一種豬精液的冷凍和解凍方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬精液的冷凍和解凍方法，包含以下步驟：①采集優(yōu)秀的種公豬精液，經(jīng)精液檢測后，按比例的稀釋，然后平衡0.5-1h；②將精液移入15℃條件下降溫平衡3h；③在15℃條件下離心(800g，10min)，加入無甘油的I液，緩慢降到5℃，平衡2h，再加入含甘油的II液，然后分裝；④進行冷凍程序后投入液氮保存；⑤與冷凍時原理相反進行解凍；⑥對解凍后的精液品質進行檢測。本發(fā)明可以使精液得到長期保存，有效提高了公豬的利用率，降低活體保種的成本，防止優(yōu)良基因的漂變和傳染病的發(fā)生，利于深入開展豬的聯(lián)合育種工作，獲得更大的遺傳進展，在保護地方優(yōu)良品種與加快品種改良等方面具有重要的研究價值和廣泛的應用前景。
【專利說明】 一種豬精液的冷凍和解凍方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于豬精液的冷凍保存【技術領域】，具體地說，涉及一種豬精液的冷凍和解凍方法。

【背景技術】
[0002]豬的人工授精(artificial inseminat1n, Al)技術，即利用人工方法采取公豬的精液，對其進行品質檢查、稀釋保存等處理，再用器械將精液輸送到發(fā)情母豬生殖器官內，使其受孕。人工授精可提高公豬的配種效能，與本交相比，人工授精時一頭優(yōu)秀種公豬每年配種的母豬可提高10?20倍。由于良種公豬利用率的提高，加速了品種改良，可給養(yǎng)豬生產(chǎn)和豬的育種帶來巨大的效益；減少公豬的飼養(yǎng)量，節(jié)省了飼養(yǎng)管理費用；可克服自然交配的難點，如公、母豬體格相差太大和某些生殖道異常等困難；可擴大優(yōu)秀公豬在時間和地域上的利用率，為優(yōu)秀種豬精液的交流提供了方便；此外，人工授精還可以有效防止公、母豬多種疫病接觸傳染的可能。正是由于人工授精在養(yǎng)豬生產(chǎn)中具有很多優(yōu)越性，使得這一技術在許多養(yǎng)豬發(fā)達國家得到大力推廣。然而，國內外在豬的人工授精中所用的精液多為常溫(15?20°C )液態(tài)保存精液，配種時的精子活力較高(0.6?0.8)、配種母豬的受胎率較高(75%?85% )，但液態(tài)精液一是不能長期保存(保存期一般在3?5天)，二是不便于遠距離運輸，因此，無法充分發(fā)揮優(yōu)秀種公豬尤其是頂級種公豬的種用價值。
[0003]近年來，豬人工授精的研究重點逐漸轉移到冷凍精液上。豬冷凍精液技術是指利用干冰(_79°C )、液氮(-196°C )等作冷卻源，將精液特殊處理后冷凍，保存在超低溫(_79°C或_196°C )的狀態(tài)下，達到長期保存的目的，并且解凍后輸精達到較高受胎率的技術。中國是世界上第一養(yǎng)豬和豬肉生產(chǎn)大國，近幾年來，每年生豬存欄4.5?4.7億頭，其中，能繁母豬存欄0.48?0.51億頭，生豬出欄6.5?7.1億頭，豬肉總產(chǎn)4800?5400萬噸，約占世界養(yǎng)豬總產(chǎn)的一半；尤其是近年來，我國的養(yǎng)豬業(yè)正在從傳統(tǒng)粗放散養(yǎng)方式向規(guī)?；s化飼養(yǎng)方式的轉型，長白、大白、杜洛克等快長瘦肉型引進豬種已經(jīng)成為規(guī)?；i場飼養(yǎng)的主流品種，以常溫液態(tài)保存精液技術為主導的豬人工授精技術已經(jīng)被大面積的推廣和應用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中。但在我國的養(yǎng)豬生產(chǎn)中，對于冷凍精液的研究與應用所開展的工作還很欠缺，因此，深入開展此項技術的研究與應用，不僅對于進一步發(fā)揮人工授精技術的優(yōu)勢具有重要意義，而且對于開展種豬的遺傳改良以及針對一些瀕危特有地方豬種資源的保存等方面也具有十分重要的戰(zhàn)略意義。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對上述技術，提供一種可有效提高豬精液冷凍保存的質量和效果的豬精液的冷凍和解凍方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0006]一種豬精液的冷凍和解凍方法，包含以下步驟:
[0007](一 )、豬精液的冷凍過程:
[0008]①首先采集優(yōu)秀的種公豬精液，用精子密度儀測出其內部精子密度，然后在37-40°C的溫度下用稀釋劑稀釋該精液，使其最終活精子數(shù)與整體公豬精液的比例為
0.51: 1，稀釋后將該精液在17-20°C的室溫環(huán)境下平衡0.5-lh。
[0009]②將上述①中的精液移入15°C的環(huán)境下降溫，平衡3h。
[0010]③取上述②中的精液800g，使其在15°C的環(huán)境下離心lOmin，先加入無甘油的稀釋液I，然后溫度緩慢降至5°C，平衡2h后，再加入含甘油的稀釋液II，然后用細管進行分裝。
[0011]④取上述③中分裝好的精液開始進行冷凍過程:
[0012]精液所處環(huán)境，初始溫度為5°C，以:3°C /min的速率從5°C降到_5°C，再于_5°C條件下保持Imin結晶，然后以50°C /min的速率從_5°C降到_140°C，最后將精液放入廣口液氮罐內與液氮面距離5cm處，熏蒸20min，再投入液氮保存。
[0013]( 二)、豬精液的解凍過程:迅速取出于液氮中保存的冷凍的豬精液，與冷凍原理相反，溫度以50°C /min的速率從_140°C升至_5°C，再以3°C /min的速率從_5°C升至5°C，解凍即可。
[0014](三)、豬精液的檢測:取解凍后的豬精液，通過電子生物顯微鏡和計數(shù)板對其精子活力、畸形率、有效精子數(shù)進行檢測。
[0015]優(yōu)選地,所述精液采用5mL大型細管Max1-straw進行冷凍解凍。
[0016]優(yōu)選地，所述豬精液冷凍過程①中所述的稀釋劑配方為D-葡萄糖37.15g、檸檬酸三鈉6.0Og, EDTA鈉鹽1.25g、碳酸氫鈉1.25g、氯化鉀0.75g、青霉素鈉0.60g、硫酸鏈霉素
1.0Og或D-葡萄糖60.0Og、檸檬酸三鈉3.70g、EDTA鈉鹽3.70g、碳酸氫鈉1.20g、青霉素鈉50萬單位、硫酸鏈霉素0.50g。
[0017]優(yōu)選地，所述豬精液冷凍過程③中所述的稀釋液I和稀釋液II的配方為:D_葡萄糖11.5g、檸檬酸三鈉11.65g、EDTA鈉鹽2.35g、磷酸二氫鉀1.75g、氰化鉀0.75g、硫酸鏈霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Typell) 1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris) 5.5g、朽1檬酸4.lg、半盤氨酸0.07g、0EP (氨基-鈉十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS (十二烷基硫酸鈉)0.3g、PGF2a 0.5g、維生素E 0.5g、GSH (谷胱甘肽)0.5g、透明質酸0.3g、N-乙?；?D-氨基葡糖0.5g。
[0018]經(jīng)實驗數(shù)據(jù)顯示，采用本發(fā)明所提供的方法冷凍解凍豬精子后，精子在冷凍、解凍后的活力達到0.5以上，畸形等異常精子率低于20%，發(fā)情母豬的配種受胎率達到65%以上，平均每頭母豬正常產(chǎn)仔數(shù)為9頭，達到了生產(chǎn)應用的技術水平。經(jīng)生產(chǎn)實踐顯示，該豬精液的冷凍和解凍方法可以使精液得到長期保存，使精液的使用不受時間和地域的限制，不受該公豬死亡、損失、采精間隔或繁殖不育的限制，有效提高了公豬的利用率，充分發(fā)揮優(yōu)良公豬的作用，降低活體保種的成本，防止優(yōu)良基因的漂變和傳染病的發(fā)生，利于深入開展豬的聯(lián)合育種工作，獲得更大的遺傳進展，在保護地方優(yōu)良品種與加快品種改良等方面具有重要的研究價值和廣泛的應用前景。

【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例，對本發(fā)明做進一步詳細的闡述，但本發(fā)明的實施方法并不局限于實施例所表示的范圍，該實施例僅限于說明本發(fā)明，而并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0020]一種豬精液的冷凍和解凍方法，包含以下步驟:
[0021](一 )、豬精液的冷凍過程:
[0022]①首先采集優(yōu)秀的種公豬精液，用精子密度儀測出其內部精子密度，然后在37-40°C的溫度下用稀釋劑稀釋該精液，使其最終活精子數(shù)與整體公豬精液的比例為0.51: 1，稀釋后將該精液在17-20°C的室溫環(huán)境下平衡0.5-lh。
[0023]②將上述①中的精液移入15°C的環(huán)境下降溫，平衡3h。
[0024]③取上述②中的精液800g，使其在15°C的環(huán)境下離心lOmin，先加入無甘油的稀釋液I，然后溫度緩慢降至5°C，平衡2h后，再加入含甘油的稀釋液II，然后用細管進行分裝。
[0025]④取上述③中分裝好的精液開始進行冷凍過程:
[0026]精液所處環(huán)境，初始溫度為5°C，以:3°C /min的速率從5°C降到_5°C，再于_5°C條件下保持Imin結晶，然后以50°C /min的速率從_5°C降到_140°C，最后將精液放入廣口液氮罐內與液氮面距離5cm處，熏蒸20min，再投入液氮保存。
[0027]( 二)、豬精液的解凍過程:迅速取出于液氮中保存的冷凍的豬精液，與冷凍原理相反，溫度以50°C /min的速率從_140°C升至_5°C，再以3°C /min的速率從_5°C升至5°C，解凍即可。
[0028](三)、豬精液的檢測:取解凍后的豬精液，通過電子生物顯微鏡和計數(shù)板對其精子活力、畸形率、有效精子數(shù)進行檢測。
[0029]進一步地,所述精液采用5mL大型細管Max1-straw進行冷凍解凍。
[0030]進一步地，所述豬精液冷凍過程①中所述的稀釋劑配方為D-葡萄糖37.15g、檸檬酸三鈉6.0Og、EDTA鈉鹽1.25g、碳酸氫鈉1.25g、氯化鉀0.75g、青霉素鈉0.60g、硫酸鏈霉素1.0Og或D-葡萄糖60.0Og、檸檬酸三鈉3.70g、EDTA鈉鹽3.70g、碳酸氫鈉1.20g、青霉素鈉50萬單位、硫酸鏈霉素0.50g。
[0031]進一步地，所述豬精液冷凍過程③中所述的稀釋液I和稀釋液II的配方為:D_葡萄糖11.5g、檸檬酸三鈉11.65g、EDTA鈉鹽2.35g、磷酸二氫鉀1.75g、氰化鉀0.75g、硫酸鏈霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Typell) 1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris) 5.5g、朽1檬酸4.lg、半盤氨酸0.07g、OEP (氨基-鈉十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS (十二烷基硫酸鈉)0.3g、PGF2a0.5g、維生素E 0.5g、GSH (谷胱甘肽)0.5g、透明質酸0.3g、N-乙?；?D-氨基葡糖0.5g。
[0032]豬精液稀釋后降溫的過程是精子代謝減少的適應過程，需要數(shù)小時的冷凍平衡時間，但過慢的冷卻速度會使溶液的電解逐漸增高，導致精細胞膜脂蛋白復合體破壞和膜分解，當細胞膜脫水收縮達到臨界最小體積時，細胞膜的滲透性產(chǎn)生不可逆的損傷，原來不能透過膜的溶質變成可滲透性的，進而造成細胞損傷或死亡，本發(fā)明在實際操作中得出冷凍時間以2.5?4.0h為宜，配好的稀釋液在4°C下停放過夜，可以達到更好的稀釋冷凍效果。
[0033]冷凍過程中的精子細胞不但要對保存狀態(tài)的低溫有耐受能力，而且要能經(jīng)受從射精時機體溫度到保存時的超低溫度的變化而不過度降低活力，后者比前者更顯得重要。每種細胞都有它理想的冷凍與解凍速率要求，冷凍速率太慢時，要保存的細胞易受高濃度溶解液的影響而死亡或遭到破壞(稱溶解液效應)；冷凍速率過快時，細胞內液體易導致結冰現(xiàn)象。本發(fā)明在豬精液冷凍過程中，從5°C降到_5°C時，降溫速率為3°C /min，該速率不會對精子的漿膜導致很大的破壞，從_5°C降到_140°C，降溫速率采用50°C /min，該條件下精子可以快速通過危險溫區(qū)(O?_60°C )，提高了凍精解凍后的存活率。
[0034]本發(fā)明豬精液解凍時的原理恰好與冷凍相反，理論上講，冷凍/冷卻速率快的情況下，解凍速率也相應加快，其程度視不同類型細胞而略有差異。快速解凍相較慢速解凍對精子活力的恢復有利，精子與濃縮溶液及低溫保護劑接觸的時間較短，細胞內外能較快地達到平衡而使精子的活力得以恢復。
[0035]本發(fā)明造價低廉、易推廣，且解凍方法簡單易行，更易進行人工授精，適合規(guī)?；a(chǎn)。
[0036]對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業(yè)技術人員能夠實現(xiàn)或使用本發(fā)明，對實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
【權利要求】
1.一種豬精液的冷凍和解凍方法，包含以下步驟: (一)、豬精液的冷凍過程: ①首先采集優(yōu)秀的種公豬精液，用精子密度儀測出其內部精子密度，然后在37-40°C的溫度下用稀釋劑稀釋該精液，使其最終活精子數(shù)與整體公豬精液的比例為0.51: 1，稀釋后將該精液在17-20°C的室溫環(huán)境下平衡0.5-lh。 ②將上述①中的精液移入15°C的環(huán)境下降溫，平衡3h。 ③取上述②中的精液800g，使其在15°C的環(huán)境下離心lOmin，先加入無甘油的稀釋液I，然后溫度緩慢降至5°C，平衡2h后，再加入含甘油的稀釋液II，然后用細管進行分裝。 ④取上述③中分裝好的精液開始進行冷凍過程: 精液所處環(huán)境，初始溫度為5°C，以3°C /min的速率從5°C降到_5°C，再于_5°C條件下保持Imin結晶，然后以50°C /min的速率從_5°C降到_140°C，最后將精液放入廣口液氮罐內與液氮面距離5cm處，熏蒸20min，再投入液氮保存。 (二)、豬精液的解凍過程:迅速取出于液氮中保存的冷凍的豬精液，與冷凍原理相反，溫度以50°C /min的速率從_140°C升至_5°C，再以3°C /min的速率從_5°C升至5°C，解凍即可。 (三)、豬精液的檢測:取解凍后的豬精液，通過電子生物顯微鏡和計數(shù)板對其精子活力、畸形率、有效精子數(shù)進行檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述精液采用5mL大型細管Max1-straw進行冷凍解凍。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述豬精液冷凍過程①中所述的稀釋劑配方為D-葡萄糖37.15g、檸檬酸三鈉6.00g、EDTA鈉鹽1.25g、碳酸氫鈉1.25g、氯化鉀0.75g、青霉素鈉0.60g、硫酸鏈霉素1.0Og或D-葡萄糖60.00g、檸檬酸三鈉3.70g、EDTA鈉鹽3.70g、碳酸氫鈉1.20g、青霉素鈉50萬單位、硫酸鏈霉素0.50g。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述豬精液冷凍過程③中所述的稀釋液I和稀釋液II的配方為:D-葡萄糖11.5g、檸檬酸三鈉11.65g、EDTA鈉鹽2.35g、磷酸二氫鉀1.75g、氰化鉀0.75g、硫酸鏈霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Typell) 1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris) 5.5g、朽1檬酸4.lg、半盤氨酸0.07g、0EP (氨基-鈉十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS (十二烷基硫酸鈉)0.3g、PGF2a 0.5g、維生素E 0.5g、GSH (谷胱甘肽)0.5g、透明質酸0.3g、N-乙?；?D-氨基葡糖0.5g。
【文檔編號】A01N1/02GK104322484SQ201410529107
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權日:2014年10月10日
【發(fā)明者】吳衍嶺, 陳憲彬, 劉晶, 喬富興, 彭興泉, 楊軍峰, 袁震 申請人:山東鑫基牧業(yè)有限公司