一種山竹快繁培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，公開了一種山竹快繁培養(yǎng)方法，包括以下步驟：(1)外植體表面滅菌；(2)不定胚的誘導(dǎo)階段；(3)外植體增殖階段；(4)再生芽誘導(dǎo)生根。應(yīng)用本發(fā)明所述的山竹快繁培養(yǎng)方法繁育山竹種苗，增殖系數(shù)可達(dá)5.4左右，所得試管苗保留了母本植株的優(yōu)良特性，不會產(chǎn)生性狀分離現(xiàn)象，種苗生長狀況良好。1粒種子經(jīng)1年培養(yǎng)可產(chǎn)生1500株左右山竹種苗，達(dá)到快速、大量繁育山竹種苗的目的，對山竹種植產(chǎn)業(yè)具有重大的實際意義。
【專利說明】一種山竹快繁培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種山竹快繁培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 山竹（Garcinia Mangostana L.)的傳統(tǒng)繁育可通過種子繁育，但山竹種子的活力 不能長時間維持，而且山竹種子繁育系數(shù)低，種子數(shù)量少，1個果實最多產(chǎn)生2個種子（很多 果實沒有種子），這些因素嚴(yán)重局限了山竹的快速、大量繁育。另外，由于山竹果樹自身特 性，不能周年生產(chǎn)種子，造成種子供應(yīng)不足；其次，實生苗需要10-15年才開花掛果，生長周 期長，產(chǎn)業(yè)發(fā)展成本高，難以滿足市場的需求。山竹繁殖過程中，也有通過嫁接方法將良種 接穗接到實生苗上進(jìn)行改良。如陳兵等2014年6月發(fā)表在《廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)》雜志上的論文 《海南山竹子種苗繁育技術(shù)》，介紹了山竹子實生苗和嫁接苗的繁育技術(shù)。雖然有觀察到可 以通過雖然通過嫁接可以使山竹提前結(jié)果現(xiàn)象，但由于接穗和砧木之間親和能力問題，一 旦遇到大風(fēng)，容易引起嫁接部位出現(xiàn)斷裂、折斷等問題，因此嫁接的方法在繁育山竹種苗上 也存在很大的局限性。此外，還有報道選用1年生的種子苗的帶芽點的枝條，浸泡生根劑， 在溫室沙床中扦插繁殖山竹種苗。雖然扦插枝條很容易生根，但小的種苗有芽點數(shù)目較少， 繁育系數(shù)極低，也很難實現(xiàn)山竹種苗的大規(guī)模繁育。
[0003] 不定胚是與受精卵具同樣形態(tài)變化過程的植物體細(xì)胞形成的胚。栽培品種的山竹 僅開雌花，少有雄花。由于山竹是孤雌生殖，沒有分化成胚形式，而形成不定胚，缺乏品種變 異。而山竹種子具有獨特的結(jié)構(gòu)，種子兩端是通過兩個薄的形成層連接著的沒有分化良好 的胚芽和胚根。種子萌發(fā)時，芽從原形成層的一端形成，而根從種子另一端長出。由于其存 在的單性特殊生殖方式和種子結(jié)構(gòu)，山竹的不定胚保存了母本的性狀，并且可以穩(wěn)定遺傳， 不會產(chǎn)生品種變異的現(xiàn)象，因此，山竹不定胚的研究對于規(guī)?；嘤街穹N苗具有重要意 義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服山竹種子繁育系數(shù)低而其它繁育方法在山竹繁育產(chǎn)業(yè)中存在的不足， 本發(fā)明提出了一種山竹快繁培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
[0006] -種山竹快繁培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0007] (1)外植體表面滅菌
[0008] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有洗衣粉或洗潔精的水溶液洗滌或流水 沖洗2_5h ;再用酒精浸蘸5-30s，邊浸蘸邊搖動山竹種子，無菌水沖洗；最后在含有次氯酸 鈉和吐溫80的消毒液中浸泡15-20min,邊浸泡邊搖動山竹種子,無菌水沖洗,備用；
[0009] (2)不定胚誘導(dǎo)階段
[0010] 經(jīng)過步驟⑴處理的山竹種子切塊，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0011] (3)外植體增殖階段
[0012] 外植體轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽；待不定芽長出葉片，培養(yǎng)后取葉片橫切3-5mm， 培養(yǎng)40-60d產(chǎn)生芽點；芽點生長成再生芽時從外植體切除轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0013] (4)再生芽誘導(dǎo)生根
[0014] 當(dāng)再生芽長到13-17mm時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)后移到苗圃進(jìn)行假植。
[0015] 進(jìn)一步，所述步驟（1)所用洗衣粉或洗潔精水溶液質(zhì)量濃度為1-3%，酒精的體積 濃度為65-75%，次氯酸鈉的體積濃度為5-8%，吐溫80的體積濃度為0. 1-0. 3%。
[0016] 進(jìn)一步，步驟（2)所述山竹種子不定胚分離成3-6塊。
[0017] 進(jìn)一步，步驟⑵所用培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為0· 3-0. 8mg/L的NAA和0-5mg/L 的BA的MS培養(yǎng)基，或添加質(zhì)量濃度為2. 0-4. Omg/L的2, 4-D和0-5mg/L的BA的MS培養(yǎng) 基，光照時間8-12h/d進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0018] 進(jìn)一步，步驟（3)培養(yǎng)外植體長出葉片所用的培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度2-6mg/L的 BA、10-30g/L的蔗糖和2-3g/L的Phytagel的WPM培養(yǎng)基，葉片培養(yǎng)30-50d后進(jìn)行橫切； 再生芽增殖培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為0. 9-1. 3mg/L的BA的WPM培養(yǎng)基。
[0019] 進(jìn)一步，步驟（3)培養(yǎng)外植體長出葉片所用的培養(yǎng)基為添加4-5mg/L的BA、 15-25g/L的蔗糖、2. 4-2. 6g/L的Phytagel的WPM ;再生芽增殖培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為 I. O-L 2mg/L 的 BA 的 WPM 培養(yǎng)基。
[0020] 進(jìn)一步，步驟（3)所述再生芽高度在5-6_時切除。
[0021] 進(jìn)一步，步驟⑷所述生根培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為0. 1-1. 〇mg/L的IBA的1/2MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照強度2000Lx，光照時間8-12小時/天，培養(yǎng)時間為40-60d。
[0022] 進(jìn)一步，步驟（4)試管苗莖高5-7cm，根長3-5cm移到苗圃進(jìn)行假植。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] 本發(fā)明利用山竹孤雌生殖的特性，其不定胚作為外植體不會出現(xiàn)后代性狀分離的 現(xiàn)象，通過本發(fā)明所述的快繁培養(yǎng)方法，增殖系數(shù)為5. 4左右，能夠快速、大量培育山竹種 苗，彌補了山竹采用種子繁殖、嫁接、扦插等方法繁殖存在的繁殖系數(shù)低、生長周期長、種苗 抗風(fēng)性差等問題，所生產(chǎn)的種苗保留了母本植株的優(yōu)良特性，生長狀況良好，不會產(chǎn)生性狀 分離現(xiàn)象，1粒山竹種子經(jīng)1年培養(yǎng)可產(chǎn)生1500株山竹種苗，大大提高了山竹的繁殖速度， 能夠?qū)崿F(xiàn)快速、穩(wěn)定繁育山竹種苗的目的，對山竹種植產(chǎn)業(yè)具有重大的實際意義。

【具體實施方式】
[0025] 下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0026] 實施例1
[0027] -種山竹快繁培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0028] (1)外植體表面滅菌
[0029] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有質(zhì)量濃度1 %洗衣粉或洗潔精的水溶 液洗1-2次或流水沖洗l_5h ;再用體積分?jǐn)?shù)65 %的酒精浸蘸5-15s，邊浸蘸邊搖動山竹種 子，無菌水沖洗2-4次；最后在體積濃度5 %次氯酸鈉和體積濃度0. 1 %吐溫80的消毒液中 浸泡15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水沖洗3-5次，經(jīng)過表面消毒、滅菌后的山竹 種子備用；為避免山竹種子活性降低，從果實中取出的種子需在5d內(nèi)處理完成；
[0030] (2)不定胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0031] 經(jīng)過步驟（1)處理過的山竹種子切成3塊，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，光照時間 為 8h/d，培養(yǎng)基中添加 0· 3mg/L 的萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid, NAA) ; (3)誘導(dǎo)組 織的增殖
[0032] 外植體轉(zhuǎn)入木本植物用培養(yǎng)基（Woody Plant medium，WPM培養(yǎng)基）培養(yǎng)誘導(dǎo)不定 芽，WPM培養(yǎng)基含有質(zhì)量濃度為2mg/L BA、10g/L蔗糖和2g/L Phytagel，不定芽培養(yǎng)長出 葉片后培養(yǎng)30d，取葉片橫切3-5mm培養(yǎng)，MS培養(yǎng)基培養(yǎng)40d后，每片葉片外植體可產(chǎn)生50 個左右的芽點；每個芽點可長成一個再生芽，再生芽高度在5-6_時，發(fā)育出芽的基本結(jié)構(gòu) 后，從外植體切除，在0. 9mg/L BA的WPM培養(yǎng)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0033] (4)再生芽誘導(dǎo)生根
[0034] 當(dāng)再生芽長到13mm時，在1/2MS培養(yǎng)基中添加0. lmg/L的IBA，2000Lx光照條件 下8小時/天，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)45天后，待試管苗莖高5-7cm、根長3-5cm后移到苗圃進(jìn) 行假植。
[0035] 實施例2
[0036] -種山竹快繁培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0037] (1)外植體表面滅菌
[0038] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有質(zhì)量濃度2 %洗衣粉或洗潔精的水溶 液洗1-2次或流水沖洗l_5h ;再用體積濃度70%的酒精浸蘸10-20s，邊浸蘸邊搖動山竹 種子，無菌水沖洗2-4次；最后在體積濃度7 %次氯酸鈉和0. 2 %吐溫80的消毒液中浸泡 15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水沖洗3-5次，經(jīng)過表面消毒、滅菌后的山竹種子 備用；為避免山竹種子活性降低，從果實中取出的種子需在5d內(nèi)處理完成；
[0039] (2)不定胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0040] 經(jīng)過步驟⑴處理過的山竹種子切成4塊接種在MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，光 照時間為l〇h/d，培養(yǎng)基中添加0. 5mg/L的NAA和和2. Omg/L的BA (6-芐基腺嘌呤， 6-BenzyIaminopurine)；
[0041] (3)誘導(dǎo)組織的增殖
[0042] 外植體轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，WPM培養(yǎng)基含有4. 5mg/L BA、20g/L蔗糖 和2. 5g/L Phytagel，不定芽長出葉片后，培養(yǎng)40d后取葉片橫切3-5mm培養(yǎng)，培養(yǎng)50d后， 每片葉外植體可產(chǎn)生50個左右的芽點；每個芽點可長成一個再生芽，再生芽高度在5-6_ 發(fā)育出芽的基本結(jié)構(gòu)后，從外植體切除，在I. lmg/LBA的WPM培養(yǎng)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0043] (4)再生芽生根
[0044] 當(dāng)再生芽長到15mm時，在1/2MS培養(yǎng)基中添加0· 5mg/L的IBA，2000Lx光照條件 下10h/d，進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)50d待試管苗莖高5-7cm、根長3-5cm后移到苗圃進(jìn)行假植。
[0045] 實施例3
[0046] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，包括以下步驟：
[0047] (1)外植體表面滅菌
[0048] 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有質(zhì)量濃度3 %洗衣粉或洗潔精的水溶 液洗1-2次或流水沖洗l_5h ;再用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸蘸20-30s，邊浸蘸邊搖動山竹種 子，無菌水沖洗2-4次；最后在體積濃度5-8%次氯酸鈉和0. 3%吐溫80的消毒液中浸泡 15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水沖洗3-5次，經(jīng)過表面消毒、滅菌后的山竹種子 備用；為避免山竹種子活性降低，從果實中取出的種子需在5d內(nèi)處理完成；
[0049] (2)不定胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0050] 經(jīng)過步驟⑴處理過的山竹種子切成6 ±夬，接種在MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，光照時 間為12h/d，培養(yǎng)基中添加0. 8mg/L的NAA和5mg/L的BA ;
[0051] (3)誘導(dǎo)組織的增殖
[0052] 外植體轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，WPM培養(yǎng)基含有6mg/L BA、30g/L蔗糖和 3. Og/L Phytagel，待不定芽長出葉片后，培養(yǎng)50d后，取葉子橫切3-5mm培養(yǎng)，培養(yǎng)60d后， 每片葉外植體可產(chǎn)生50個左右芽點；每個芽點可長成一個再生芽，再生芽高度在5-6_發(fā) 育出芽的基本結(jié)構(gòu)后，從外植體切除，在I. 3mg/LBA的WPM培養(yǎng)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0053] (4)再生芽誘導(dǎo)生根
[0054] 當(dāng)再生芽長到17mm時，在1/2MS培養(yǎng)基中添加 I. Omg/L的IBA，2000Lx光照條件 下12h/d，誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)60d待試管苗莖高5-7cm、根長3-5cm后移到苗圃進(jìn)行假植。
[0055] 實施例4
[0056] -種山竹快繁培養(yǎng)方法，其中步驟（2)中MS培養(yǎng)基中添加2mg/L的2, 4-D，其余操 作同實施例1。
[0057] 實施例5
[0058] 一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其中步驟（2)中MS培養(yǎng)基中添加3mg/L 2, 4-D和2. Omg/ L的BA，其余操作同實施例2。
[0059] 實施例6
[0060] 一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其中步驟⑵中MS培養(yǎng)基中添加4mg/L 2, 4-D和5mg/L 的BA，其余操作同實施例3。
[0061] 本發(fā)明所述的山竹快繁培養(yǎng)方法繁育效果觀察
[0062] 取30粒發(fā)育良好的山竹種子，分作6組，每組5粒，分別采用以上6個實施例中的 培養(yǎng)方法進(jìn)行快繁培養(yǎng)1年，計算所得的山竹試管苗數(shù)目。實驗結(jié)果見表1。
[0063] 表1本發(fā)明所述的山竹快繁培養(yǎng)方法繁育效果

【權(quán)利要求】
1. 一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 外植體表面滅菌 從成熟山竹果實中獲取的山竹種子，用加有洗衣粉或洗潔精的水溶液洗滌或流水沖洗 2_5h ;再用酒精浸蘸5-30s，邊浸蘸邊搖動山竹種子，無菌水沖洗；最后在含有次氯酸鈉和 吐溫80的消毒液中浸泡15-20min，邊浸泡邊搖動山竹種子，無菌水沖洗，備用； (2) 不定胚誘導(dǎo)階段 經(jīng)過步驟（1)處理過的山竹種子切塊，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)； (3) 外植體增殖階段 外植體轉(zhuǎn)入WPM培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽；待不定芽長出葉片，培養(yǎng)后取葉片橫切3-5mm，培養(yǎng) 40-60d產(chǎn)生芽點；芽點生長成再生芽時從外植體切除轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)； (4) 再生芽誘導(dǎo)生根 當(dāng)再生芽長到13-17mm時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)后移到苗圃進(jìn)行假植。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟（1)所用洗 衣粉或洗潔精水溶液質(zhì)量濃度為1-3%，酒精的體積濃度為65-75%，次氯酸鈉的體積濃度 為5-8 %，吐溫80的體積濃度為0. 1-0. 3 %。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（2)所述山竹種 子不定胚分離成3-6塊。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2)所用培養(yǎng)基 為添加質(zhì)量濃度為〇. 3-0. 8mg/L的NAA和0-5mg/L的BA的MS培養(yǎng)基，或添加質(zhì)量濃度為 2. 0-4. Omg/L的2, 4-D和0-5mg/L的BA的MS培養(yǎng)基，光照時間8-12h/d進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（3)培養(yǎng)外植 體長出葉片所用的培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度2-6mg/L的BA、10-30g/L的蔗糖和2-3g/L的 Phytagel的WPM培養(yǎng)基；再生芽增殖培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為0. 9-1. 3mg/L的BA的WPM培 養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（3)培養(yǎng)外植體 長出葉片所用的培養(yǎng)基為添加4-5mg/L的BA、15-25g/L的蔗糖、2. 4-2. 6g/L的Phytagel的 WPM ;葉片培養(yǎng)30-50d后進(jìn)行橫切；再生芽增殖培養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為1. 0-1. 2mg/L的 BA的WPM培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（3)所述再生芽 高度在5-6mm時切除。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（4)所述生根培 養(yǎng)基為添加質(zhì)量濃度為〇. 1-1. 〇mg/L的IBA的1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照強度2000Lx， 光照時間8-12h/d，培養(yǎng)時間40-60d。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山竹快繁培養(yǎng)方法，其特征在于：驟（4)試管苗莖高 5-7cm，根長3-5cm移到苗圃進(jìn)行假植。
【文檔編號】A01H4/00GK104221859SQ201410439705
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】李敬陽, 金志強, 明建鴻, 唐粉玲, 林妃, 許奕, 常勝合 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚?br>