基于基因沉默技術(shù)舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因及dsRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因10的基因致死片段及其dsRNA的應(yīng)用，通過對舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因的克隆和測序，得到核苷酸序列為SEQIDN0：1的幾丁質(zhì)酶10基因，從中選出序列為SEQIDN0：2的幾丁質(zhì)酶基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入舞毒蛾的體腔后，舞毒蛾因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
【專利說明】基于基因沉默技術(shù)舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因及dsRNA

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾致死基因片段 ChitinaselO 及其 dsRNA。

【背景技術(shù)】
[0002] 在我國，化學(xué)藥劑連續(xù)單一長期使用已導(dǎo)致昆蟲對多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗 藥性，例如，對于害蟲舞毒蛾需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達(dá)到滿意的防治效果，造成了更 為嚴(yán)重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外，舞毒蛾還會影響人類健康，當(dāng)人們直接接觸舞毒 蛾時(shí)，常會發(fā)生紅腫發(fā)癢現(xiàn)象，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生皮疹。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，急需化學(xué)農(nóng) 藥之外的替代防治手段。
[0003] RNA干擾（RNA interference，RNAi )是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈 RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結(jié) 合，根據(jù)序列配對的程度降解靶標(biāo)基因 mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在 于真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝 爾醫(yī)學(xué)與生理獎(jiǎng)。
[0004] 在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利 用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從 而達(dá)到控制害蟲的目的。
[0005] 幾丁質(zhì)降解和代謝是昆蟲等節(jié)肢動物體內(nèi)特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其他高 等動物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲劑作用的靶標(biāo)。幾 丁質(zhì)酶在昆蟲幾丁質(zhì)的降解過程中起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開展幾丁質(zhì)酶dsRNA 在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的提供一種昆蟲舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因和其致死基因片段，由該 基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，是通過設(shè)計(jì)昆蟲 幾丁質(zhì)酶的簡并引物后，PCR擴(kuò)增獲得，命名為LdCHTIO,其長度為604bp，編碼201個(gè)氨基 酸。
[0008] 上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，是 根據(jù)SEQ ID NO: 1設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID NO :3和下游引物SEQ ID NO :4,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得。
[0009] 進(jìn)一步利用該致死片段的相關(guān)試劑盒合成dsRNA。
[0010] dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用：注射dsRNA到舞毒蛾幼蟲的體腔內(nèi)，結(jié)果表明：該 dsRNA可以特異性的沉默舞毒蛾體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶10基因的mRNA表達(dá)，導(dǎo)致舞毒蛾幼蟲因蛻 皮困難死亡。
[0011] 本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，獲得了舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的致死基因片段，及由該基因 片段合成的dsRNA，提供了針對害蟲舞毒蛾的一種生物學(xué)防治方法，有望減少農(nóng)藥的大量使 用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)收益，具有市場應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1表示6齡舞毒蛾幼蟲注射dsRNA后對其生長發(fā)育的影響。注射dsRNA的實(shí)驗(yàn) 組出現(xiàn)蛻皮困難死亡的表型（圖中，1和2為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組，3為注射DEPC處理的水 的對照組)。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因全長的獲得方法如下： (1)、PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已知的昆蟲幾丁質(zhì)酶10的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)了如下簡并性引物： 上游引物：CHTlOF 5' -GACCTBGAYTGGGARTAYCC-3'， 下游引物：CHTlOR 5'-GTCTTCRAAVGAHACCCATTGRTC-3' ； 所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[0014] (2)、舞毒蛾總RNA的獲得 選取大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取總RNA，提取總RNA 的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒。
[0015] (3)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成 cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試齊[J盒。
[0016] (4)、PCR 擴(kuò)增 以上述cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Taq酶（TIANGEN)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所擴(kuò)增的 片段進(jìn)一步克隆、測序。
[0017] (5)、序列分析 利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比 對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因。
[0018] 上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0019] 實(shí)施例2 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因致死片段的獲得方法如下： 根據(jù)實(shí)施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因的核苷酸序列，采用primerpremier5. 0 軟件設(shè)計(jì)特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID NO :3,下游引物序列為SEQ ID NO :4,所 有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成；其中，上游引物和下游引物需要針對實(shí)施例 1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)， 申請人:經(jīng)過對多個(gè)上下游引物設(shè) 計(jì)和多個(gè)基因片段的認(rèn)真篩選后，才最終確定了具有實(shí)際應(yīng)用效果的致死基因片段。
[0020] 將成功連接實(shí)施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因的重組PEASY-Tl質(zhì)粒做為模 板，PCR擴(kuò)增獲得幾丁質(zhì)酶基因致死片段，使用MicroElute Cycle Pure Kit (OMEGA)試劑 盒進(jìn)行純化。
[0021] 上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0022] 實(shí)施例3 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因致死片段的dsRNA獲得方法如下： 用實(shí)施例2獲得的幾丁質(zhì)酶10基因致死片段，按照T7RiboMAX? Express RNAi System (Promega)試劑盒說明書，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳 檢測其單一性，用酶標(biāo)儀（Thermo Scientific Multiskan GO，Thermo Fisher Scientific， USA)檢測其濃度。保存至-80°C備用。
[0023] 實(shí)施例4 舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因致死片段的dsRNA的致死舞毒蛾實(shí)驗(yàn) (1 )、舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因致死片段的dsRNA注射 選取6齡第二天大小均一、健康狀況一直的幼蟲用于注射上述合成的dsRNA。5ul規(guī) 格的微量注射器用于注射，注射時(shí)不可用力過大，側(cè)腹部作為注射點(diǎn)，注意避開氣門。注射 dsRNA的量為5Pg，并設(shè)置注射等量的DEPC處理的水的對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組各20頭。注 射完畢后，將幼蟲放置于生化培養(yǎng)箱中用購自中國林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所進(jìn)行 飼養(yǎng)(光照：黑暗時(shí)間=16h :8h，溫度26±1°C，濕度70%)。
[0024] (2)、注入dsRNA后舞毒蛾表型的觀察 幼蟲注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時(shí)地觀察。注射dsRNA舞毒蛾的實(shí)驗(yàn)組有部分幼蟲因 蛻皮昆蟲而死亡。
[0025] (3)、注入dsRNA后舞毒蛾死亡情況的觀察 注射dsRNA的舞毒蛾實(shí)驗(yàn)組死亡率為25%，這與注射DEPC處理的對照組(死亡率為 1.67%)相比，致死效果明顯。
【權(quán)利要求】
1. 一種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. -種權(quán)利要求1所述的舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因的獲得方法，其特征在于：包括如 下步驟： (1) 、PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已知的昆蟲幾丁質(zhì)酶10的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)了如下簡并性引物： 上游引物：CHTlOF 5' -GACCTBGAYTGGGARTAYCC-3'， 下游引物：CHTlOR 5'-GTCTTCRAAVGAHACCCATTGRTC-3' ； (2) 、舞毒蛾總RNA的獲得 提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒； (3) 、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成 cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試齊[J盒； (4) 、PCR 擴(kuò)增 以上述cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Taq酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所擴(kuò)增的片段進(jìn)一步 克隆、測序； (5) 、序列分析 利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比 對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 一種權(quán)利要求2所述的舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶10基因致死片段的獲得方法，其特征在 于：包括如下步驟： 根據(jù)權(quán)利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)上游引物序列為 SEQ ID NO :3,下游引物序列為SEQ ID NO :4 ;將成功連接權(quán)利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì) 酶10基因的重組PEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得幾丁質(zhì)酶10基因的致死片段，其 核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，使用MicroElute Cycle Pure Kit試劑盒進(jìn)行純化。
5. -種根據(jù)權(quán)利要求2所述的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶10基因致死片段合成的dsRNA。
6. 權(quán)利要求5所述的利用舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成的dsRNA在致死害蟲舞 毒蛾中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P7/04GK104212823SQ201410438907
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】范曉軍, 趙秋勇, 劉建紅, 張常, 糜艷霞 申請人:太原理工大學(xué)