以石仙桃根狀莖為外植體快速繁殖石仙桃的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種繁殖石仙桃的方法，特別涉及一種以石仙桃根狀莖為外植體快速繁殖石仙桃的方法，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。一種以石仙桃根莖芽為外植體快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以下依序進行的步驟：(1)外植體的準備階段：于每年11月至次年的4月采集石仙桃，除去假鱗莖，將根莖上帶有根狀莖的頂芽或腋芽作為外植體切下，去除根狀莖上覆蓋的老鱗片和根，備用；(2)無菌處理階段；(3)初代培養(yǎng)階段；(4)繼代壯苗培養(yǎng)階段；(5)生根培養(yǎng)階段；本發(fā)明所提供的方法能有效提高石仙桃的繁殖效率，獲得足量石仙桃再生植株，為其規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】以石仙桃根狀莖為外植體快速繁殖石仙桃的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種繁殖石仙桃的方法，特別涉及一種以石仙桃根狀莖為外植體快速 繁殖石仙桃的方法，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.)系蘭科（Orchidaceae)石仙桃屬 (Pholidota)多年附生草本植物，俗稱石橄欖。植株高15-25 cm，根狀莖粗壯，橫走，具多， 數(shù)須根；假鱗莖卵狀長圓形或長圓形，長2-7 cm，粗0. 5-2. 5 cm，頂端具2片葉。葉倒卵狀披 針形、倒卵形或倒卵狀橢圓形，長8-18 cm，寬2-5 cm，頂端急尖或漸尖，基本下延成長柄，通 常有較明顯的弧形脈3-5條?；ㄝ汩L于假鱗莖頂端，直立或多少下垂，基部具多枚鱗片；總 裝花序頂生，具數(shù)朵至20朵花；花苞片2列，淡褐色或淡紫紅色，卵形或卵狀披針形，長1-2 cm，頂端鈍或尖，邊緣多少內(nèi)卷；花白色或帶黃綠色，唇瓣上有褐色條紋；萼片卵形，分離， 近等大，長約8 mm，寬4-5 mm，頂端鈍；花瓣線狀披針形，與萼片近等長，寬約I. 5 mm ;唇瓣卵 狀圓形,長約8 mm，基部凹陷成杯狀或囊狀，頂端3裂，中裂片扁圓形，長約3 mm，寬約4 mm，頂 端鈍，具小尖頭，外彎，側(cè)裂片半圓形；蕊柱長4-5 mm，有狹翅；子房連花梗長6-9 mm。果倒卵 形，長2-3cm，具6條縱翅?；ㄆ?-6月。果期11月至翌年2月（林來官，張永田等.福 建植物志[M].福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1994,第六卷：636-637)。在我國分布于福建、 廣東、廣西、云南等省，在福建省主要分布于福州、平和、長樂、南靖等地區(qū)。生于林中或林緣 樹上、巖壁上或巖石上，海拔通常在1500m以下，少數(shù)可達2500m(陳心啟，吉占和，郎偕永 等.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1999, 18:388-399)。
[0003] 石仙桃作為中草藥具有悠久的歷史，始載于《生草藥性備要》。以全草或假鱗莖入 藥，其性甘味涼，具有養(yǎng)陰、清熱、利濕消瘀的功效（南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上 海：上?？茖W(xué)出版社，2006)，民間常用來治療高血壓、頭暈和各種原因引起的頭疼等。用其 制成的"頭痛定糖漿"臨床上用于治療神經(jīng)功能性頭痛、腦震蕩后遺癥，已應(yīng)用多年，治療效 果良好（中華人民共和國藥典委員會.中藥成方制劑（第九冊）.北京：北京化學(xué)工業(yè)出 版社，1994:67)。
[0004] 近幾年對其藥理進行了比較多的研究，報道其在鎮(zhèn)靜、催眠、抗癌、抗疲勞等方面 都有作用（劉建新，周青，連其深.石仙桃對中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué) 報，2004, 24(2) :119-121;王光輝，郭曉宇，王乃利等.云南石仙桃氯仿萃取物活性部位 對入肝癌細胞H印G2的周期抑制作用.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006, 23(4) :240-243 ;劉建新， 周青，連其深.石仙桃的鎮(zhèn)痛作用的研究.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002, 22(2) :105-107)。同時 現(xiàn)在對其化學(xué)成分做了不同方法的提取和分離，得到天麻苷元、原兒茶醛、胡蘿卜苷等化學(xué) 成分（舒文海.石仙桃的局麻作用研究.中國藥學(xué)雜志，1989, 24(5):304;林麗聰，張怡 評，吳春敏等.石仙桃葉化學(xué)成分研究.時珍國醫(yī)國藥，2009, 20(4) :922-923;李兵，郭環(huán) 娟，容羨賢.石仙桃質(zhì)量標準研究.中國藥業(yè)，2010, 19 (6) : 19-20 ;林麗聰，吳春敏，陳 海濱等.RP - HPLC法測定石仙桃中天麻素和天麻苷元.中草藥.2008, 39 (2) : 283-285)。
[0005] 隨著臨床對石仙桃研究的深入和新功能的開發(fā)，人們的需求量與日俱增，但由于 其生長緩慢、生物量小、自然繁殖率低、對生長環(huán)境要求苛刻，自然資源貯藏量及可開發(fā)利 用量非常有限，長期掠奪式采挖野生資源，已導(dǎo)致野生資源銳減并逐漸匱乏，不少原產(chǎn)地石 仙桃資源呈現(xiàn)稀缺趨勢，因此人工栽培迫在眉睫。而充足的種苗供給是實現(xiàn)石仙桃人工栽 培的第一個瓶頸，并且現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于石仙桃繁殖的方法效率極低，為此本發(fā)明對石仙桃 的繁殖方法進行了研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種以石仙桃根狀莖為外植體快速繁殖石仙桃的方法，以 解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明所提供的方法能有效提高石仙桃的繁殖效率，獲 得足量石仙桃再生植株，為其規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種以石仙桃根莖芽為外植體快速繁殖石仙桃的方法，所述的方法包括以下依序 進行的步驟：
[0009] (1)外植體的準備階段
[0010] 于每年11月至次年的4月采集石仙桃，除去假鱗莖，將根莖上帶有根狀莖的頂芽 或腋芽作為外植體切下，去除根狀莖上覆蓋的老鱗片和根，備用；
[0011] (2)無菌處理階段，包括以下依序進行的步驟：
[0012] ①將步驟（1)中所準備的外植體先用清水沖洗干凈后，去掉多余的根莖，使每個 芽上僅保留2毫米以下的根莖；
[0013] ②接著轉(zhuǎn)移到滅菌后的超凈工作臺上，用無菌水沖洗后，轉(zhuǎn)入到無菌瓶內(nèi)；
[0014] ③接著再用體積百分比濃度為70% -75%的酒精滅菌2-3分鐘后，用無菌水沖 洗；
[0015] ④之后倒入質(zhì)量百分比濃度為0. 05-0. 15%的升汞滅菌10-16分鐘；
[0016] ⑤最后再用無菌水沖洗后，放入盛有無菌濾紙的盤子里，將外植體上的頂芽或腋 芽表面的水吸干，備用；
[0017] (3)初代培養(yǎng)階段
[0018] 將步驟（2)中無菌處理好的外植體，接種到初代培養(yǎng)基進行初代培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境 溫度為23±5°C，光照強度為2500-3500Lux，光照周期為10-14h/d，培養(yǎng)周期為70-90天；
[0019] 所述初代培養(yǎng)基為：MS 培養(yǎng)基 +0? 5-1. Omg/L 的 NAA+3. 0-4. Omg/L 的 6-BA+1-3% 的蔗糖+0.6-1. 0%的瓊脂，pH值為5. 8-6.0 ;其中，NAA是a-萘乙酸；6-BA是6-芐氨基腺 嘌呤；
[0020] MS培養(yǎng)基的基本組成如下表所述：
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 一種以石仙桃根莖芽為外植體快速繁殖石仙桃的方法，其特征在于：所述的方法包 括以下依序進行的步驟： (1) 外植體的準備階段 于每年11月至次年的4月采集石仙桃，除去假鱗莖，將根莖上帶有根狀莖的頂芽或腋 芽作為外植體切下，去除根狀莖上覆蓋的老鱗片和根，備用； (2) 無菌處理階段，包括以下依序進行的步驟： ① 將步驟（1)中所準備的外植體先用清水沖洗干凈，并去掉多余的根莖，使每個芽上 僅保留2毫米以下的根莖； ② 接著轉(zhuǎn)移到滅菌后的超凈工作臺上，用無菌水沖洗后，轉(zhuǎn)入到無菌瓶內(nèi)； ③ 接著再用體積百分比濃度為70% -75%的酒精滅菌2-3分鐘后，用無菌水沖洗； ④ 之后倒入質(zhì)量百分比濃度為0. 05-0. 15%的升汞滅菌10-16分鐘； ⑤ 最后再用無菌水沖洗后，放入盛有無菌濾紙的盤子里，將外植體上的頂芽或腋芽表 面的水吸干，備用； (3) 初代培養(yǎng)階段 將步驟（2)中無菌處理好的外植體，接種到初代培養(yǎng)基進行初代培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境溫度 為23±5°C，光照強度為2500-3500Lux，光照周期為10-14h/d，培養(yǎng)周期為70-90天； 所述初代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0· 5-1. Omg/L的NAA+3. 0-4. Omg/L的6-BA+1-3%的蔗 糖+0.6-1. 0 % 的瓊脂，pH 值為 5. 8-6.0 ; (4) 繼代壯苗培養(yǎng)階段 將步驟（3)中初代培養(yǎng)后萌發(fā)的小芽，接種到繼代壯苗培養(yǎng)基中進行繼代壯苗培養(yǎng)； 培養(yǎng)環(huán)境溫度為23±5°C，光照強度為2500-3500LUX，光照周期為10-14h/d，培養(yǎng)周期為 70-100 天； 所述繼代壯苗培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0. 5-1. Omg/L的ΝΑΑ+0. 5-1. Omg/L的 6-BA+50-100g/L 的香蕉 +1-3 % 的蔗糖 +0· 6-1. 0 % 的瓊脂，pH 值為 5. 8-6. 0 ; (5) 生根培養(yǎng)階段 將步驟（4)中繼代壯苗培養(yǎng)后生長的小苗，接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；培養(yǎng) 環(huán)境溫度為23±5°C，光照強度為2500-3500Lux，光照周期為10-14h/d，培養(yǎng)周期為70-100 天； 所述生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+0· 3-0. 5mg/L的NAA+30-100g/L的香蕉+0· 3-0. 5g/ L的活性炭+1-3%的蔗糖+0· 6-1. 0 %的瓊脂，pH值為5. 8-6. 0。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以石仙桃根莖芽為外植體快速繁殖石仙桃的方法，其特征在 于： 步驟（1)外植體的準備階段中，選用根莖上帶有根狀莖的頂芽作為外植體； 步驟（2)無菌處理階段中，每一步驟用無菌水沖洗的次數(shù)均為3-5次；所述酒精的體積 百分比濃度為75%，滅菌時間為2分鐘；所述升汞的質(zhì)量百分比濃度為0. 1%，滅菌時間為 13分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以石仙桃根莖芽為外植體快速繁殖石仙桃的方法，其特 征在于： 步驟（3)初代培養(yǎng)階段中，培養(yǎng)環(huán)境溫度為23±2°C，光照強度為2800-3200LUX，光照 周期為12h/d，培養(yǎng)周期為70天；所述初代培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+0. 5mg/L的NAA+4. Omg/L 的6-BA+2 %的蔗糖+0· 8 %的瓊脂，pH值為5· 9 ; 步驟（4)繼代壯苗培養(yǎng)階段中，培養(yǎng)環(huán)境溫度為23±2°C，光照強度為2800-3200LUX， 光照周期為12h/d，培養(yǎng)周期為70天；所述繼代壯苗培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+1. Omg/L的 NAA+1. Omg/L 的 6-BA+100g/L 的香蕉 +2% 的蔗糖 +0· 8% 的瓊脂，pH 值為 5. 9 ; 步驟（5)生根培養(yǎng)階段中，培養(yǎng)環(huán)境溫度為23±2°C，光照強度為2800-3200LUX，光照 周期為12h/d，培養(yǎng)周期為70天；所述生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+0. 5mg/L的NAA+50g/L 的香蕉+〇· 5g/L的活性炭+2%的蔗糖+0· 8%的瓊脂，pH值為5. 9。
【文檔編號】A01H4/00GK104255497SQ201410492178
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】陳菁瑛, 劉保財, 黃穎楨, 趙云青 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所