防治植物病害的生防菌株g68及其菌劑制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了防治植物病害的生防菌及其菌劑制備方法和應(yīng)用。該生防菌命名為Bacillus?subtilisG68，保藏號CGMCC?NO.8978；該生防菌菌劑的制備方法為將活化后的菌株G68接種于NYBE培養(yǎng)液培養(yǎng)22～26h獲得種子液，將種子液接種于含0.08～0.12mMMnSO4的NYBE發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)70～74h獲得發(fā)酵液，即為生防菌菌劑；含菌株G68的生防菌劑可促進植物種子萌發(fā)，加速植物生長，且對番茄立枯病和早疫病病害防效分別達53.8%和60.1%；菌株G68具有抗菌譜廣，效果穩(wěn)定，制備成本低，應(yīng)用方法簡單，環(huán)境友好，無毒害等特點，在植物病害防治方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】防治植物病害的生防菌株G68及其菌劑制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及防治植物病害的生防菌及其菌劑制備方 法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物的病害防治問題在農(nóng)業(yè)種植中相當(dāng)重要。據(jù)報道， 我國糧食作物每年因病害問題造成的損失至少有1〇%~15%。農(nóng)作物病害的發(fā)生往往使國家 經(jīng)濟和人民生活遭受嚴(yán)重?fù)p失。植物病害防治的方法有植物檢疫、抗病育種、農(nóng)業(yè)防治、化 學(xué)防治、物理和機械防治和生物防治等。
[0003] 選育和利用抗病育種的方法是防治病害發(fā)生的有效途徑。然而，抗病品種在大面 積推廣后容易在幾年內(nèi)失去其抗病性而成為感染品種。化學(xué)防治因其生產(chǎn)簡便、價格便宜、 特別是見效快等優(yōu)點，在植物病害的防治中一直占有主要地位，而被廣泛應(yīng)用。但使用不 當(dāng)，則會引起植物藥害，殺害有益微生物，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，高濃度的農(nóng)藥殘留還會 發(fā)生人、畜中毒，環(huán)境污染等問題。生物防治的研究從20世紀(jì)30年代開始。生物防治具有 許多優(yōu)于化學(xué)防治的特點，其只針對病原微生物，不會殺死有益微生物，而且對人、畜安全， 不會造成環(huán)境污染。因此，生物防治正成為植物病害防治的重要方法，國內(nèi)外對生物防治的 研究越來越多，該防治方法具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 芽孢桿菌是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌，其生理特征多樣，分 布廣泛，極易分離培養(yǎng)。該菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多 種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。用芽孢桿菌制備生防制劑防治植物 病害的研究成為國內(nèi)外研究的熱點。然而不同菌株的抑菌譜、抑菌作用、抑菌機理以及抑菌 效果的穩(wěn)定性等亦有較大差異。因此，篩選高效、廣譜、效果穩(wěn)定的芽孢桿菌仍是生物防治 的一個研究熱點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，針對目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)植物病害防治中大量使用化學(xué)殺菌劑，造 成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，本發(fā)明提供了一種高效、廣譜、效果穩(wěn)定及環(huán)境友好的植物 病害生防菌菌株G68。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株新菌種：枯草芽孢桿菌G68。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述菌株在植物病害防治過程中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的再一個目的在于提供一種含有 sMiihsGes的植物病害防治 劑。
[0009] 本發(fā)明的再一個目的在于提供生防菌株菌劑的制備方法。 [0010] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種植物病害生防菌株G68,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌你2014年3 月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC NO. 8978,建議的分類 命名為 sMiihiGeS，已于2014年3月28日鑒定保藏的菌株是存活的。
[0011] 上述生防菌株在植物病害防治過程中的應(yīng)用。
[0012] 進一步的，上述的植物病害為植物細(xì)菌或真菌病害。
[0013] 一種植物病害防治劑，其含有上述植物病害生防菌株sMii^sGeS。
[0014] 生防菌株菌劑的制備方法，包括以下步驟：將權(quán)利要求1 所述的生防菌株G68接種于LB平板在29?31°C條件下活化，將活化后的生防菌株G68接種 于NYBE培養(yǎng)液，29?31°C，105?115 r/min條件下培養(yǎng)22?26h，獲得種子液；將種子液 按2. 5?3. 5%的接種量接種于含0. 08?0. 12 mM MnS04的NYBE發(fā)酵培養(yǎng)基，36?38°C， 190?210r/min條件下培養(yǎng)70?74 h，獲得發(fā)酵液，即生防菌株ifeci77w5· 菌劑。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明的生防菌劑制備過程簡單，成本較低，可替代或減少對化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用，減少 農(nóng)藥殘留，降低農(nóng)民農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本。該菌劑為生物產(chǎn)品，無毒害，無環(huán)境污染，有利于無公害 作物的生產(chǎn)及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0016] 2)本發(fā)明的生防菌株G68在試驗室平板拮抗試驗中表明：生防菌株G68可對番茄 立枯病、番茄早疫病、小麥赤霉病、玉米炭疽病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黃萎病、油菜 菌核病等多種植物真菌和番茄青枯病等植物細(xì)菌病原菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果，具有較 廣的抗菌譜。并且經(jīng)多次傳代培養(yǎng)，該菌株抗病效果穩(wěn)定。
[0017] 3)本發(fā)明的生防菌株G68在溫室試驗結(jié)果中表明：含本發(fā)明所述生防菌株G68的 生防菌劑可以促進種子萌發(fā)及作物生長，且該生防菌劑有效抑制了病原菌的生長，對于番 爺立枯?。?PAizoc5·〇7<3/?Υ)和早疫病C47 temaria )病害均表現(xiàn)出顯著 的防治效果，防效分別可達53. 8%和60. 1%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為生防菌株G68抑制番爺立枯病病原菌5·〇/<3/?Υ)平板拮抗試 驗； 圖2為生防菌株G68抑制番爺早疫病病原菌平板拮抗試 驗。

【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 實施例1 一、生防菌株G68的分離、篩選和鑒定 一種植物病害生防菌株G68,命名為 sMiihiGeS，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè) 資源與環(huán)境研究所有機固體廢棄物處理基地的堆肥中分離得到。其具體分離、篩選、鑒定方 法如下： (1)生防菌株G68的分離 稱取10. 0 g混合均勻的堆肥樣品，加入90 ml無菌水，30°C，180r/min，振蕩30 min,將 菌液依次稀釋10' 10' 10' 10' 10' 10' 1(Γ7倍，吸取適當(dāng)?shù)南♂尵鷳乙?稀釋10' 10' 1〇_7倍的菌液）100 μι均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，每個稀釋度重復(fù)三次，于3〇°c恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)l~2d。按照細(xì)菌形狀、大小、色澤等生理性狀的不同，挑取單菌落再涂平板直到 獲得單一形態(tài)的菌株，最后通過鏡檢，進一步觀察其形態(tài)，確為單一形態(tài)即為純化，純化后4 °c冷藏備用。
[0021] (2)生防菌株G68的篩選 采用平板拮抗試驗方法進行生防菌株的篩選，吸取濃度為IX l〇5CFU/ml的病原菌菌液 100 μ?分別放入LB培養(yǎng)基(細(xì)菌）或PDA培養(yǎng)基(真菌）平板中涂布均勻，利用無菌打孔器 在平板上打4個孔，每孔中分別注入在30°C培養(yǎng)24h的不同分離菌株的培養(yǎng)液、發(fā)酵上清液 (6000 r/min離心30min去除菌體)、無菌水及ImM的放線菌酮80 μ?，每個處理重復(fù)三次。 30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng):Γ5 d后，觀察有無抑菌圈，計算抑菌活性。
[0022] 抑菌活性用抑菌圈直徑表示：抑菌圈直徑=透明圈直徑-孔徑（8 mm)。
[0023] 將具有抑菌活性的菌株在LB平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)10次（每隔7d -次），測定每 次傳代培養(yǎng)菌株的拮抗穩(wěn)定性。
[0024] 根據(jù)對植物病原菌番茄立枯病、番茄早疫病、番茄青枯病、小麥赤霉病、玉米炭疽 病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黃萎病、油菜菌核病等的抑菌活性以及傳代后抑菌活性 的穩(wěn)定性，篩選出一株高效、廣譜、效果穩(wěn)定的抗植物真菌和細(xì)菌病原菌的菌株，將菌株純 化后，用50%的甘油保存于~70°C超低溫冰箱。
[0025] (3)生防菌株G68的鑒定 經(jīng)形態(tài)、染色、生理生化反應(yīng)及分子生物學(xué)鑒定為
[0026] a.生防菌株G68的菌落形態(tài)及菌體特征 在LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)較小、邊緣不整齊、表面無凸起、較濕潤、不透明，呈乳白 色。菌體細(xì)胞呈短桿狀、染色均勻，革蘭氏陽性菌、中生芽孢、周生鞭毛。
[0027] b.本發(fā)明生防菌株G68的生理生化特征 生防菌株G68的生理生化特征為：需氧性，葡萄糖發(fā)酵型，接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還 原、酪朊水解、明膠水解、糖醇類發(fā)酵、M. R.和V-P試驗結(jié)果為陽性；檸檬酸鹽水解、纖維素 分解和酪氨酸水解試驗結(jié)果為陰性(如表1所示)。
[0028] 表1生防菌株G68的生理生化特征

【權(quán)利要求】
1. 一種防治植物病害的生防菌株G68,保藏在中國普通微生物菌 種保藏管理中心，其保藏號為CGMCC NO. 8978。
2. 權(quán)利要求1所述的生防菌株G68在植物病害防治過程中的應(yīng) 用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的植物病害為植物細(xì)菌或真菌病害。
4. 一種植物病害防治劑，其特征在于：所述防治劑中含有權(quán)利要求1所述的植物病害 生防菌株 G68。
5. 權(quán)利要求1所述的生防菌株feci/AAs· G68菌劑的制備方法，其特征在于： 包括以下步驟：將權(quán)利要求1所述的生防菌株G68接種于LB平板在29?31°C條件下活 化，將活化后的生防菌株G68接種于NYBE培養(yǎng)液，29?31 °C，105?115 r/min條件下培養(yǎng) 22?26h，獲得種子液；將種子液按2. 5?3. 5%的接種量接種于含0. 08?0. 12 mM MnS04 的NYBE發(fā)酵培養(yǎng)基，36?38°C，190?210r/min條件下培養(yǎng)70?74 h，獲得發(fā)酵液，即生 防菌株 G68 菌劑。
【文檔編號】A01P1/00GK104152372SQ201410247901
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】顧文杰 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所