫度達到18℃時，通過遮陰網和噴霧裝置噴水霧通風降溫，遮陰共生培育20天后，采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經分子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為具有高侵染活性的菌種材料。6.每年8～9月，選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于0℃的時段，在黃昏時段寄主蟲草鉤蝠蛾(Thitarodesarmoricanus)幼蟲投置到冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，每平方米約控釋100頭，使蟲草鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，15天后將蟲草鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測蟲草鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，蟲草鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為90.8％。實施例四1.在青藏高原海拔3800米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，將原有草甸植被除去并平整，以長20m×寬15m為一個單位建設培育大棚，用玻璃材料搭建頂棚及四周可控開關的大棚，培育大棚內規(guī)劃建設成19個75cm×1920cm的壟區(qū)，在每個壟中間高80cm處鋪設一條噴淋管及配套水泵設施，壟間挖開寬、深分別為27.5cm×10cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周分別留下約40cm的工作區(qū)。2.應用適合高原的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)空氣及土壤濕度情況，每月噴淋水二至五次，每年5月至10月視當月降水量情況每個月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在35％左右，每2個月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶10濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約160g。3.在冬蟲夏草適生地區(qū)域采集細莖蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圓穗蓼(P.macrophyllum)、狹葉圓穗蓼(P.macrophyllum)、頭花蓼(P.capitatum)、西藏大黃(Rheumtibeticum)、小大黃(R.pumilum)植株或種子，經常規(guī)組織培養(yǎng)快速繁殖技術獲得組培苗，每年6月將組培苗移栽至大棚內培植，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部玻璃的開關，同時通過調節(jié)棚外輔助層(遮陰網或保溫被)的開關以及噴霧裝置調節(jié)大棚內溫度，使棚內最高氣溫不超過18℃，空氣濕度在55～100％；利用原生態(tài)光照條件栽培大棚內的原有植被及移栽高寒植物苗，并使之旺盛生長。4.在每年的6～8月在培育大棚附近的冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成懸浮液，通過顯微鏡計數(shù)使每毫升懸浮液中含有1000個子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。5.每年7～9月，選擇日間溫度不超過18℃，夜間溫度不低于4℃的時段，將制備的冬蟲夏草菌源，噴淋接種到高寒植物苗上，每平方米噴淋150ml，連續(xù)噴施5天，每天1次，中午噴施，噴施后用黑色遮陰網蓋在噴淋管路上面，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部陽光板的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，濕度65～95％；溫度達到18℃時，通過遮陰網和噴霧裝置噴水霧通風降溫，遮陰共生培育30天后，促進中國被毛孢與高寒植物組織共生，激活冬蟲夏草菌的侵染活性；采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢菌絲與高寒植物組培組織纏繞形成大量共生體，經分子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料。6.每年8～9月，選擇黃昏時段寄主色季拉鉤蝠蛾(Thitarodessejilaensis)幼蟲投置到冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，每平方米約控釋100頭，使色季拉鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，12天后將色季拉鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測色季拉鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，色季拉鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為91.4％。實施例五1.在青藏高原海拔5200米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被，以15m×10m為一個建設單位，用透明塑料板材料搭建頂棚及四周可控開關的大棚，培育大棚內規(guī)劃建設2排50cm×450cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個壟中間高80cm處鋪設一條噴淋管及配套水泵設施，壟間挖開寬、深分別為20cm×5cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走。培育大棚四周及排間分別留下約35cm的工作區(qū)。2.應用適合高原的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)空氣及土壤濕度情況，每個月噴淋水一至六次，使15cm深度的土壤含水量保持在30％左右，每月在第一次噴水中加入水：尿體積比為100∶13濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約200g。3.采集培育大棚附近的圓穗蓼(Polygonummacrophytum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、高山唐松草(Thactriunalpinun)、矮火絨草(Leontopodiumalpinum)、委陵菜(Potentillaanserine)、高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、黑褐苔草(Carexatrofusca)等植物的種子收集后撒入培育大棚的壟內，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部透明塑料的開關，同時通過調節(jié)棚外輔助層(遮陰網或保溫被)的開關以及噴霧裝置調節(jié)大棚內溫度，使棚內最高氣溫不超過16℃，空氣濕度在55～100％；利用原生態(tài)光照條件栽培大棚內的原有植被及移栽高寒植物苗，并使之旺盛生長。4.從青海玉樹地區(qū)的冬蟲夏草主產區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)肉湯培養(yǎng)基分離純化菌種，經分子生物學方法或形態(tài)學方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進一步經通常普通肉湯液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵7天，然后置于小麥為底物的固體培養(yǎng)基上再繼續(xù)發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得菌團用攪拌器均勻打碎，按發(fā)酵物重量與水體積比1∶1000進一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑1.5mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源；5.每年7～9月，選擇日間溫度不超過18℃，夜間溫度不低于4℃，將制備的冬蟲夏草菌源利用灌溉管路均勻噴淋接種到培育大棚高寒植物苗上，每平方米噴入250ml菌懸液，噴完后用黑色遮陰網蓋在噴淋管路上面，連續(xù)噴施4天，每天噴施2次，早晚各一次，噴施后用黑色遮陰網蓋在大棚頂部及四周，通過人工或自動化控制大棚 四周及頂部的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，濕度65～95％；溫度達到18℃時，通過噴霧裝置噴水霧通風降溫，遮陰共生培育14天后，經顯微鏡及分子鑒定檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體；經分子檢驗菌絲為中國被毛孢后，將共生體地上部分割回，將共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于2℃，保存?zhèn)溆茫?.將制備的高侵染活性菌種材料在黃昏時段投喂冬蟲夏草寄主比如鉤蝠蛾(Thitarodesbiruens)幼蟲，每頭投入5g高侵染活性菌種材料，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種，7天后將比如鉤蝠蛾幼蟲從飼養(yǎng)盒中取出，采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測比如鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，比如鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為94.9％。實施例六(反向例)1.在青藏高原海拔2800米的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，以10m×20m為一個單位建設培育大棚，將培育大棚內原有草甸植被除去并將土壤平整，在培育大棚內規(guī)劃建設成8個90cm×1900cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個壟中間高75cm處鋪設一條噴淋管及配套水泵設施，壟間挖開寬、深分別為30cm×8cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植大棚四周分別留下約50cm的工作區(qū)。2.應用適合高原的農業(yè)園藝栽培技術對高寒植物苗進行水肥管理，根據(jù)空氣及土壤濕度情況，每個月噴淋水一至四次，使土壤15cm深處的含水量保持在33％左右，每2個月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶15濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約210g。3.采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一歲苔草(Carexheterostachya)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾葉風毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)等植物及種子移栽至培育大棚中，通過人工或自動化控制大棚四周及頂部的開關以調節(jié)大棚內溫度在13±5℃，溫度達到18℃時，空氣濕度在55～100％，通過噴霧裝置噴水霧通風降溫，并使之旺盛生長獲得高寒植 物苗。4.從青海玉樹地區(qū)冬蟲夏草主產區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)察氏培養(yǎng)基分離純化菌種，經分子生物學方法或形態(tài)學方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，經通常蛋白胨水液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，最后按發(fā)酵液與水體積比1∶100進一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。5.將獲得的高寒植物苗地上及地下部分組織切成5～20mm小段作為鉤蝠蛾幼蟲的飼料，同時將冬蟲夏草菌源噴淋到高寒植物飼料表面或噴淋到替代飼料如胡蘿卜表面，直接投喂冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，每頭幼蟲投放5～10克，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率只有23.4％。實施例七(反向例)1.從西藏那曲冬蟲夏草產區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)馬鈴薯培養(yǎng)基分離純化菌種，經分子生物學方法及形態(tài)學方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進一步經通常的大麥固態(tài)培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，并按發(fā)酵物重量與水體積比1∶100進一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑2mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源。2.將制備的冬蟲夏草菌源直接噴淋到冬蟲夏草寄主比如鉤蝠蛾Thitarodesbiruens幼蟲，使寄主幼蟲充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，中國被毛孢侵染比如鉤蝠蛾幼蟲的侵染率只有18.7％。實施例八(反向例)1.在每年的6～8月在青海玉樹的冬蟲夏草產區(qū)采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成懸浮液，通過顯微鏡計數(shù)使每毫升懸浮液中含有1000個子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。2.將冬蟲夏草菌源直接噴淋到冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，使寄主幼蟲充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經統(tǒng)計，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。