復(fù)合生物肥及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合生物肥及其制備方法，涉及一種新型的生物肥及其生產(chǎn)。一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物10-25份、解磷巨大芽抱桿菌3-8份、枯草芽孢桿菌菌劑5-25份，植物乳桿菌CGMCC NO.940510-25，聚谷氨酸3-5。所述聚谷氨酸為γ-聚谷氨酸。使用本品可提高糧食產(chǎn)量20-40％，提高蔬菜產(chǎn)量20-40％，還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風(fēng)味。
CGMCC NO.9405
2014.07.02
【專(zhuān)利說(shuō)明】復(fù)合生物肥及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)中的肥料，涉及一種新型的生物肥及其生產(chǎn)。

【背景技術(shù)】
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[0002]生物肥料從最初的根瘤菌劑到細(xì)菌肥料，再到今天的生物肥料，從名稱(chēng)上的演變已說(shuō)明我國(guó)生物肥料逐步發(fā)展的過(guò)程。目前國(guó)際上已有70多個(gè)國(guó)家生產(chǎn)、應(yīng)用和推廣生物肥料，我國(guó)目前也有500家左右企業(yè)年產(chǎn)約數(shù)百萬(wàn)噸生物肥料應(yīng)用于生產(chǎn)。這雖與同期化肥產(chǎn)量和用量不能相比，但的確已開(kāi)始在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用，取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
[0003]生物肥料是指一類(lèi)含有大量活的微生物的特殊肥料。這類(lèi)肥料施入土壤中，大量活的微生物在適宜條件下能夠積極活動(dòng):有的可在作物根的周?chē)罅糠敝常l(fā)揮自生固氮或聯(lián)合固氮作用；有的還可分解磷、鉀礦質(zhì)元素供給作物吸收或分泌生長(zhǎng)激素刺激作物生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，生物肥料不是直接供給作物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而是通過(guò)大量活的微生物在土壤中的積極活動(dòng)來(lái)提供作物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或產(chǎn)生激素來(lái)刺激作物生長(zhǎng)，這與其它有機(jī)肥和化肥的作用在本質(zhì)上是不同的。
[0004]物肥料的種類(lèi)很多，現(xiàn)在推廣應(yīng)用的主要有根瘤菌類(lèi)肥料、固氮菌類(lèi)肥料、解磷解鉀菌類(lèi)肥料、抗生菌類(lèi)肥料和真菌類(lèi)肥料等等。這些生物肥料有的是含單一有效菌的制品，也有的是將固氮菌、解磷解鉀菌復(fù)混制成的復(fù)合型制品，市場(chǎng)上除了根瘤菌類(lèi)等少數(shù)肥料制品是含單一的有效菌外，大多數(shù)制品都是復(fù)合型的生物肥料。各種固氮菌肥料，可以增加土壤中的氮素來(lái)源，解磷解鉀菌肥料可以將土壤中難溶性的磷、鉀溶解出來(lái)，增加土壤中磷(P)、鉀(K)元素的來(lái)源。另外，生物肥料還能促進(jìn)作物的生長(zhǎng)，改善農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。各種生物肥施入土壤中，都能產(chǎn)生不同的生長(zhǎng)激素，刺激作物的生長(zhǎng)，如“5406”放線菌生物肥，不但有拮抗病原菌防病壯菌的作用，還能分泌細(xì)胞分裂素促進(jìn)作物的生長(zhǎng)。真菌類(lèi)的生物肥不僅在協(xié)助作物吸收磷、鋅及銅等礦質(zhì)元素方面有很強(qiáng)的作用，還有增強(qiáng)作物的吸水、保水以提高作物抗旱能力的作用。由于生物肥料能制造和協(xié)助作物吸收利用多種營(yíng)養(yǎng)元素，因此對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)有很大的改善，可以改變因施化肥產(chǎn)生的“瓜不香，果不甜，茶無(wú)味”的現(xiàn)狀，使農(nóng)產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到綠色食品的標(biāo)準(zhǔn)。
[0005]一種好的生物肥料在有效活菌數(shù)、含水量、PH值、吸附劑顆粒細(xì)度、有機(jī)質(zhì)含量、雜菌率以及有效保存期等方面都有嚴(yán)格的要求。根據(jù)我國(guó)NY227 - 94農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，液體生物肥料每毫升應(yīng)含5億?15億個(gè)活的有效菌。固體生物肥每克含活的有效菌為I億?3億個(gè)，含水量20 %?35 %為宜，吸附劑細(xì)度在0.18毫米左右，吸附劑的細(xì)度越細(xì)吸附的有效菌就越多。PH5.5?7.5，雜菌率低于15%?20 %，不含致病菌和寄生蟲(chóng)，有效保存期不低于6個(gè)月。
[0006]當(dāng)前，隨著生物肥料的發(fā)展，少數(shù)地方在生產(chǎn)生物肥料時(shí)出現(xiàn)了無(wú)生產(chǎn)許可證、生產(chǎn)工藝落后、用未通過(guò)鑒定的菌種進(jìn)行生產(chǎn)、有效菌含量低、雜菌超標(biāo)等現(xiàn)象。還有些廠家在生物肥料中加入不適量的化肥或其它添加劑，使肥料中化肥的氮、磷、鉀含量過(guò)高導(dǎo)致有效菌死亡，而失去生物肥的作用。因此在選用生物肥料時(shí)要注意產(chǎn)品質(zhì)量，防止假冒偽劣產(chǎn)品，以避免給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)不應(yīng)有的損失。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種能針對(duì)我國(guó)土壤肥力的基本情況，開(kāi)發(fā)一種復(fù)合生物肥。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
[0009]一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物10-25份、解磷巨大芽抱桿菌3-8份、枯草芽孢桿菌菌劑5-25份，植物乳桿菌CGMCC N0.9405 10_25，聚谷氨酸3_5。
[0010]所述聚谷氨酸為Y-聚谷氨酸。
[0011]一種復(fù)合生物肥料的制備方法，將黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌分別進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，然后將發(fā)酵產(chǎn)物按比例混合造粒后再與Y-聚谷氨酸混勻即可。
[0012]解磷巨大芽抱桿菌是芽抱桿菌屬(Bacillus)中的一個(gè)種。運(yùn)動(dòng)，形成莢膜，好氧。從葡萄糖產(chǎn)酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，不產(chǎn)生卵磷脂酶，VP陰性。能分解土壤中的有機(jī)磷成為植物可利用的速效磷。
[0013]解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所提供，地址:中國(guó)河北滄州市運(yùn)河區(qū)解放西路頤和國(guó)際商務(wù)中心A座I區(qū)807-812。
[0014]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，采用常見(jiàn)固體發(fā)酵培養(yǎng)方法:孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0015]本發(fā)明中植物乳桿菌菌株特點(diǎn)如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)鞭毛，不產(chǎn)芽孢；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0016]理化特征為:過(guò)氧化氫酶(_)，明膠液化(_)，吲哚實(shí)驗(yàn)(+)，運(yùn)動(dòng)性(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，PH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(+)。
[0017]本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進(jìn)行選育:
[0018]原始出發(fā)菌種一試管活化一硫酸二乙酯(DES)誘變一亞硝基胍(NTG)誘變一等離子體誘變一平板初篩一搖瓶復(fù)篩一傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0019]本發(fā)明所采用的出發(fā)菌株在MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，其乳酸的生產(chǎn)速率為1.5g/L/d,當(dāng)培養(yǎng)基pH為3.5時(shí)幾乎停止生長(zhǎng)，對(duì)亞硝酸鈉的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發(fā)菌株為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場(chǎng)的青儲(chǔ)飼料，采集時(shí)間2013年9月15日。
[0020]為了提高其乳酸生產(chǎn)速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG技術(shù)對(duì)該菌種進(jìn)行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進(jìn)行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā)酵，生物傳感器分析儀對(duì)高產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。
[0021]植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明:經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代十次，各項(xiàng)性能指標(biāo)都比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒(méi)有回復(fù)，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌株。
[0022]經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):該誘變菌株的乳酸生產(chǎn)速率可以達(dá)到35g/L/d，該菌株經(jīng)過(guò)71小時(shí)發(fā)酵后乳酸濃度達(dá)到95g/L ;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力達(dá)到9.8mg/h/kg (自然發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽積累的速率大約為1.lmg/h/kg),能夠耐1%膽鹽。
[0023]因此采用該菌種生產(chǎn)泡菜，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kg以下，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0024]植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) tl j-2014,該菌株已于 2014 年 7 月 2 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.9405。
[0025]1.DES誘變選育
[0026]I)在超凈臺(tái)上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無(wú)瓊脂，葡萄糖20g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期。
[0027]2)取5mL菌液，5000rpm離心1min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0028]3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成17個(gè)/mL菌懸液。
[0029]4)取32mL pH7.0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為I % (v/v)。
[0030]5)在 37°C搖床中 150rpm 反應(yīng) 30min，取 ImL 混合液，加入 0.5mL25% Na2S2O3 溶液中止反應(yīng)。
[0031]6)適當(dāng)稀釋?zhuān)∽詈笙♂尪鹊木?.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2?3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0032]7)在37°C培養(yǎng)2?3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌LI。
[0033]2.亞硝基胍誘變
[0034]I)在超凈臺(tái)上取試管斜面上的植物乳桿菌LI 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無(wú)瓊脂)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期。
[0035]2)取5mL菌液5000rpm離心1min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0036]3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成17個(gè)/mL菌懸液。
[0037]4)取1mL菌懸液轉(zhuǎn)移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG，配制成終濃度為1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0038]5)在37°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min, 5000rpm離心1min收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0039]6)適當(dāng)稀釋?zhuān)∽詈笙♂尪鹊木?.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2?3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0040]7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取100支符合以上條件的菌落。
[0041]3.搖瓶復(fù)篩
[0042]I)在超凈臺(tái)上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無(wú)瓊脂)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)15h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
[0043]2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基(含250g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中、pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上(注:采用250mL三角瓶)。200rpm，37°C培養(yǎng)3-4天，每天分別檢測(cè)碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn)生速率、LPHMRS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。發(fā)酵結(jié)束后，比較100株菌種的碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn)生速率、LPHMRS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0044]3)選擇兼具高L-乳酸產(chǎn)生速率、耐受低pH (該菌種僅能在最低為pHl.8的培養(yǎng)基中生長(zhǎng))和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L(zhǎng)2菌。
[0045]4.遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0046]將L2菌在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測(cè)每次傳代后的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒(méi)有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說(shuō)明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。菌株命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
[0047]5.5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
[0048]I)取斜面上的植物乳桿菌L2 —環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無(wú)瓊脂)(葡萄糖濃度為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
[0049]2)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下10rpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10% (通氣0.5L/min)，后期厭氧培養(yǎng)63小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌L2的乳酸產(chǎn)量達(dá)到95g/L。這樣的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0050]3)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L pH為1.8的LPHMRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為50g/L)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下10rpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10%(通氣0.5L/min)，后期厭氧，整個(gè)過(guò)程用0.5mol/L的氫氧化鈉將發(fā)酵液pH控制在1.8，總培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說(shuō)明植物乳桿菌L2能夠在pHl.8的環(huán)境中生存。
[0051]4)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下10rpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10% (通氣0.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過(guò)程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)算發(fā)酵過(guò)程植物乳桿菌L2對(duì)亞硝酸鈉的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，L2對(duì)亞硝酸鈉的降解速率可以達(dá)到563mg/h/L0
[0052]將對(duì)數(shù)期的菌種1mL接入裝有2kg預(yù)處理過(guò)的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進(jìn)行加工，每12小時(shí)測(cè)定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，L2菌對(duì)亞硝酸鈉的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于5mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0053]有益效果:
[0054]實(shí)驗(yàn)表明，使用本品可提高糧食產(chǎn)量20-40 %，提高蔬菜產(chǎn)量20-40 %，還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風(fēng)味。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-120克，是目前國(guó)內(nèi)外使用量較少的高效復(fù)合生物肥料之一。

【具體實(shí)施方式】
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[0055]下面的實(shí)施例可以使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0056]1、菌劑培養(yǎng)制備:
[0057]枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備:枯草芽孢桿菌菌劑制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢離心分離獲得濕菌體和發(fā)酵液；發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的40-50%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0320-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0058]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-35 °C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；
[0059]本發(fā)明提供的產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)L1-2013-02。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)06110:，地址為:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7926。
[0060]所述菌株特點(diǎn)如下:
[0061]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn)動(dòng)性的好氧菌。鏡檢為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實(shí)驗(yàn)成陽(yáng)性。
[0062]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02由一株保藏于本實(shí)驗(yàn)室的產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0063](I)菌懸液的制備
[0064]將在平板劃線分離后長(zhǎng)出的L1-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培養(yǎng)12h后,取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0065](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0066]將菌懸液置于無(wú)菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過(guò)照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過(guò)的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0067](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0068]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03
[0069](4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0070]將獲得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0071](5)酶活測(cè)定
[0072]酶活單位的定義:lmL粗酶液,于105°C、pH 4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。
[0073]經(jīng)測(cè)定，菌株L1-2013-02，為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0074]所述氯化鋰平板:淀粉I %，蛋白胨 I %，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8%, CaCl20.2%,氯化鋰0.9%,瓊脂2%。
[0075]所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0076]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5%?15%，豆餅粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0077]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10%(V/V)，100r/min、40°C 發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0078]由菌株L1-2013-02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α -淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0079](I)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在105_115°C之間，且在110°C以下保存的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C以上保存長(zhǎng)時(shí)間溫度穩(wěn)定性較差。
[0080](2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定。
[0081](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000-35000U/ml。
[0082]1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013-02，該菌株具有強(qiáng)耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點(diǎn)。
[0083]2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α-淀粉酶酶活力高達(dá)30000-35000u/ml，；適用溫度范圍為25-115°C，最適反應(yīng)溫度110°C，在110°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH值范圍為3.0-7.0，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α -淀粉酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0084]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03是由實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，然后對(duì)突變株逐級(jí)篩選淘汰，最后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03o
[0085]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為:中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7927。
[0086]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0087]I)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2010劃線接種斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2?3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下:12°Brix 麥芽汁 100mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0088]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無(wú)菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無(wú)菌水，把孢子刮下，用濾紙過(guò)濾，將濾過(guò)液倒入已滅菌、并加有5-10粒無(wú)菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0089]3)亞硝基胍(NTG)誘變
[0090]A.用無(wú)菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成16-1O7個(gè)/mL。
[0091]B.取1mL菌懸液轉(zhuǎn)移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG,配制成終濃度為1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0092]C.在30°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min, 5000rpm離心1min收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0093]D.適當(dāng)稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為13個(gè)/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2?3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來(lái)水定容100mL, pH 值 5-6,121°C滅菌 20min)。
[0094]E.復(fù)篩:將獲得的200株菌分別用無(wú)菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無(wú)菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，接種量10% (V/V)，30°C、100r/min培養(yǎng)96h，分別測(cè)定各菌株的纖維素酶活性。(所述復(fù)篩培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來(lái)水定容lOOOmL，pH值5_6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。
[0095]4)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0096]將L1-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測(cè)每次傳代后的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒(méi)有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說(shuō)明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0097]5)放大試驗(yàn)
[0098]①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger L1-2013-03接入500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養(yǎng)72_96h。
[0099]③種子罐培養(yǎng):將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的10L發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為6.0±0.2，培養(yǎng)溫度30±0.1 °C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(v/V) 1:0.8-1.2，培養(yǎng)時(shí)間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉10gjt酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來(lái)水定容lOOOmL，pH值5_6，121°C滅菌20min。
[0100]發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測(cè)經(jīng)測(cè)定，菌株Aspergillusniger L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分別比出發(fā)菌株 Aspergillus nigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0101]實(shí)施例1
[0102]一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物20份、解磷巨大芽抱桿菌5份、枯草芽孢桿菌菌劑20份，植物乳桿菌CGMCC N0.940515，聚谷氨酸4。
[0103]所述聚谷氨酸為Y-聚谷氨酸。
[0104]實(shí)施例2
[0105]一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物10份、解磷巨大芽抱桿菌8份、枯草芽孢桿菌菌劑25份，植物乳桿菌CGMCC N0.940510，聚谷氨酸3。
[0106]所述聚谷氨酸為Y-聚谷氨酸。
[0107]實(shí)施例3
[0108]一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物25份、解磷巨大芽抱桿菌3份、枯草芽孢桿菌菌劑25份，植物乳桿菌CGMCC N0.940510，聚谷氨酸5。
[0109]所述聚谷氨酸為Y-聚谷氨酸。
[0110]選擇寧夏吳忠地區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)；試驗(yàn)旱地種植玉米10畝，分別在種植時(shí)使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.2公斤，出苗I個(gè)月左右通過(guò)鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.7公斤，對(duì)照組使用市場(chǎng)銷(xiāo)售的類(lèi)似生物肥料。
[0111]發(fā)明產(chǎn)品使用旱地玉米產(chǎn)量達(dá)到380公斤，對(duì)照組達(dá)到280公斤，比對(duì)照組節(jié)約灌溉用水12% ;該地塊在第2年種植春小麥，春小麥產(chǎn)量達(dá)到了 300公斤，比對(duì)照組單產(chǎn)提高了 22%。且試驗(yàn)田土壤結(jié)構(gòu)良好,無(wú)大塊和板結(jié)。
【權(quán)利要求】
1.復(fù)合生物肥，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌菌劑和聚谷氨酸組成，復(fù)合生物肥的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物10-25份、解磷巨大芽抱桿菌3-8份、枯草芽孢桿菌菌劑5-25份，植物乳桿菌CGMCC N0.940510-25，聚谷氨酸3_5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合生物肥，所述聚谷氨酸為Y-聚谷氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的一種復(fù)合生物肥，所述復(fù)合生物肥的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物20份、解磷巨大芽抱桿菌5份、枯草芽孢桿菌菌劑20份，植物乳桿菌CGMCCN0.940515，聚谷氨酸4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的一種復(fù)合生物肥，所述復(fù)合生物肥的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物10份、解磷巨大芽抱桿菌8份、枯草芽孢桿菌菌劑25份，植物乳桿菌CGMCCN0.940510，聚谷氨酸3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的一種復(fù)合生物肥的制備方法，將黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌分別進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，然后將發(fā)酵產(chǎn)物按比例混合造粒后再與Y-聚谷氨酸混勻即可。
【文檔編號(hào)】C05F11/08GK104311169SQ201410510451
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】邵素英, 李建樹(shù) 申請(qǐng)人:邵素英