一株枯草芽孢桿菌及其在防治牡丹根結(jié)線蟲病上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其在防治牡丹根結(jié)線蟲病上的應(yīng)用。該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)菌株SDBRM01，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8546。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SDBRM01具有菌株新穎、高效、活體菌含量高的特點(diǎn)，在離體條件下，發(fā)酵液稀釋5倍，作用48h，對線蟲的抑制率為90.3％，在盆栽條件下，枯草芽孢桿菌SDBRM01可濕性粉劑200倍防治牡丹根結(jié)線蟲病效果顯著，防治效果達(dá)到72.05％，且牡丹生長健壯，無藥害產(chǎn)生，冠重增加了11.3g/株，因而在生物防治牡丹根結(jié)線蟲病中具有重要應(yīng)用前景。
【專利說明】一株枯草芽孢桿菌及其在防治牡丹根結(jié)線蟲病上的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌菌株及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002]牡丹是我國的傳統(tǒng)名花，是山東省菏澤市重要的旅游品牌和對外交往的城市名片，同時(shí)還是農(nóng)業(yè)的六大主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，在菏澤市經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展中有著特殊的地位和作用。目前，菏澤市牡丹總面積已發(fā)展到10萬余畝，年產(chǎn)值近30億元。但是，由于根結(jié)線蟲的危害嚴(yán)重影響了牡丹的生產(chǎn)和銷售，丹皮質(zhì)量和產(chǎn)量嚴(yán)重下滑，同時(shí)根結(jié)線蟲是國內(nèi)外重要的檢疫對象，直接影響了出口貿(mào)易。近些年來，在牡丹、芍藥等花卉種植區(qū)，根結(jié)線蟲病呈逐年加重的趨勢，發(fā)病率一般在15%左右，病重地塊達(dá)30%以上，嚴(yán)重影響牡丹、芍藥的開花率和丹皮產(chǎn)量，給花農(nóng)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]根結(jié)線蟲屬于線蟲門、側(cè)尾腺口綱、墊刃目、異皮總科、根結(jié)線蟲屬。全世界已報(bào)道的根結(jié)線蟲有85種，其中在我國分布最為廣泛的是南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲等4種。根結(jié)線蟲是一種定居型內(nèi)寄生線蟲，寄生于作物、蔬菜和花卉中，其侵染性二齡幼蟲侵入寄主根系，遷移至維管束后固定取食；幼蟲持續(xù)取食，吸收植物體內(nèi)營養(yǎng)，干擾寄主根系的正常生理過程，致使寄主植物顯現(xiàn)特異性的根結(jié)病害癥狀，如根部膨大，出現(xiàn)腫瘤，破壞植物根系水分、養(yǎng)分的正常疏導(dǎo)。病株地上部分生長裳弱、矮小，有的甚至整株枯死。線蟲代謝過程中的分泌物還會(huì)刺激寄主植物的細(xì)胞和組織,導(dǎo)致植株畸形。此外，由于根結(jié)線蟲的侵染造成大量傷口，有利于土壤中植物病原菌的侵染，致使次生病害易于發(fā)生，造成農(nóng)林作物產(chǎn)量的損失和品質(zhì)下降。
[0004]防治植物寄生線蟲的方法主要有物理、化學(xué)和生物防治方法及改變栽培措施等。物理防治主要通過溫度、射線、聲波等來殺死線蟲，該方法存在很大的應(yīng)用局限性?；瘜W(xué)殺線蟲劑多為劇毒農(nóng)藥(如24-D、鐵滅克、克線磷等)，污染土壤和水體，破壞生態(tài)環(huán)境，嚴(yán)重威脅人類健康。生物方法主要是利用線蟲天敵以及寄生線蟲的真菌或細(xì)菌等來防治線蟲，但由于生物防治主體存在一定的地域性和寄主特異性，影響了不同地區(qū)、不同寄主植物的防治效果。現(xiàn)在一般采用輪作等栽培措施來降低植物寄生線蟲的發(fā)病率。而輪作并不適合牡丹種植。殺線蟲劑的作用環(huán)境大多是土壤，而土壤是一個(gè)非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其中的各種生物因素和非生物因素會(huì)影響到殺線細(xì)菌的對線蟲的作用。
[0005]目前，文獻(xiàn)報(bào)道的防治根結(jié)線蟲病的生物菌劑主要是防治番茄根結(jié)線蟲病的，且防治效果欠佳。由于牡丹為多年生落葉小灌木，番茄是一年生草本植物，兩者的生活習(xí)性相差較大，根部土壤環(huán)境不同，牡丹根系分泌物與番茄根系分泌物不同，對根際細(xì)菌對寄主植物的識(shí)別、定殖影響不同。因此，現(xiàn)有的防治番茄根結(jié)線蟲病的生物菌劑不容易在牡丹上定殖，防治效果不好。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了針對牡丹根結(jié)線蟲病進(jìn)行防治，本發(fā)明經(jīng)誘變篩選獲得一株枯草芽孢桿菌菌株SDBRM01，該菌株容易在在牡丹根系周圍定殖，且防治牡丹根結(jié)線蟲的效果好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種枯草芽孢桿菌菌株SDBRM01制備的發(fā)酵液和菌劑。
[0008]本發(fā)明所提供的菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SDBRM01，它是以從山東省壽光市田柳鎮(zhèn)王五村大棚土壤中分離獲得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SGBs-02菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外誘變(UV處理30s)的正突變株離體篩選和活體試驗(yàn)，獲得的一株對牡丹根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)殺線蟲效果的生防菌株。該菌株已于2013年12月6日保藏于中國微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC N0.8546。其具有以下微生物學(xué)特性:菌體桿狀，革蘭氏陽性菌，周生鞭毛，兼性厭氧。NA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落圓形，黃白色，平展，表面略粗糙，中間有圓環(huán)形突起，邊緣整齊。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。該菌株的16S rRNA基因序列測定結(jié)果如SEQ-1所示。
[0009]本發(fā)明枯草芽孢桿菌(B.subtilis) (SDBRMOl)CGMCC N0.8546培養(yǎng)方法或繁殖方法:
[0010]普通培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基保存。實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)采用NYBD液體培養(yǎng)基。NYBD配方:牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化鈉4.5g，水1000mL，pH 7.3。大量發(fā)酵培養(yǎng)配方(重量百分含量):黃豆粉3.0%，玉米粉3.0%，輕質(zhì)碳酸鈣0.2%，氯化鈉0.1%，其余為水，pH 7.3。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度28°C，初始pH7.3，裝液量70%，接菌量3.0%，培養(yǎng)時(shí)間30h，通風(fēng)比1:0.8。采用此培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，菌數(shù)可達(dá)85億/g。
[0011]另一方面，本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，所述可濕性粉劑通過包括以下步驟的方法制得:
[0012](I)將保存的枯草芽孢桿菌菌株SDBRM01轉(zhuǎn)移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱28°C恒溫培養(yǎng)2-3d ；
[0013](2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌SDBRM01用無菌水稀釋(每個(gè)試管斜面加入5mL無菌水)，吸取lmL，置于NB或者NYBD液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)12~18h得到種子液；
[0014](3)按3.0%比例(體積比)將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間28~32h，通風(fēng)比1:0.8(V/V)。發(fā)酵完成后，菌數(shù)可達(dá)85億/g ;
[0015](4)將枯草芽孢桿菌SDBRM01發(fā)酵液與發(fā)酵基質(zhì)按照1: 1.2~1.8的質(zhì)量比進(jìn)行混合均勻，干燥，得到枯草芽孢桿菌SDBRM01菌粉；所述發(fā)酵基質(zhì)選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種；然后加入輔料制成可濕性粉劑，優(yōu)選配方及制備工藝如下:
[0016](5)按下述重量份取各原料:干燥好的枯草芽孢桿菌SDBRM01菌粉30%;淀粉8%;十二烷基硫酸鈉8% ;羧甲基纖維素鈉0.3% ;拉開粉2% ;豆柏粉10% ;凹凸棒土余量；
[0017](6)上述原料混合均勻，控制加工溫度0_50°C，在氣流粉碎機(jī)或其它高目粉碎機(jī)，粉碎到150篩目以上水分控制在6-8% (質(zhì)量百分含量)，pH控制在7-7.5，可濕性粉劑中的枯草芽孢桿菌SDBRMOI含量為> 0.1億活菌/g。
[0018] 該可濕性粉劑可以用作生物農(nóng)藥，用于防治牡丹根結(jié)線蟲病。因此，又一方面，本發(fā)明提供枯草芽孢桿菌SDBRM01或者其發(fā)酵液或者本發(fā)明的可濕性粉劑用于具有防治牡丹根結(jié)線蟲病中的用途，同時(shí)還具有用于促進(jìn)牡丹生長的用途。
[0019]本發(fā)明還提供一種用于防治牡丹根結(jié)線蟲病的方法，所述方法包括向發(fā)生根結(jié)線蟲病的牡丹根部施用枯草芽孢桿菌SDBRM01或者其發(fā)酵液或者本發(fā)明的可濕性粉劑。
[0020]實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SDBRM01具有菌株新穎、高效、活體菌含量高的特點(diǎn)，在離體條件下，發(fā)酵液稀釋5倍，作用48h，對線蟲的抑制率為90.3 %，在盆栽條件下，枯草芽孢桿菌SDBRM01可濕性粉劑200倍防治牡丹根結(jié)線蟲病效果顯著，防治效果達(dá)到72.05%，且牡丹生長健壯，無藥害產(chǎn)生，冠重增加了 11.3g/株，因而在生物防治牡丹根結(jié)線蟲病中具有重要應(yīng)用前景。同時(shí)相比其它的防治根結(jié)線蟲病的生物菌劑，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌在土壤中，通過牡丹根系分泌物SDBRM01更容易識(shí)別牡丹根系，更容易在在牡丹根系周圍定殖，并且通過牡丹根系分泌的糖類、氨基酸以及維生素等獲取生長和繁殖所需的營養(yǎng)，因此更適合于防治牡丹的根結(jié)線蟲病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的SDBRMOI菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023]實(shí)施例1枯草芽孢桿菌菌株SDBRMOI的誘變篩選與鑒定
[0024]一、菌株的誘變及篩選
[0025](I)出發(fā)菌株:枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis SGBs-02菌株，山東省壽光市田柳鎮(zhèn)王五村大棚土壤中分離獲得。
[0026](2)培養(yǎng)基:
[0027]NA 培養(yǎng)基:牛肉膏 3g，蛋白胨 10g, NaCl 5g，瓊脂 14g，水 100mL, ρΗ7.3 ；
[0028]NB 培養(yǎng)基:牛肉膏 3g，蛋白胨 10g, NaCl 5g，水 100mL, ρΗ7.3 ；
[0029](3)誘變體準(zhǔn)備
[0030]將SGBs-02菌株斜面28°C活化培養(yǎng)24h，挑取2_3環(huán)，接種于盛有10mL的NB培養(yǎng)液的三角瓶中(250mL)，200r/min振蕩培養(yǎng)12h，作為種子液，吸取2mL種子液，接種到NYBD培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)36h，4°C保存，備用。
[0031](4) UV誘變處理
[0032]將培養(yǎng)好的菌液用無菌水稀釋成105cfu/mL，取4mL加入滅菌的培養(yǎng)皿中，于30W紫外燈，垂直距離30cm，照射30s，暗處放置15min后，致死率為87.96%。將吸取100 μ L涂NA平板，28 °C培養(yǎng)36h。
[0033](5)殺線菌株篩選
[0034] 將誘變獲得所有菌株分別活化后，接種到NB液體培養(yǎng)基中，28 V，200r/min振蕩培養(yǎng)30h，取發(fā)酵液lmL，加入30 μ L線蟲液，以無菌水為對照，28°C恒溫培養(yǎng)，48h觀察線蟲死亡情況，篩選殺線活性較強(qiáng)的菌株。
[0035](6)對牡丹根系分泌液高親和性菌株篩選
[0036]取1cm高牡丹幼苗，用蒸餾水多次沖洗后，置于裝有50mL蒸餾水的三角瓶中，密封瓶口，培養(yǎng)15d后獲得含有牡丹根系分泌物的培養(yǎng)液，將獲得具有較強(qiáng)殺線活性的菌株分別接種于含有500 μ L/皿的牡丹根系分泌液的NA平板，28°C培養(yǎng)3d，從中獲得對牡丹根系分泌液親和性強(qiáng)的菌株，通過綜合考慮殺線活性及與牡丹根系分泌物親和性，篩選獲得一株高效殺線活性，且易在牡丹根系定殖的生防菌株SDBRM01。
[0037]二、菌株鑒定
[0038](I)微生物學(xué)特性:SDBRM01菌株桿狀、具周生鞭毛，長為5-10 μ m，寬0.7-1.4 μ m，
革蘭氏染色陽性。菌株在NA和NB培養(yǎng)基上28 °C培養(yǎng)48h后，菌落圓形，平展，呈黃白色，表面不規(guī)則，中間有圓環(huán)形突起，邊緣整齊，不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。菌株表現(xiàn)菌株好氧生長。
[0039]供試菌株SDBRM01在所處理的各種溫度下，均可正常生長；強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境不適宜該菌株生長，pH5~9條件下，菌株可以正常生長；NaCl濃度在2%~10%之間，菌株生長性狀一致。氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)弱陽性，能利用檸檬酸鹽，不產(chǎn)生脲酶，不產(chǎn)H2S, VP試驗(yàn)陽性，其它特性見下表1:
[0040]表1 SDBRMOI菌株的生理生化特性
[0041]

【權(quán)利要求】
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株SDBRMOI，所述菌株的保藏編號(hào)為CGMCCN0.8546。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株SDBRMOI在防治牡丹根結(jié)線蟲病上的應(yīng)用。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株SDBRM01的可濕性粉劑。
4.權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑的制備方法，其特征是， (1)將保存的枯草芽孢桿菌菌 株SDBRM01轉(zhuǎn)移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱28°C恒溫培養(yǎng)2-3d ； (2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌菌株SDBRM01置于NB液體培養(yǎng)基或者NYBD液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)12~18h得到種子液； (3)按3.0%的體積比將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間28~32h，通風(fēng)比1:0.8(V/V);所述大量發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其重量比為:黃豆粉3.0%，玉米粉3.0%，輕質(zhì)碳酸鈣0.2%，氯化鈉0.1%，其余為水，pH 7.3 ； (4)將枯草芽孢桿菌SDBRM01發(fā)酵液與發(fā)酵基質(zhì)按照1:1.2~1.8的質(zhì)量比進(jìn)行混合均勻，干燥，得到枯草芽孢桿菌SDBRM01菌粉；然后加入輔料制成可濕性粉劑。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述可濕性粉劑的組分及重量比為:枯草芽孢桿菌SDBRMOI菌粉30% ;淀粉8% ;十二烷基硫酸鈉8% ;羧甲基纖維素鈉0.3% ;拉開粉2% ;豆柏粉10% ;凹凸棒土余量。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述發(fā)酵基質(zhì)選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種。
7.權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑在防治牡丹根結(jié)線蟲病上的應(yīng)用。
8.一種用于防治牡丹根結(jié)線蟲病的方法，其特征是，向發(fā)生根結(jié)線蟲病的牡丹根部施用權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株SDBRM01及其發(fā)酵液或者權(quán)利要求3所述的可濕性粉劑。
【文檔編號(hào)】A01G7/06GK104130958SQ201410355421
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】王清海, 季延平, 朱文成, 劉幸紅, 段春華, 劉慇 申請人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院