大豆食心蟲人工飼料及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了大豆食心蟲人工飼料及其制備方法和應用，其中制備大豆食心蟲人工飼料的方法包括：將67重量份的DEPC水、1.4重量份的瓊脂、0.3重量份的山梨酸、0.1重量份的對甲酯、0-6重量份的大豆粉、2.4重量份的鼓粒期豆莢粉、6-12重量份的鼓粒期籽粒粉、6重量份的玉米粉、1.5重量份的胡蘿卜粉、5.2重量份的白砂糖、2.3重量份的酪素和0.1重量份的膽固醇進行混合處理；高溫滅菌處理；加入0.1重量份的維生素混合物、0.2重量份的維生素C和1.5重量份的亞油酸，即得大豆食心蟲人工飼料。利用該方法制備的飼料對大豆食心蟲的適用期非常長，初孵幼蟲期即可采用，并且飼養(yǎng)存活率非常高，不存在RNA酶。
【專利說明】大豆食心蟲人工飼料及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及大豆食心蟲人工飼料及其制備方法和應用，具體涉及制備大豆食心蟲人工飼料的方法、大豆食心蟲人工飼料、人工飼養(yǎng)大豆食心蟲的方法、用于篩選大豆食心蟲靶基因的方法、殺蟲劑及植物培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆食心蟲目前是東北大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生最嚴重的害蟲之一，以幼蟲鉆蛀豆莢取食豆粒，將豆粒咬成溝道或殘破狀，不僅使大豆田嚴重減產(chǎn)，而且降低大豆品質(zhì)?；瘜W殺蟲劑是防治食心蟲的常用方法。但大量和長期使用不僅使大豆食心蟲抗藥性逐年增加，而且污染環(huán)境。轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因一度為害蟲防治帶來希望，并在抗蟲棉的應用上取得了良好的田間防治效果和巨大的經(jīng)濟效應。然而，隨著轉(zhuǎn)Bt基因棉花的大面積種植，棉鈴蟲對Bt蛋白的抗性已成為不容忽視的問題。利用傳統(tǒng)育種方法培育抗食心蟲大豆品種，對防治食心蟲雖然有效，但是周期長、效率低。因此，發(fā)展有效控制大豆食心蟲的新方法，是當前該領(lǐng)域的重要研究課題。
[0003]RNA 干擾(RNA interference)是一種由外源或內(nèi)源雙鏈 RNA (double-strandedRNA, dsRNA)誘發(fā)同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的基因調(diào)控機制。一般認為，雙鏈RNA在細胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶切割成21-25nt (堿基)的siRNA (shortinterferencing RNA)。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,反義siRNA進一步與體內(nèi) Argonaute 蛋白家族成員結(jié)合形成 RISC (RNA-1nduced silencing complex),最后RISC介導siRNA反義鏈與靶mRNA互補結(jié)合，切割同源靶mRNA分子，引起同源靶mRNA分子特異性降解。
[0004]由于RNAi技術(shù)沉默基因的高效性和特異性，人們利用轉(zhuǎn)基因手段，讓植物表達昆蟲重要基因的dsRNA，dsRNA藉由植食性昆蟲取食進入到昆蟲體內(nèi)，對靶基因進行RNA干擾，從而抑制昆蟲靶基因的表達，提高了植物的抗蟲性，為培育新一代抗蟲作物帶來契機。
[0005]目前，利用RNA干擾技術(shù)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因作物，主要通過轉(zhuǎn)基因手段，使作物表達昆蟲重要基因的dsRNA，籍由昆蟲取食進入消化道，只有dsRNA被昆蟲吸收，dsRNA才能介導內(nèi)源靶基因沉默，抑制靶基因表達，使昆蟲滯育或死亡。因此，獲得目標害蟲的靶基因，是開展RNA技術(shù)防治蟲害研究的基礎。目前面臨的一個主要挑戰(zhàn)就是尋找一個向目標昆蟲體內(nèi)導入dsRNA簡單而且穩(wěn)定的方法。顯微注射法是RNAi研究中最廣泛使用的dsRNA導入方法，該方法在幡蜂 G.bimaculatus、擬谷盜 Tribolium castaneum、家香 Bombyx mor1、甜菜液蛾S.exigua、褐飛風Nilaparvata Iugens等昆蟲中均取得成功。但顯微注射法篩選昆蟲靶基因最大的障礙就是顯微注射法將昆蟲dsRNA導入昆蟲體內(nèi)時產(chǎn)生機械損傷，很難確定昆蟲的死亡是由靶基因干擾引起還是顯微注射機械損傷造成，另外干擾效果還受注射體積和注射位置的影響。而將dsRNA加入到昆蟲人工飼料的喂食方法對昆蟲不會造成機械損傷，利用喂食dsRNA方法已經(jīng)成功地干涉了淺棕蘋果蛾Epiphyas postvittana,小菜蛾P(guān)lutella xylostella,棉鈴蟲Helicoverpa armigera等鱗翅目昆蟲祀基因表達。因此,喂食方法是一種潛在的高通量篩選昆蟲靶基因的方法。
[0006]然而，現(xiàn)階段利用喂食法篩選大豆食心蟲RNA干擾靶基因的人工飼料及具體方法仍有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0008]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，制約利用喂食法篩選大豆食心蟲的RNA靶基因方法的主要因素:一是沒有能夠持續(xù)大量飼養(yǎng)且能夠讓昆蟲正常生長發(fā)育的人工飼料。這是因為，篩選大豆食心蟲靶基因，首先都必須繁殖大量食心蟲。大豆食心蟲是東北大豆產(chǎn)區(qū)的主要害蟲，它單食大豆，以初孵幼蟲蛀入莢內(nèi)為害，大豆食心蟲一年只發(fā)生一代，從9月份脫莢入土滯育越冬，直到次年的7月中旬才化蛹羽化成成蟲。在土中棲息達10個月之久。大豆食心蟲幼蟲主要取食豆莢皮內(nèi)膜和嫩豆粒，大量采集天然飼料受季節(jié)的限制，而且天然飼料在離體情況下易變質(zhì)，飼養(yǎng)難度很大，無法大批量繁殖。目前，有研究者采用黃豆芽飼養(yǎng)初孵幼蟲，然后對一齡以后的幼蟲利用人工飼料進行飼養(yǎng)，但尚無法實現(xiàn)人工飼料持續(xù)大量飼養(yǎng)。二是人工飼料里面的RNA酶，會降解加入到人工飼料里面的昆蟲dsRNA，進而降低了通過取食人工飼料進如昆蟲體內(nèi)的dsRNA量，影響基因干擾對昆蟲生產(chǎn)發(fā)育的影響的研究結(jié)果，從而影響靶基因篩選的準確性，以及后續(xù)利用RNA干擾技術(shù)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因作物。
[0009]因而，現(xiàn)階段，制備一種無RNA酶、能夠持續(xù)大量飼養(yǎng)且能夠讓大豆食心蟲正常生長發(fā)育的人工飼料，至關(guān)重要。
[0010]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種制備無RNA酶、能夠持續(xù)大量飼養(yǎng)且能夠讓大豆食心蟲正常生長發(fā)育的人工飼料的方法。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備大豆食心蟲人工飼料的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟:將67重量份的DEPC水、1.4重量份的瓊脂、0.3重量份的山梨酸、0.1重量份的對甲酯、0-6重量份的大豆粉、2.4重量份的鼓粒期豆莢粉、
6-12重量份的鼓粒期籽粒粉、6重量份的玉米粉、1.5重量份的胡蘿卜粉、5.2重量份的白砂糖、2.3重量份的酪素和0.1重量份的膽固醇進行混合處理，并于4攝氏度下放置24小時，以便獲得第一混合物；將所述混合物進行高溫滅菌處理，以便獲得經(jīng)過高溫滅菌處理的混合物；以及將所述經(jīng)過高溫滅菌處理的混合物冷卻至55-65攝氏度，并加入0.1重量份的維生素混合物、0.2重量份的維生素C和1.5重量份的亞油酸，以便獲得第二混合物，所述第二混合物即為所述大豆食心蟲人工飼料。
[0012]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn),利用該方法制備獲得的大豆食心蟲人工飼料對大豆食心蟲的適用期非常長，初孵幼蟲期即可采用，并且飼養(yǎng)存活率非常高，從而突破性地改變了當前因大豆食心蟲初孵幼蟲僅能夠采用不易大量制備且易變質(zhì)的天然飼料或黃豆芽進行飼喂而制約了大豆食心蟲的大批量飼養(yǎng)繁殖的狀況。并且，本發(fā)明制備獲得的大豆食心蟲人工飼料中不存在RNA酶，從而尤其適合作為用于篩選RNA干擾靶基因研究的大豆食心蟲的人工飼料。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述大豆粉為2重量份，所述鼓粒期籽粒粉為10重量份。由此，制備獲得的大豆食心蟲人工飼料對大豆食心蟲的飼養(yǎng)存活率非常高。[0014]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述DEPC水的濃度為0.1體積％。由此，獲得的人工飼料中RNA酶去除效果更好。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種大豆食心蟲人工飼料。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該大豆食心蟲人工飼料是通過前面所述的方法制備獲得的。如前所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的大豆食心蟲人工飼料對大豆食心蟲的適用期非常長，初孵幼蟲期即可采用，并且飼養(yǎng)存活率非常高，從而突破性地改變了當前因大豆食心蟲初孵幼蟲僅能夠采用不易大量制備且易變質(zhì)的天然飼料或黃豆芽進行飼喂而制約了大豆食心蟲的大批量飼養(yǎng)繁殖的狀況。并且，本發(fā)明制備獲得的大豆食心蟲人工飼料中不存在RNA酶，從而尤其適合作為用于篩選RNA干擾靶基因研究的大豆食心蟲的人工飼料。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種人工飼養(yǎng)大豆食心蟲的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:利用前面所述的大豆食心蟲人工飼料飼喂所述大豆食心蟲。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效地進行大豆食心蟲的大量飼養(yǎng)繁殖，并且方法簡便、成本低、飼養(yǎng)存活率高，飼養(yǎng)獲得的大豆食心蟲尤其適用于RNA干擾靶基因篩選研究。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在光照培養(yǎng)箱中，于溫度為26°C，相對濕度為90%，光周期為L:D=16:8的條件下進行所述飼喂。根據(jù)本發(fā)明的實施例，大豆食心蟲飼養(yǎng)存活率非常聞。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實施例，每隔一天更換一次所述大豆食心蟲人工飼料。由此，有利于大豆食心蟲的生長繁育。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實施例，從所述大豆食心蟲初孵幼蟲期開始進行所述飼喂。由此，飼料易得，成本低，飼養(yǎng)效果好。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于篩選大豆食心蟲靶基因的方法，其中，通過抑制所述靶基因可以使所述大豆食心蟲死亡。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟:(1)提供候選基因，并基于所述候選基因設計所述候選基因的特異性干擾RNA； (2)將所述干擾RNA添加至權(quán)利要求3所述的大豆食心蟲人工飼料，以便獲得混合飼料；以及(3)利用所述混合飼料飼喂所述大豆食心蟲，其中，所述大豆食心蟲死亡是所述候選基因為所述靶基因的指示。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法進行大豆食心蟲RNA干擾靶基因的篩選研究，簡單方便、成本低，且結(jié)果準確有效、可重復性好。
[0021 ] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述干擾RNA為dsRNA和/或siRNA。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述大豆食心蟲為初孵幼蟲或一齡幼蟲。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在光照培養(yǎng)箱中，于溫度為26°C，相對濕度為90%，光周期為L:D=16:8的條件下進行所述飼喂至少24小時，其中，每隔一天更換一次所述混合飼料。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述混合飼料中所述干擾RNA的濃度為24微克/毫升。
[0025]需要說明的是，在本文中所使用的表達方式“大豆食心蟲死亡”中，大豆食心蟲的死亡時間在飼喂24-96小時或者更長時間后。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的實施例，篩選過程中采用不添加干擾RNA的大豆食心蟲人工飼料進行飼喂，以作為對照，此時，對照組的大豆食心蟲存活而實驗組的大豆食心蟲死亡是所述候選基因為所述靶基因的指示。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種殺蟲劑。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該殺蟲劑含有干擾RNA，所述干擾RNA能夠特異性抑制靶基因的表達，而使所述大豆食心蟲死亡，其中，所述靶基因是通過前面所述的用于篩選大豆食心蟲靶基因的方法篩選獲得的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對植物例如大豆施用該殺蟲劑，能夠有效防治大豆食心蟲，從而能夠提
高植物產(chǎn)量。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種植物培養(yǎng)方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:為所述植物施加前面述的殺蟲劑。由此，能夠有效地防治植物大豆食心蟲蟲害，進而能夠有效提高植物的產(chǎn)量。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的實施例,所述植物為大豆。由此,能夠有效防治大豆食心蟲對大豆的危害，進而能夠有效提聞大?的廣量。
[0030]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0032]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，不同飼料的初孵幼蟲飼養(yǎng)效果比較結(jié)果；
[0033]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，利用6種飼料進行大豆食心蟲初孵幼蟲飼喂實驗24小時后，各組大豆食心蟲的PO基因的相對表達量檢測結(jié)果；
[0034]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，利用6種飼料進行大豆食心蟲初孵幼蟲飼喂實驗至幼蟲發(fā)育到一齡時，各組大豆食心蟲的存活率統(tǒng)計結(jié)果；
[0035]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，利用6種飼料進行大豆食心蟲初孵幼蟲飼喂實驗至幼蟲發(fā)育到一齡時，各組大豆食心蟲的平均體重統(tǒng)計結(jié)果。
【具體實施方式】
[0036]下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0037]實施例1、大豆食心蟲人工飼料的篩選:
[0038]I飼料配制:
[0039]I)原料的準備:豆粉、鼓粒期豆莢粉、鼓粒期籽粒粉、玉米粉及胡蘿卜粉是大豆、鼓粒期豆莢、鼓粒期大豆籽粒、玉米粒及胡蘿卜烘干或晾干后粉碎并過80目篩而制得。將制得的豆粉、鼓粒期豆莢粉、鼓粒期籽粒粉、玉米粉及胡蘿卜粉分別滅菌。
[0040]2)按配比取配方量67%的水，加入瓊脂、山梨酸、對甲酯、豆粉、鼓粒期豆莢粉、鼓粒期籽粒粉、玉米粉、胡蘿卜粉、白砂糖、酪素、膽固醇攪拌均勻后放入4°C冰箱浸泡24h，然后高溫滅菌，冷卻至55-65°C，在超凈臺中加入維生素混合物、維生素C和亞油酸再次攪拌均勻，制備成有RNA酶的大豆食心蟲人工飼料，然后放于4°C冰箱中備用。
[0041]2試驗方法:
[0042] 按照上述方法根據(jù)表1人工飼料的成分配制了 7種人工飼料。喂食大豆食心蟲幼蟲用48孔細胞培養(yǎng)板，在細胞培養(yǎng)板每個孔中分別放入適量配置好的上述人工飼料、天然飼料(鼓粒期豆莢)和豆芽，每個孔中放入2粒即將孵化的黑頭卵，每個細胞培養(yǎng)板接入96粒黑頭卵，每個飼料接3個細胞培養(yǎng)板，即進行3次重復。將接入黑頭卵的細胞培養(yǎng)板用4層紗布蓋上，然后蓋上細胞培養(yǎng)板的蓋，并束上皮筋。置于光照培養(yǎng)箱中，溫度為26°C,相對濕度為90%，光周期為L:D=16:8。每天觀察記錄大豆食心蟲幼蟲存活情況，每隔3天還一次飼料，直到幼蟲發(fā)育到一齡。
[0043]表17種大豆食心蟲人工飼料的成分(重量份)
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種制備大豆食心蟲人工飼料的方法，其特征在于，包括下列步驟: 將67重量份的DEPC水、1.4重量份的瓊脂、0.3重量份的山梨酸、0.1重量份的對甲酯、0-6重量份的大豆粉、2.4重量份的鼓粒期豆莢粉、6-12重量份的鼓粒期籽粒粉、6重量份的玉米粉、1.5重量份的胡蘿卜粉、5.2重量份的白砂糖、2.3重量份的酪素和0.1重量份的膽固醇進行混合處理，并于4攝氏度下放置24小時，以便獲得第一混合物； 將所述混合物進行高溫滅菌處理，以便獲得經(jīng)過高溫滅菌處理的混合物；以及 將所述經(jīng)過高溫滅菌處理的混合物冷卻至55-65攝氏度，并加入0.1重量份的維生素混合物、0.2重量份的維生素C和1.5重量份的亞油酸，以便獲得第二混合物，所述第二混合物即為所述大豆食心蟲人工飼料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大豆粉為2重量份，所述鼓粒期籽粒粉為10重量份， 任選地，所述DEPC水的濃度為0.1體積％。
3.—種大豆食心蟲人工飼料，其是通過權(quán)利要求1或2所述的方法制備獲得的。
4.一種人工飼養(yǎng)大豆食心蟲的方法，其特征在于，包括: 利用權(quán)利要求3所述的大豆食心蟲人工飼料飼喂所述大豆食心蟲。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在光照培養(yǎng)箱中，于溫度為26°C，相對濕度為90%，光周期為L:D=16:8的條件下進行所述飼喂， 任選地，每隔一天更換一次所述大豆食心蟲人工飼料， 任選地，從所述大豆食心蟲初孵幼蟲期開始進行所述飼喂。
6.一種用于篩選大豆食心蟲靶基因的方法，其中，通過抑制所述靶基因可以使所述大豆食心蟲死亡，其特征在于，所述方法包括: (1)提供候選基因，并基于所述候選基因設計所述候選基因的特異性干擾RNA； (2)將所述干擾RNA添加至權(quán)利要求3所述的大豆食心蟲人工飼料，以便獲得混合飼料；以及 (3)利用所述混合飼料飼喂所述大豆食心蟲，其中，所述大豆食心蟲死亡是所述候選基因為所述靶基因的指示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述干擾RNA為dsRNA和/或siRNA， 任選地，所述大豆食心蟲為初孵幼蟲或一齡幼蟲。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在光照培養(yǎng)箱中，于溫度為26°C，相對濕度為90%，光周期為L:D=16:8的條件下進行所述飼喂至少24小時，其中，每隔一天更換一次所述混合飼料， 任選地，所述混合飼料中所述干擾RNA的濃度為24微克/毫升。
9.一種殺蟲劑，其特征在于，含有干擾RNA，所述干擾RNA能夠特異性抑制靶基因的表達，而使所述大豆食心蟲死亡，其中，所述靶基因是通過權(quán)利要求6-8任一項所述的方法篩選獲得的。
10.一種植物培養(yǎng)方法,其特征在于,包括: 為所述植物施加權(quán)利要求9所述的殺蟲劑， 任選地，所述植物為大豆。
【文檔編號】A01P7/04GK103976162SQ201410142210
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】孟凡立, 張大勇, 李娜, 李文濱, 劉珊珊 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學