擬南芥抗逆相關(guān)基因AtZAT6及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬南芥抗逆相關(guān)基因 AtZAT6 及制備方法和應(yīng)用，從擬南芥中獲得一種分離的基因，其序列為SEQIDNo．1所示核苷酸序列。擬南芥 AtZAT6 基因的克?。涸谝旱袑⒅参镉啄廴~片樣品研磨，利用Trirol提取試劑盒進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于雙蒸水中。去除殘留的DNA。獲得的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。一種 AtZAT6 基因在增強(qiáng)植物干旱和鹽抗性中的應(yīng)用。通過該基因的過表達(dá)，可以人工創(chuàng)造抗性增強(qiáng)材料，通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得有效的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，為研究基因功能提供了一個(gè)有效的方法。通過比較OX- AtZAT6 超表達(dá)株與野生型擬南芥的抗性，發(fā)現(xiàn)OX- AtZAT6 超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理?xiàng)l件下的存活率是野生型擬南芥的兩倍以上。
【專利說明】擬南芥抗逆相關(guān)基因AtZAT6及制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程和生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體涉及一種增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫抗性的為艱基因，同時(shí)還涉及一種擬南芥抗逆相關(guān)基因的制備方法，還涉及一種擬南芥抗逆相關(guān)基因AtZAT6在增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫抗性中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]再全球氣候變化條件下，溫度的升高和降水格局的變化，各種環(huán)境因子脅迫單獨(dú)或聯(lián)合的作用將導(dǎo)致作物大幅度減產(chǎn)，并引發(fā)自然生態(tài)系統(tǒng)退化。在我國(guó)約有1/3的土地處于干旱區(qū)。干旱的威脅不只發(fā)生在北方干旱半干旱地區(qū)，年降水量大的南方濕潤(rùn)半濕潤(rùn)地區(qū)也會(huì)因雨量時(shí)空分布不均而經(jīng)常發(fā)生強(qiáng)季節(jié)性干旱。土壤干旱嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量，帶來了很大的危害，所以研究植物耐干旱機(jī)制，從而提供能提高植物耐干旱的各種措施或者直接培育耐干旱品種，顯然意義重大。
[0003]非生物脅迫(包括干旱、鹽和冷害等)是植物生活史中不可避免的不利因素，這些逆境脅迫因子單獨(dú)或者共同作用從而制約著農(nóng)作物的生產(chǎn)。然而，植物由于自身不能移動(dòng)，當(dāng)遭受逆境環(huán)境時(shí)只能應(yīng)答外界脅迫，從而進(jìn)化出一系列復(fù)雜而精密的調(diào)控機(jī)制，來感受外部脅迫并傳遞信號(hào)，最終在分子、細(xì)胞和整個(gè)植株水平形成應(yīng)激性反應(yīng)。各種逆境脅迫首先被植物細(xì)胞膜上的感應(yīng)器所感受，然后信號(hào)被傳導(dǎo)到下游并且造成第二信使的產(chǎn)生，進(jìn)而引起下游的一系列生理反應(yīng)與基因表達(dá)調(diào)控，形成保護(hù)性反應(yīng)。
[0004]而在植物脅迫反應(yīng)過程中，眾多的轉(zhuǎn)錄因子承上啟下，起著至關(guān)重要的作用。鑒定和利用關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于改造農(nóng)作物，提高抗性是非常重要的，其中一個(gè)被利用的轉(zhuǎn)錄因子家族就是鋅指蛋白家族。鋅指蛋白是真核生物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與到基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA的運(yùn)輸、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞支持、蛋白折疊、染色質(zhì)修飾等過程中。自從在矮牽牛中分離了植物中第一個(gè)鋅指蛋白基因EPFl (ZPT2-1)以來，已經(jīng)在擬南芥、矮牽牛、水稻、大豆、小鹽芥和棉花等高等植物中陸續(xù)分離了近百個(gè)此類基因，這類基因廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答反應(yīng)。因此，探究植物對(duì)各種脅迫的抗性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的抗性基因具有深遠(yuǎn)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在于提供了一種增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽抗性的擬南芥為艱基因，該基因的組成型表達(dá)可以增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性，應(yīng)用于抗性育種。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種擬南芥基因的制備方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，根據(jù)SEQ ID N0.1所示核苷酸序列，獲得基因全長(zhǎng)序列的電子克隆后，應(yīng)用簡(jiǎn)單的PCR方法即可以獲得該基因的序列。
[0007]本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種擬南芥基因在增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫抗性中的應(yīng)用。擬南芥為艱基因的超表達(dá)顯著增強(qiáng)了植物對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性。
[0008]為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種擬南芥基因的制備方法，其步驟是:
1、擬南芥基因的克隆:
在液氮中將植物幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol提取試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I(購(gòu)自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測(cè)儀(DM 650 BECKMAN,MSA)分別檢測(cè)RNA在260納米和280納米光吸收值，結(jié)合1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA分裝后于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009]根據(jù)擬南芥公共數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR (http://www.arabidopsis.0rg/)中擬南芥基因序列(At5g043400)，在該基因基因CDS (Coding seq μ ence，編碼序列，以下相同)起始密碼子和終止密碼子同源區(qū)域設(shè)計(jì)引物(序列為F-5’ -TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’-CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’)，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物為全長(zhǎng)序列。以擬南芥的葉片的cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。回收并純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，連接到pEASY_T載體(購(gòu)自武漢群駿生物科技有限公司，詳見遺傳資源表)上，用凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (本實(shí)驗(yàn)室保存，詳見遺傳資源表)，涂布于含有氨芐青霉素50 yg/mL的LB固體(配方如下:分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C,6.859X104 Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三個(gè)，做菌落PCR檢測(cè):所用引物序列為:M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3; M13R 5’ -GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同)，反應(yīng)體系為:10XTaq 酶反應(yīng)緩沖液 2 μ 1,25 mM MgCL2 1.2 μ 1、2 mM dNTP 1.5 μ 1、10μΜ引物0.2 μ 1、0.3單位Taq酶，加無菌水至20 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性5 min，94°C45 s、55°C 45 s、72°C 2 min 32 循環(huán)，72°C延伸 5 min (以下相同)。以 M13F/ M13R 為引物(前面已述)，將連接過的PEASY-T載體(購(gòu)自武漢群駿生物科技有限公司，詳見遺傳資源表)進(jìn)行序列測(cè)定，分析結(jié)果，獲得了一種分離的基因，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0010]2 ,AtZAT6基因超表達(dá)載體(OX的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化: 構(gòu)建的重組載體是將已構(gòu)建的質(zhì)粒PBM (本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F，
Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance of Arabidopsis tohydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)上的目的基因用前期克隆得到的基因替換而來。為完成此目的，首先用Srml/Xhol I酶切克隆的基因片段，同時(shí)用Smal/Xhol酶切pBM質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX,Wang RY, Ren F， Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance ofArabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)。酶切反應(yīng)在30度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個(gè)小時(shí)之后，用1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測(cè)。將酶切后的基因片段和pBIM質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX,Wang RY, Ren F， Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance ofArabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。把基因片段比 pBIM質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F，Liu J, Cheng J, Lu YT (2005)AtGLBI enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress.PlantCell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)載體片段按3:1 (摩爾濃度比)的比例混合樣品，加入T4 DNA連接酶5個(gè)單位，10X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 yg/mL)固體LB平板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為(K_AtZAT6，并對(duì)獲得的載體進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證準(zhǔn)確性。載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0011]然后利用凍融法(前面已述)將轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 (本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F，Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances thetolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46:1309-1316.詳見遺傳資源表)，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素和利福平(50 μ g/mL)的LB固體(配方如下:分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104 Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三個(gè)，做菌落PCR檢測(cè)(前面已述)。
[0012]本發(fā)明所使用的研究基因功能的重組植物表達(dá)載體，含有所述基因的編碼區(qū)核苷酸序列，組成型35S啟動(dòng)子(CaMV35S)可以增強(qiáng)基因的表達(dá)水平。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的卡那霉素抗性標(biāo)容易檢測(cè)。通過這個(gè)載體轉(zhuǎn)化擬南芥可以獲得菌核病抗性增強(qiáng)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。
[0013]3,AtZA炻基因超表達(dá)載體(OX-AtZAT6)的遺傳轉(zhuǎn)化:
參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(Zhang X.R.et al.Agrobacteri μ m-mediatedtransformat1n of Arabidopsis thaliana μ sing the floral dip method.Nat μ re,2006,1:1-6)。制備含有構(gòu)建好載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101 (本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX,Wang RY, Ren F， Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance ofArabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEKOL 1300)于276 nm納米波長(zhǎng)下檢測(cè)的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在1.6-2.0之間時(shí)取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000 g離心10 min,棄上清,將沉淀懸浮于等體積的5%鹿糖(質(zhì)量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet L-77 (購(gòu)自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個(gè)花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15s，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個(gè)黑色塑料袋包好，放在生長(zhǎng)箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。培養(yǎng)一個(gè)月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子播在混有營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中(營(yíng)養(yǎng)液成份為:每升含5ml I M KNO3, 2 ml I M Ca (NO3)2.4H20，2 ml I M MgSO4.7 H2O, 2.5 ml 20 mM Fe.EDTA,
2.5 ml I M磷酸緩沖液(pH5.5)，1 ml MS微量元素);4°C春化一星期，在21_22°C的生長(zhǎng)間中自然生長(zhǎng)兩星期左右，待到達(dá)四葉期的早期進(jìn)行卡那霉素(50 μ g/ml)的噴灑第一次，一星期之后進(jìn)行第二次噴灑。兩次噴灑后對(duì)存活的綠苗進(jìn)行PCR陽性檢測(cè)，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗。
[0014]A,AtZAT6基因超表達(dá)載體(OX轉(zhuǎn)化苗的篩選及抗性鑒定:
根據(jù)以上卡那霉素(50 μ g/ml)噴灑篩選，轉(zhuǎn)基因Tl代(第一代)植株在苗期(播種后10 天)，得到成活植株。米用CTAB 法(M.G.Murray and ff.F.Thompson, Rapid isolat1nof high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Research, 1980, Vol.8, N0.19 4321-4326，以下相同)提取篩選后存活的擬南芥以及野生型擬南芥葉片DNA。根據(jù)表達(dá)載體上外源基因序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)(序列為F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’ -CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’)，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為 717bp。將經(jīng)過PCR檢測(cè)的陽性植株編號(hào)并標(biāo)記。
[0015]根據(jù)獲得的上述核苷酸序列(SEQ ID N0.1)，通過構(gòu)建超表達(dá)植物重組載體(OX-^ tZA艱)，轉(zhuǎn)化擬南芥， 申請(qǐng)人:獲得J ?為艱基因顯著升高的轉(zhuǎn)基因擬南芥(請(qǐng)見圖2)。進(jìn)一步通過分析過表達(dá)植株(與野生型擬南芥在正常情況下(23°C光照培養(yǎng)室內(nèi)保濕培養(yǎng)，每天16 h光照，8 h黑暗)，干旱和鹽脅迫處理情況下的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株(OX相對(duì)于野生型表現(xiàn)為明顯的抗旱和抗鹽性(請(qǐng)見圖3)。從而證明了 AtZAm在擬南芥應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫條件下起著重要作用。
[0016]一種擬南芥基因在增強(qiáng)植物(擬南芥)對(duì)干旱和鹽脅迫抗性中的應(yīng)用，其步驟是:
具體操作步驟和實(shí)驗(yàn)效果如下所述:
A、將擬南芥Ol-AtZATe超表達(dá)株和野生型種子4°C春化一星期，然后播種于23°C光照培養(yǎng)室內(nèi)保濕培養(yǎng)(每天16 h光照，8 h黑暗)14天，14天內(nèi)每3天澆一次營(yíng)養(yǎng)液(營(yíng)養(yǎng)液成份為:每升含 5ml I M KNO3, 2 ml I M Ca(NO3)2.4H20, 2 ml I M MgSO4.7 H2O, 2.5 ml 20mM Fe.EDTA, 2.5 ml I M 磷酸緩沖液(pH5.5)，I ml MS 微量元素)；
B、選取14天的擬南芥苗(包括01-AtZAT6超表達(dá)株和野生型)平均分成三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)21天，具體實(shí)驗(yàn)如下:
1)、第一組擬南芥苗(包括Ol-AtZATe超表達(dá)株和野生型)按照正常情況澆水21天(SP每三天澆水一次，保持土壤濕潤(rùn))；
2)、第二組擬南芥苗(包括超表達(dá)株和野生型)澆鹽水21天(即每三天澆150mmol/L氯化鈉一次)；
3)、第三組擬南芥苗(包括(K-AtZAT6超表達(dá)株和野生型)停止?jié)菜?1天。
[0017]以上脅迫處理21天后，觀察植株生長(zhǎng)情況和存活率。如圖3所示，0X-AtZAT6超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理情況下的生長(zhǎng)狀況和存活率都要明顯好于野生型。具體表現(xiàn)為野生型擬南芥在以上干旱和鹽脅迫處理21天，只有30%左右的植株可以存活，而OX-A tZAT6超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理21天還有60%-90%的植株可以存活，即OX-Atzm超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理?xiàng)l件下的存活率是野生型擬南芥的兩倍以上。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
乂力為艱基因可以增強(qiáng)植物(擬南芥，下同)對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性。通過基因工程技術(shù)升高基因的表達(dá)能夠增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性，作為基因工程的候選基因用于分子育種。
[0019]1、通過克隆該基因，研究該基因在植物抗干旱和鹽脅迫中的作用，明確了該基因具有增強(qiáng)植株對(duì)干旱和鹽脅迫抗性的功能。通過該基因的過表達(dá)， 申請(qǐng)人:可以人工創(chuàng)造抗性增強(qiáng)材料，為實(shí)現(xiàn)抗性分子育種提供新的抗性基因。
[0020]2、通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)載體(OX轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得有效的的超表達(dá)(OX-AdT^)轉(zhuǎn)基因植株，為研究基因功能提供了一個(gè)有效的方法。
[0021]3、通過比較超表達(dá)株與野生型擬南芥的抗性，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理?xiàng)l件下的存活率是野生型擬南芥的兩倍以上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為一種基因超表達(dá)載體OX-Amm的構(gòu)建示意圖。
[0023]圖2為一種A tZA艱基因超表達(dá)轉(zhuǎn)化株中d 艱基因的表達(dá)水平圖。
[0024]四個(gè)植株圖表示21天大小的野生型植株和三個(gè)為艱基因超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)圖，圖下數(shù)字表示這些植株中為艱基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示三個(gè)基因超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株中為艱基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于野生型植株。
[0025]圖3為一種為艱基因超表達(dá)轉(zhuǎn)化株和野生型植株的干旱和鹽脅迫抗性鑒定圖。
[0026]左圖表示14天的野生型植株和三個(gè)基因超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株在正常情況澆水21天(即每三天澆水一次，保持土壤濕潤(rùn))，澆鹽水21天(即每三天澆150 mmol/L氯化鈉一次)和不澆水21天后的植株生長(zhǎng)情況。右表表示14天的野生型植株和三個(gè)J(為艱基因超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株在正常情況澆水21天，澆鹽水21天和不澆水21天后的植株的存活率統(tǒng)計(jì)。

【具體實(shí)施方式】
[0027]根據(jù)以下實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明，但所述的實(shí)施例是為了更好的解釋本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0028]實(shí)施例1:
一種擬南芥基因的制備方法，其步驟是:
A、在液氮中將植物幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol提取試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購(gòu)自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測(cè)儀(DM650 BECKMAN, MSA)分別檢測(cè)RNA在260納米和280納米光吸收值，結(jié)合1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA分裝后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029]B、根據(jù)擬南芥公共數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR (http://www.arabidopsis.0rg/)中擬南芥基因序列(At5g043400),在該基因基因Q)S (Coding seq μ ence,編碼序列，以下相同)起始密碼子和終止密碼子同源區(qū)域設(shè)計(jì)引物(序列為F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’-CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’)，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物為全長(zhǎng)序列。以擬南芥的葉片的cDNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥詹⒓兓瘮U(kuò)增的PCR產(chǎn)物，連接到pEASY_T載體上(購(gòu)自武漢群駿生物科技有限公司，詳見遺傳資源表)，用凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于含有氨芐青霉素50 μ g/mL的LB固體(配方如下:分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104 Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三個(gè)，做菌落PCR檢測(cè):所用引物序列為:M13F -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3;M13R 5’ -GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同)，反應(yīng)體系為:10XTaq酶反應(yīng)緩沖液2 μ 1、25 mM MgCl2 1.2 μ 1,2 mM dNTP 1.5 μ 1,10 μ M 引物 0.2 μ 1、0.3 單位 Taq 酶，加無菌水至 20 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性 5 min,940C 45 s、55°C 45 s、72°C 2 min 32 循環(huán)，72°C延伸5 min(以下相同)。以M13F/ M13R為引物(前面已述)，將連接過的pEASY_T載體(購(gòu)自武漢群駿生物科技有限公司，詳見遺傳資源表)進(jìn)行序列測(cè)定，分析結(jié)果，獲得了一種分離的基因，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0030]實(shí)施例2:
一種擬南芥抗性相關(guān)基因的過表達(dá)植株的獲得:
基因超表達(dá)載體(OX-JidT^)的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101轉(zhuǎn)化:
構(gòu)建的重組載體是將已構(gòu)建的質(zhì)粒PBM (本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F，Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance of Arabidopsis tohydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)上的目的基因用前期克隆得到的基因替換而來。為完成此目的，首先用Srml/Xhol I酶切克隆的基因片段，同時(shí)用Smal/Xhol酶切pBM質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX,Wang RY, Ren F， Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance ofArabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)。酶切反應(yīng)在30度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個(gè)小時(shí)之后，用1% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測(cè)。將酶切后的基因片段和pBIM質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX,Wang RY, Ren F， Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance ofArabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。把基因片段比pBIM質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F，Liu J, Cheng J, Lu YT (2005)AtGLBI enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress.PlantCell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)載體片段按3:1 (摩爾濃度比)的比例混合樣品，加入T4 DNA連接酶5個(gè)單位，10X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50 yg/mL)固體LB平板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為并對(duì)獲得的載體進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證準(zhǔn)確性。載體結(jié)構(gòu)如圖1。
[0031]然后利用凍融法(前面已述)將轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 (本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F，Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances thetolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46:1309-1316.詳見遺傳資源表)，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素和利福平(50 μ g/mL)的LB固體(配方如下:分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6.859X104 Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，各挑選白斑三個(gè)，做菌落PCR檢測(cè)(前面已述)。
[0032]本發(fā)明所使用的研究基因功能的重組植物表達(dá)載體，含有所述基因的編碼區(qū)核苷酸序列，組成型35S啟動(dòng)子(CaMV35S)可以增強(qiáng)基因的表達(dá)水平。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的卡那霉素抗性標(biāo)容易檢測(cè)。通過這個(gè)載體轉(zhuǎn)化擬南芥可以獲得菌核病抗性增強(qiáng)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。
[0033]2 d 炻基因超表達(dá)載體(OX-A tZAT6)的遺傳轉(zhuǎn)化:
參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(Zhang X.R.et al.Agrobacteri μ m-mediatedtransformat1n of Arabidopsis thaliana μ sing the floral dip method.Nat μ re,2006,1:1-6)。制備含有構(gòu)建好載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101 (本實(shí)驗(yàn)室保存，Yang LX,Wang RY, Ren F， Liu J, Cheng J, Lu YT (2005) AtGLBl enhances the tolerance ofArabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Phys1l 46: 1309-1316.詳見遺傳資源表)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(jì)(SPEKOL 1300)于276 nm納米波長(zhǎng)下檢測(cè)的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在1.6-2.0之間時(shí)取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000 g離心10 min,棄上清,將沉淀懸浮于等體積的5%鹿糖(質(zhì)量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet L-77 (購(gòu)自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)。混勻后把待轉(zhuǎn)化的擬南芥整個(gè)花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15s，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個(gè)黑色塑料袋包好，放在生長(zhǎng)箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。培養(yǎng)一個(gè)月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子播在混有營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中(營(yíng)養(yǎng)液成份為:每升含5ml I M KNO3, 2 ml I M Ca (NO3)2.4H20，2 ml I M MgSO4.7 H2O, 2.5 ml 20 mM Fe.EDTA,
2.5 ml I M磷酸緩沖液(pH5.5)，1 ml MS微量元素);4°C春化一星期，在21_22°C的生長(zhǎng)間中自然生長(zhǎng)兩星期左右，待到達(dá)四葉期的早期進(jìn)行卡那霉素(50 μ g/ml)的噴灑第一次，一星期之后進(jìn)行第二次噴灑。兩次噴灑后對(duì)存活的綠苗進(jìn)行PCR陽性檢測(cè)，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗。
[0034]LAtzm基因超表達(dá)載體(轉(zhuǎn)化苗的篩選及PCR鑒定:
根據(jù)以上卡那霉素(50 μ g/ml)噴灑篩選，轉(zhuǎn)基因Tl代(第一代)植株在苗期(播種后10 天)，得到成活植株。米用CTAB 法(M.G.Murray and ff.F.Thompson, Rapid isolat1nof high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Research, 1980, Vol.8, N0.19 4321-4326，以下相同)提取篩選后存活的擬南芥以及野生型擬南芥葉片DNA。根據(jù)表達(dá)載體上外源基因序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)(序列為F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’ -CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’)，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為 717bp。將經(jīng)過PCR檢測(cè)的陽性植株編號(hào)并標(biāo)記。
[0035]根據(jù)獲得的上述核苷酸序列(SEQ ID N0.1)，通過構(gòu)建超表達(dá)植物重組載體(OX-^ tZA艱)，轉(zhuǎn)化擬南芥， 申請(qǐng)人:獲得J ?為艱基因顯著升高的轉(zhuǎn)基因擬南芥(請(qǐng)見圖2)。
[0036]實(shí)施例3:
一種抗性相關(guān)的X似艱基因在增強(qiáng)植物(擬南芥)對(duì)干旱和鹽脅迫抗性中的應(yīng)用，其步驟是:
Α、將擬南芥Ol-AtZATe超表達(dá)株和野生型種子4°C春化一星期，然后播種于23°C光照培養(yǎng)室內(nèi)保濕培養(yǎng)(每天16 h光照，8 h黑暗)14天，14天內(nèi)每3天澆一次營(yíng)養(yǎng)液(營(yíng)養(yǎng)液成份為:每升含 5ml I M KNO3, 2 ml I M Ca(NO3)2.4H20, 2 ml I M MgSO4.7 H2O, 2.5 ml 20mM Fe.EDTA, 2.5 ml I M 磷酸緩沖液(ρΗ5.5)，I ml MS 微量元素)；
B、選取14天的擬南芥苗(包括01-AtZAT6超表達(dá)株和野生型)平均分成三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)21天，具體實(shí)驗(yàn)如下:
1)、第一組擬南芥苗(包括Ol-AtZATe超表達(dá)株和野生型)按照正常情況澆水21天(SP每三天澆水一次，保持土壤濕潤(rùn))；
2)、第二組擬南芥苗(包括超表達(dá)株和野生型)澆鹽水21天(即每三天澆150mmol/L氯化鈉一次)；
3)、第三組擬南芥苗(包括(K-AtZAT6超表達(dá)株和野生型)停止?jié)菜?1天。
[0037]以上脅迫處理21天后，觀察植株生長(zhǎng)情況和存活率。如圖3所示，0X-AtZAT6超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理情況下的生長(zhǎng)狀況和存活率都要明顯好于野生型。具體表現(xiàn)為野生型擬南芥在以上干旱和鹽脅迫處理21天，只有30%左右的植株可以存活，而OX-A tZAT6超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理21天還有60%-90%的植株可以存活，即OX-Atzm超表達(dá)株在干旱和鹽脅迫處理?xiàng)l件下的存活率是野生型擬南芥的兩倍以上。從而證明了為艱在擬南芥應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫條件下起著重要作用。
【權(quán)利要求】
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.一種擬南芥為艱基因在增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽脅迫抗性中的應(yīng)用；所述的植物為擬南芥。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104372000SQ201410246461
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】產(chǎn)祝龍, 施海濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢植物園