專利名稱：：一種根結(jié)線蟲生防微生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種根結(jié)線蟲的生防微生物及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：根結(jié)線蟲(Meloidogynesw.)是分布最廣、為害最重的植物寄生線蟲，由根結(jié)線蟲在全世界農(nóng)作物上造成的損失高達(dá)1000億美元(OkaY,KoltaiH,Bar-EyalΜ,etal.2000.Newstrategiesforthecontrolofplant-parasiticnematodes.PestManag.Sci,56，983-988.)。根結(jié)線蟲的主要種類有南方根結(jié)線蟲CKi/⑶卵iia)、花生根結(jié)線蟲CMarmaria)、爪哇根結(jié)線蟲CK及北方根結(jié)線蟲CMAa/^a)。煙草根結(jié)線蟲病在我國(guó)煙區(qū)普遍發(fā)生，危害日趨嚴(yán)重，僅云南省發(fā)病面積高達(dá)40余萬(wàn)畝，造成煙葉減產(chǎn)30%-50%，已成為煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一(祝明亮，雷麗萍.2008.煙草微生物學(xué).科學(xué)技術(shù)出版社，北京，P1-384.)。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)根結(jié)線蟲病的防治主要依賴于化學(xué)防治，用吠喃丹、克線丹等劇毒或高殘留的化學(xué)殺線蟲劑，由于多年使用，已產(chǎn)生抗藥性，防治效果逐年下降，而且常造成嚴(yán)重的環(huán)境污染、農(nóng)田土壤質(zhì)量退化等現(xiàn)象(AbawiGS,WidmerTL.2000.Impactofsoilhealthmanagementspracticesonsoilbornepathogens,nematodeandrootdiseasesofvegetablecrops.ApplSoilEcol,15⑴37-47)。由于化學(xué)殺線劑毒性強(qiáng)、殘留高，對(duì)環(huán)境污染大，目前絕大多數(shù)化學(xué)殺線劑已被禁用。隨著人類環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，以及發(fā)展綠色煙葉、有機(jī)煙葉的需要，生物防治已經(jīng)成為防控根結(jié)線蟲的主導(dǎo)措施之ο目前，利用生防真菌開發(fā)線蟲生物農(nóng)藥已有商業(yè)化產(chǎn)品，并在局部地區(qū)用于根結(jié)線蟲的防治，如以厚垣輪枝霉(Verticilliumchlamydosporiuni)開發(fā)的我國(guó)第一個(gè)線蟲生防商品制劑“線蟲必克”，以淡紫擬青霉Bhci/ms)開發(fā)的系列產(chǎn)品。然而，目前這類以真菌為生防菌的線蟲生防菌劑存在的最大問(wèn)題是防效低且不穩(wěn)定。主要原因是真菌生防菌在土壤中普遍受到土壤抑真菌作用(LockwoodJL.1977.Fungistasisinsoil.BiologicalReviews,52(1):1-36.)的影響，生防菌的萌發(fā)率很低，一般在0-30%之間，很少超過(guò)50%，很難在土壤中建立達(dá)到控制靶標(biāo)對(duì)象所需的種群密度。這類生防菌在根際的定殖能力已經(jīng)成為阻礙其產(chǎn)品大面積推廣應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。植物內(nèi)生菌(Plantendophyte)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物，包括植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌(StoneJK，BaconCW.2000.Anoverviewofendophyticmicrobes:endo-phytismdefined.BaconCW,WhiteJFJr.MicrobialEndophytes.NewYork:MarcelDekkerjP3-9)。植物內(nèi)生細(xì)菌易于定殖在植物體內(nèi)，相對(duì)于植物外生生防微生物，在定殖方面更具優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容3本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種根結(jié)線蟲的生防微生物及其應(yīng)用方法。殺線蟲鞘氨醇桿菌QSphingobacteriumnematocida)ZY-71-1菌株系本專利申請(qǐng)人從煙草紅花大金元品種新鮮葉片中分離、鑒定的一種植物內(nèi)生細(xì)菌新物種。該微生物通過(guò)產(chǎn)生活性有機(jī)揮發(fā)物毒殺線蟲，在煙草根際有很好的定殖能力，該種微生物對(duì)根結(jié)線蟲的生防特性和效果未公開報(bào)道。本發(fā)明從煙草內(nèi)生菌中篩選具有工業(yè)化生產(chǎn)前景的菌株，為煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中根結(jié)線蟲的防治提供一種具有較好防治效果的生防微生物。本發(fā)明的根結(jié)線蟲生防微生物是殺線蟲鞘氨醇桿菌iSphingobacteriimnematocida)ZY_71_1菌株，該菌株已于2011年1月14日保存于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏號(hào)CGMCCNo.4553。SphingobacteriumnematocidaZY-71-1菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g,NaCl5g，瓊脂20g，補(bǔ)水至1000ml,pH6.8)上，菌落呈黃色，圓形，表明濕潤(rùn)，邊緣凸起，細(xì)胞為桿狀，直徑0.4-0.8μπι，*1.0-1.5μm，孢子不游動(dòng)，革蘭氏陰性。該菌株在10°C至40°C的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度37°C;在pH6.0到9.0的范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)PH為7.0；可以在濃度為0-3%WNaCl(w/v)范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為0-1%。利用引物5，-GGTTACCTTGTTACGACTT_3，，5，_AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’經(jīng)PCR擴(kuò)展該菌株的16SrRNA基因，獲得的序列提交到GeneBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)，其序列號(hào)為JF731241，此序列是鑒定該菌株的主要特征依據(jù)。利用本發(fā)明的ZY-71-1菌株可用于制備防治煙草根結(jié)線蟲病菌劑，該菌劑為可濕性粉劑，是通過(guò)以下方法制備的經(jīng)培養(yǎng)獲得的ZY-71-1菌體及其代謝物作為原藥與適量的硅藻土、木鈉、K12、蔗糖、海藻酸鈉混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可濕性粉劑，菌劑需保證ZY-71-1的活菌數(shù)含量在1XIO9個(gè)/g以上。利用ZY-71-1菌株制備的可濕性粉劑對(duì)防治煙草根結(jié)線蟲病有很好的防治效果。能用于漂浮育苗基質(zhì)處理，移栽期和成熟期。施用時(shí)可將ZY-71-1菌劑與煙草育苗基質(zhì)混合使用，也可在移栽時(shí)施入煙草根際周圍，或在成熟期兌水灌根。對(duì)病害發(fā)生嚴(yán)重田塊，移栽期和成熟期分別施用一次效果最好。^MSphingObacteriumnematocidaZY-71-1菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無(wú)殘留、對(duì)人畜安全的特點(diǎn)，是煙草農(nóng)業(yè)種植中防治根結(jié)線蟲病的高效生物農(nóng)藥。具體實(shí)施例方式1.本發(fā)明中ZY-71-1的培養(yǎng)及菌劑制備ZY-71-1菌株試管斜面種子培養(yǎng)將該菌株的菌體接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上，15-40°C下培養(yǎng)1-5天后獲得斜面種子，適宜的培養(yǎng)條件是37°C下培養(yǎng)2天。ZY-71-1菌株液體種子的培養(yǎng)將斜面種子接種到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基不添加瓊脂)中，15-40°C，50-350rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2-7天。最適培養(yǎng)條件為37°C，200rpm條件下培養(yǎng)3d。ZY-71-1菌株在發(fā)酵罐中的大量培養(yǎng)將液體種子按1-5%(V/V)的比例接入發(fā)酵罐中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在20-1000升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件控制在溫度^-40°C，攪拌速度150-250rpm，發(fā)酵時(shí)間2_3d。ZY-71-1菌株可濕性粉劑的制備經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的ZY-71-1菌體及其代謝物作為原藥與適量的硅藻土、木鈉、K12、蔗糖、海藻酸鈉混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可濕性粉劑。菌劑需保證ZY-71-1的活菌數(shù)含量在IXIO9個(gè)/g以上。2.ZY-71-1菌株發(fā)酵液對(duì)煙草根結(jié)線蟲幼蟲和卵的毒殺活性在三分隔塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，其中一隔加入按上述方法制備的ZY-71-1菌株液體種子發(fā)酵液3ml；其它兩分隔內(nèi)倒入水瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂20g，水1000ml)，冷卻后在培養(yǎng)基表面上分別加入煙草根結(jié)線蟲二齡幼蟲約500條，卵約300粒，培養(yǎng)皿用封口膜封邊。用等體積的無(wú)菌水替代ZY-71-1菌株發(fā)酵液做對(duì)照。在下放置24h后，統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡數(shù)并計(jì)算死亡率；放置7d后統(tǒng)計(jì)卵的孵化率。幼蟲死亡率=死亡線蟲數(shù)+計(jì)數(shù)線蟲數(shù)X100%校正死亡率=處理死亡率-對(duì)照死亡率孵化率=孵化卵數(shù)+計(jì)數(shù)卵數(shù)X100%校正孵化率=對(duì)照孵化率-處理孵化率平板測(cè)定結(jié)果表明，ZY-71-1菌株是通過(guò)產(chǎn)生活性揮發(fā)性有機(jī)物毒殺線蟲。在ZY-71-1發(fā)酵液處理中，煙草根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率為100%，扣除對(duì)照中3.5%的幼蟲死亡率，ZY-71-1對(duì)煙草根結(jié)線蟲二齡幼蟲的致死率高達(dá)96.5%。在ZY-71-1發(fā)酵液處理中，煙草根結(jié)線蟲卵的孵化率為0，對(duì)照中卵的孵化率為94.5%，ZY-71-1對(duì)煙草根結(jié)線蟲卵的致死率高達(dá)94.5%ο3.ZY-71-1菌株可濕性粉劑防治煙草根結(jié)線蟲病的溫室試驗(yàn)供試菌劑活菌數(shù)為1XIO9個(gè)/g的ZY-71-1可濕性粉劑。煙草品種紅花大金元。供試線蟲花生根結(jié)線蟲(Iarenaria).試驗(yàn)方法烤煙漂浮育苗時(shí)，取20gZY-71-1可濕性粉劑用300ml自來(lái)水稀釋后與Ikg煙用育基質(zhì)混勻后裝入育苗盤并播入煙草種子，其余操作和管理按烤煙常規(guī)漂浮育苗方法進(jìn)行。待煙苗長(zhǎng)至5-6片葉時(shí)，在直徑為15cm的花缽內(nèi)裝入250g沙土，250g腐殖土，5g菌劑，混勻后每一花缽移栽一株煙苗，并在煙根附近接入約2000條花生根結(jié)線蟲二齡幼蟲。移栽30d后每煙株用5g菌劑兌水IOOml灌根?？瞻讓?duì)照用等體積的自來(lái)水替代菌劑，每處理五盆、三個(gè)重復(fù)。肥水管理按常規(guī)方法進(jìn)行。移栽后在20-28°C的溫室內(nèi)生長(zhǎng)90天時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)病率和根結(jié)指數(shù)。發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)X100%根結(jié)指數(shù)=[Σ(各級(jí)植株數(shù)X級(jí)值)]+(調(diào)查總株數(shù)Χ4)X100(方仲達(dá).2007.植病研究方法，第三版.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，pp.324-325)試驗(yàn)結(jié)果空白對(duì)照的發(fā)病率為10096，根結(jié)指數(shù)為91.67。ZY-71-1可濕性粉劑處理的發(fā)病率為17.3%，根結(jié)指數(shù)為21.34，與對(duì)照比較，發(fā)病率下降82.7%，根結(jié)指數(shù)下降70.33，顯示出ZY-71-1對(duì)煙草根結(jié)線蟲病良好的防治效果。權(quán)利要求1.一種根結(jié)線蟲生防微生物，其特征在于所用的生防微生物為殺線蟲鞘氨醇桿菌(.Sphingobacteriumnematocida)Ti-l\-\菌株，該菌株2011年1月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)=CGMCCNo.4553。2.一種如權(quán)利要求1所述的根結(jié)線蟲生防微生物的應(yīng)用，其特征在于所述ZY-71-1菌株作為制備防治煙草根結(jié)線蟲病菌劑的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述根結(jié)線蟲生防微生物的應(yīng)用，其特征在于防治煙草根結(jié)線蟲病菌劑為可濕性粉劑，是通過(guò)以下方法制備的經(jīng)培養(yǎng)獲得的ZY-71-1菌體及其代謝物作為原藥與硅藻土、木鈉、K12、蔗糖、海藻酸鈉混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可濕性粉劑，菌劑需保證ZY-71-1的活菌數(shù)含量在IXIO9個(gè)/g以上。全文摘要本發(fā)明涉及一種根結(jié)線蟲生防微生物及其應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的微生物為殺線蟲鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)ZY-71-1菌株，于2011年1月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.4553。ZY-71-1菌株的16SrRNA基因序列(此序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列號(hào)為JF731241)是鑒別該菌株的主要特征依據(jù)。本發(fā)明的微生物菌體及其代謝產(chǎn)物，能與農(nóng)藥常規(guī)吸附載體和助劑制成ZY-71-1可濕性粉劑生防菌劑。該菌劑對(duì)煙草根結(jié)線蟲病有很好的防治效果。本發(fā)明的生防菌劑具有成本低、防效高、無(wú)殘留、對(duì)人畜安全的特點(diǎn)，是控制根結(jié)線蟲病的高效生物農(nóng)藥。文檔編號(hào)C12N1/20GK102212498SQ20111013723公開日2011年10月12日申請(qǐng)日期2011年5月26日優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日發(fā)明者周漢平,奚家勤,宋紀(jì)真,尹啟生,張仕祥,王廣山,王建偉,薛超群申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院