一種杭白菊組織培養(yǎng)及繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種杭白菊的組織培養(yǎng)和離體快速繁殖的方法，使得在短期內(nèi)可以獲得大量的優(yōu)質(zhì)杭白菊種苗，滿足市場的需要；所述方法分為無菌材料的獲得及誘導(dǎo)培養(yǎng)、芽的增殖和生根、壯苗培養(yǎng)和生根苗移栽；本發(fā)明以腋芽為外植體，應(yīng)用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖，克服了杭白菊常規(guī)扦插和分株繁殖周期長、繁殖系數(shù)低、易感染和傳播病毒等缺點(diǎn)；用該方法生產(chǎn)出來的組培苗具有病毒少、遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種杭白菊組織培養(yǎng)及繁殖的方法
(一)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，特別涉及一種杭白菊的組織培養(yǎng)和快速繁苗方法，通過這種方法，可以進(jìn)行優(yōu)良種苗規(guī)模生產(chǎn)。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)是產(chǎn)于我國浙江的一種藥食兩用的菊科草本植物，是浙江省八大名藥材“浙八味”之一。杭白菊既可作藥材，又可制作成飲料供飲用，還可作庭院觀賞。杭白菊花中含有揮發(fā)油、黃酮類、多酚類、菊甙、嘌呤、膽堿、水蘇堿、維生素A、維生素B和氨基酸等。中西醫(yī)的研究表明，杭白菊具有散風(fēng)清熱，平肝明目，解毒消炎、提神利尿的作用，可用于治療濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少等癥，對(duì)中樞神經(jīng)也有鎮(zhèn)靜作用。若以菊湯沐浴，有去癢爽身、護(hù)膚美容的功能。經(jīng)常飲用杭白菊，還能增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力，抑制毛細(xì)血管的通性，起到抗炎強(qiáng)身的作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，杭白菊中還含豐富的鎳、鋅、鐵元素，尤其是鐵元素含量很高。鐵是細(xì)胞中的重要組成成分，細(xì)胞新陳代謝中許多酶的活性均需要鐵或需要鐵作為輔助因子，鐵元素在協(xié)調(diào)鋅、鈣、鎂的體內(nèi)代謝和人體免疫防御功能方面有重要作用。杭白菊的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌、乙型溶血鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、流感病毒均有抑制作用。
[0003]新的研究還發(fā)現(xiàn)杭白菊具有治療高血壓、偏頭痛、急性結(jié)膜炎等功效。因此，杭白菊除了作為食品飲料、保健品以外，還被開發(fā)為新型的抑菌和抗高血壓藥物，受到越來越廣泛的關(guān)注。
[0004]目前杭白菊的繁殖主要采用扦插繁殖和分株繁殖，繁殖時(shí)間長，繁殖系數(shù)低，無法滿足日益高漲的生產(chǎn)和市場需求。病毒病是杭白菊種植過程中的重要病害之一，而杭白菊扦插繁殖和分株繁殖這些繁殖方法易導(dǎo)致病毒的感染和傳播，并且世代相傳，逐年加重，致使其品種嚴(yán)重退化，許多杭白菊的優(yōu)良品種資源得不到保護(hù)和利用，直接影響了其花的產(chǎn)量和質(zhì)量，使杭白菊的經(jīng)濟(jì)效益受到一定影響。
[0005]生物技術(shù)的快速發(fā)展，特別是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為杭白菊的快速繁殖育種研究提供了重要基礎(chǔ)。因此，尋找一種快速高效的杭白菊繁殖方法是非常必要的。
[0006]目前國內(nèi)外對(duì)杭白菊組織培養(yǎng)的研究報(bào)道均是以葉片、葉柄、下胚軸、莖段和花瓣為外植體進(jìn)行杭白菊的組織培養(yǎng)(羅紫娟，1987 ;張媛，2008 ;郅慧，2004 ;牛顏冰，2007 ;張娜，2009)，但是這些方法均不能有效的脫去杭白菊體內(nèi)的病毒，雖然郅慧使用莖尖進(jìn)行了培養(yǎng)，但是先產(chǎn)生大量愈傷組織，然后從愈傷組織分化成不定芽，通過這個(gè)過程獲得的不定芽在增殖過程中容易出現(xiàn)變異，影響了種苗原有優(yōu)良遺傳性狀。本發(fā)明是以杭白菊芽繁芽的方式直接誘導(dǎo)分化，再誘導(dǎo)側(cè)芽分化不定芽進(jìn)行增殖，通過這種途徑獲得的不定芽能有效避免繼代增殖過程中出現(xiàn)的變異，更好地保持母株原有的優(yōu)良性狀。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的是提供一種杭白菊的組織培養(yǎng)和離體快速繁殖的方法，使得在短期內(nèi)可以獲得大量的優(yōu)質(zhì)杭白菊種苗，滿足市場的需要。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0009]一種杭白菊組織培養(yǎng)及繁殖方法，所述方法按如下步驟進(jìn)行:
[0010](I)無菌材料的獲得及誘導(dǎo)培養(yǎng):切取長勢良好、無病蟲害的杭白菊幼嫩的腋芽，用自來水沖洗0.5~2h,然后在體積濃度為1%洗潔精的水溶液中振搖2~5mins,用無菌水沖凈；在超凈工作臺(tái)上用體積濃度70~75%乙醇水溶液浸泡30~60s,然后用混合消毒液浸泡10~20mins,再用無菌水沖洗3~5遍；在滅菌的濾紙上吸干水分,用解剖刀剝?nèi)?.3~0.6mm的腋芽尖，然后將腋芽尖接種到裝叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口，置于培養(yǎng)箱中，在24~26°C，光照1500~25001x條件下培養(yǎng)15~25天；所述混合消毒液為體積比1:200的吐溫20和84消毒液的混合液；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加6-BA (即6-芐氨基腺嘌呤)1.0~3.0mg/L、NAA (即萘乙酸)0.05~0.5mg/L和谷氨酰胺80~120mg/L的MS基本培養(yǎng)基；
[0011](2)芽的增殖和生根:觀察步驟(1)所述24~26°C，光照1500~25001x條件下培養(yǎng)5~15天后，切口部位出現(xiàn)綠色突起，20~40天后出現(xiàn)叢生芽，再培養(yǎng)10~20天，當(dāng)叢生芽長到2~4cm時(shí)，將叢生 芽切下轉(zhuǎn)接到芽增殖培養(yǎng)基中，在24~26°C，光照1500~25001x條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得大量增殖的叢生苗，再培養(yǎng)6~10天，叢生苗長出2~5條根系，一步完成芽增殖和生根步驟，最終的生根率為90~95%，形成完整植株；所述芽增殖培養(yǎng)基為添加6-BA0.5~2.0mg/L,ΝΑΑ0.05~0.2mg/L、谷氨酰胺80~120mg/L和馬鈴薯提取物80g/L~120g/L的MS基本培養(yǎng)基；所述馬鈴薯提取物是將馬鈴薯洗凈，去皮，稱取馬鈴薯80~120克，切成2 X 2cm3的小塊，放入500ml去離子水中，煮沸15~25mins，冷卻至50~60°C后，用雙層紗布過濾，濾液添加到MS基本培養(yǎng)基中，即為在MS基本培養(yǎng)基中添加80g/L~120g/L馬鈴薯提取物；(本發(fā)明所述馬鈴薯提取物是指馬鈴薯削皮后于水中煮沸過濾后的濾液，濾液的加入量以煮沸前去皮馬鈴薯的重量計(jì));
[0012](3)壯苗培養(yǎng):將生根的叢生苗(即長出2~5條根系的叢生苗)接入1/2MS固體培養(yǎng)基中，在24~26°C，光照1500~25001x條件下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，獲得葉片舒展、葉色濃綠，根系粗壯，苗高3~5cm的小苗；
[0013](4)生根苗移栽:打開瓶蓋煉苗2~4天后，將小苗植株上的瓊脂和雜物洗凈，移栽至消毒后的育苗基質(zhì)上，澆透水，蓋上薄膜，保持濕度80%以上，置通風(fēng)陰涼處，在24~26°C、光照1500~25001x條件下培養(yǎng)8~12d，杭白菊葉色濃綠，莖正常挺立，實(shí)現(xiàn)杭白菊的繁殖；基質(zhì)干濕適宜，太濕會(huì)引起爛根，太干會(huì)出現(xiàn)葉片干枯，并定期進(jìn)行噴藥預(yù)防病蟲害的發(fā)生；所述育苗基質(zhì)為細(xì)沙、腐殖土與谷糠灰按照質(zhì)量比5:2:2的比例配置而成，所述育苗基質(zhì)的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質(zhì)，塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再曝曬基質(zhì)I~3天，完成對(duì)育苗基質(zhì)的消毒，或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質(zhì)，塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再在60°C下干燥2天，完成對(duì)育苗基質(zhì)的消毒。
[0014]進(jìn)一步，步驟(1)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為添加6-BA1.5mg/L、NAA0.2mg/L和谷氨酰胺100mg/L的MS基本培養(yǎng)基。
[0015]進(jìn)一步，步驟(2)所述的芽增殖培養(yǎng)基優(yōu)選為添加6-BA1.0mg/L、NAA0.lmg/L、谷氨酰胺100mg/L和馬鈴薯提取物100g/L的MS基本培養(yǎng)基。[0016]進(jìn)一步，所述的MS基本培養(yǎng)基終濃度組成為=NH4NO3L 65克/升、KNO3L 9克/升、CaCl2.2Η200.44 克 / 升、MgSO4.7Η200.37 克 / 升、KH2PO40.17 克 / 升、ΚΙ0.83 毫克 / 升、Η3Β036.2 毫克 / 升、MnSO4.4Η2022.3 毫克 / 升、ZnSO4.7Η208.6 毫克 / 升、Na2MoO4 CH2O0.25毫克 / 升、CuSO4.5Η200.025 毫克 / 升、CoCl2.6Η200.025 毫克 / 升、Na2EDTA37.25 毫克 /升、FeSO4.7H2027.85暈克/升、肌醇100暈克/升、甘氨酸2暈克/升、鹽酸硫胺素0.4暈克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、煙酸0.5毫克/升、蔗糖20~40克/升、瓊脂粉7~11克/升，溶劑為水，PH為5.6~6.0。
[0017]本發(fā)明所述MS基本培養(yǎng)基包含大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、蔗糖和瓊脂粉。所述大量元素組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加硝酸銨(NH4NO3) 1.65克、硝酸鉀(KNO3) 1.9 克、氯化鈣(CaCl2.2H20) 0.44 克、硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.37 克、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.17克。所述微量元素組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加碘化鉀(KI >0.83毫克、硼酸(H3B03)6.2毫克、硫酸錳(MnSO4.4Η20)22.3毫克、硫酸鋅(ZnSO4.7Η20)8.6毫克、鑰酸鈉(Na2MoO4.2Η20) 0.25 毫克、硫酸銅(CuSO4.5Η20) 0.025 毫克、氯化鈷(CoCl2.6Η20)0.025毫克。所述鐵鹽元素組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 37.25毫克，硫酸亞鐵(FeSO4.7Η20) 27.85毫克。所述有機(jī)物組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、鹽酸硫胺素(VB1) 0.4毫克，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5毫克，煙酸(VB5) 0.5毫克。蔗糖濃度是20~40克/升，瓊脂粉濃度是7~11克/升。
[0018]本發(fā)明所述杭白菊幼嫩腋芽選自浙江桐鄉(xiāng)杭白菊基地中長勢良好、無病蟲害的杭白菊。
[0019]本發(fā)明所述1/2MS固體培養(yǎng)基是指將MS基本培養(yǎng)基中大量元素的含量降低為1/2的含量，微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和蔗糖均不添加，即終濃度組成為=NH4NO30.825克/升、KNO30.95 克 / 升、CaCl2.2Η200.22 克 / 升、MgSO4.7Η200.185 克 / 升、KH2PO40.085 克 / 升，瓊脂粉9克/升，溶劑為水，pH為5.6~6.0。
[0020]本發(fā)明所述洗潔精是市售的各種洗潔精，作為清洗劑使用時(shí)通常以體積比1:100添加水。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0022](I)以腋芽為外植體，應(yīng)用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖，克服了杭白菊常規(guī)扦插和分株繁殖周期長、繁殖系數(shù)低、易感染和傳播病毒等缺點(diǎn)；用該方法生產(chǎn)出來的組培苗具有病毒少、遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；
[0023](2)改進(jìn)外植體消毒方法:用毒性小并且易降解的84消毒液代替?zhèn)鹘y(tǒng)的不可降解的氯化汞消毒劑，氯化汞屬于重金屬有相當(dāng)大的腐蝕性，并含有劇毒；長期接觸更可能引起皮膚過敏或腎病綜合癥，進(jìn)入環(huán)境對(duì)人類食物鏈也有相當(dāng)大的破壞性，采用84消毒液對(duì)生態(tài)環(huán)境更安全環(huán)保；
[0024]( 3 )對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，添加了谷胺酰胺抗褐化劑，避免使用活性炭作為抗褐化劑降低瓊脂凝固能力的缺點(diǎn)，而抗壞血酸作為抗褐化劑要經(jīng)過過濾除菌的復(fù)雜程序，其他褐化劑又價(jià)格昂貴。在培養(yǎng)基中添加經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的馬鈴薯天然提取物，提取物中的活性因子大大提高了杭白菊芽分化和增殖率；
[0025](4)改進(jìn)了組培程序，本方法獲得的杭白菊不定芽分化和誘導(dǎo)過程，不經(jīng)愈傷組織脫分化，直接以腋芽繁殖誘導(dǎo)無菌芽，比通過葉片和花瓣為外植體先獲得愈傷組織，再從愈傷組織獲得的無菌芽材料更快，更容易，而且能有效避免繼代增殖過程中造成的種苗變異，提高了其性狀的穩(wěn)定性，保證了種苗的品質(zhì)和質(zhì)量，有利于種質(zhì)資源保存和生產(chǎn)利用，可有效解決杭白菊的優(yōu)質(zhì)種苗的供應(yīng)問題。
[0026](5)在芽增殖階段直接生根，一次性完成芽增殖和生根培養(yǎng)過程，不需要配置專門的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)過程，常規(guī)培養(yǎng)從接種無菌芽到生根要3個(gè)月，約90天，本發(fā)明方法需要2個(gè)半月，約75天，大大節(jié)省了培養(yǎng)時(shí)間，降低了工廠化生產(chǎn)的成本。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為杭白菊在未添加谷氨酰胺和馬鈴薯天然提取物的芽增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L)上生長(20 天)情況；
[0028]圖2為杭白菊在添加谷氨酰胺(100mg/L)和馬鈴薯天然提取物(100g/L)的芽增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L)上生長(20 天)情況。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0030]本發(fā)明所述MS基本培養(yǎng)基包含大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、蔗糖和瓊脂粉:所述大量元素組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加硝酸銨(NH4NO3) 1.65克、硝酸鉀(KNO3) 1.9 克、氯化鈣(CaCl2.2H20) 0.44 克、硫酸鎂(MgSO4.7H20) 0.37 克、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.17克。所述微量元素組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加碘化鉀(KI >0.83毫克、硼酸(H3B03)6.2毫克、硫酸錳(MnSO4.4Η20)22.3毫克、硫酸鋅(ZnSO4.7Η20)8.6毫克、鑰酸鈉(Na2MoO4.2Η20) 0.25 毫克、硫酸銅(CuSO4.5Η20) 0.025 毫克、氯化鈷(CoCl2.6Η20)0.025毫克。所述鐵鹽元素組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 37.25毫克，硫酸亞鐵(FeSO4.7Η20) 27.85毫克。所述有機(jī)物組成是在配置I升(1000毫升)培養(yǎng)基時(shí)，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、鹽酸硫胺素(VB1)0.4毫克，鹽酸吡哆醇(VB6)0.5毫克，煙酸(VB5)0.5毫克。蔗糖濃度是30克/升，瓊脂粉濃度是9克/升，溶劑為水，PH為5.6~6.0。
[0031]所述1/2MS固體培養(yǎng)基是指將MS基本培養(yǎng)基中大量元素的含量降低為1/2的含量，微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和蔗糖均不添加，即終濃度組成為=NH4NO30.825克/升、KNO30.95 克 / 升、CaCl2.2Η200.22 克 / 升、MgSO4.7Η200.185 克 / 升、KH2PO40.085 克 / 升，瓊脂粉9克/升，溶劑為水，pH為5.6~6.0。
[0032]本發(fā)明所述洗潔精為浙江傳化洗潔精。
[0033]本發(fā)明所述封口膜購自山東青島普朗特生物有限公司。
[0034]所述馬鈴薯提取物是將馬鈴薯洗凈，削皮，稱取馬鈴薯80~120克，切成2 X 2cm3的小塊，放入500ml去離子水中，煮沸15~25mins，冷卻至50~60°C后，用雙層紗布過濾，濾液添加到MS基本 培養(yǎng)基中，即為在MS基本培養(yǎng)基中添加80g/L~120g/L馬鈴薯提取物。
[0035]實(shí)施例1
[0036](I)野外選種:選擇浙江桐鄉(xiāng)杭白菊基地中長勢良好、無病蟲害的杭白菊。[0037](2)無菌材料的獲得及誘導(dǎo)培養(yǎng):切取長勢良好、無病蟲害的杭白菊幼嫩的腋芽，用自來水沖洗0.5h，然后在體積濃度為1%洗潔精的水溶液中振搖2mins，用無菌水沖凈；在超凈工作臺(tái)上用體積濃度70%乙醇水溶液浸泡30s，然后用混合消毒液浸泡lOmins，再用無菌水沖洗3遍；在滅菌的濾紙上吸干水分，用解剖刀剝?nèi)?.3mm的腋芽尖，然后將腋芽尖接種到裝叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口，置于培養(yǎng)箱中，在240C，光照15001x條件下培養(yǎng)15天；所述混合消毒液為體積比1:200的吐溫20和84消毒液的混合液；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加6-BA1.0mg/L、NAA0.05mg/L和谷氨酰胺80mg/L的MS基本培養(yǎng)基；
[0038] (3)芽的增殖和生根:觀察步驟(1)所述24°C，光照15001x條件下培養(yǎng)5天后，切口部位出現(xiàn)綠色突起，20天后出現(xiàn)叢生芽，再培養(yǎng)10天，當(dāng)叢生芽長到2cm時(shí)，將叢生芽切下轉(zhuǎn)接到芽增殖培養(yǎng)基中，在24°C，光照15001x條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得叢生苗，再培養(yǎng)6天左右，叢生苗長出2~5條根系，一步完成芽增殖和生根步驟，生根率為90%，形成完整植株；所述芽增殖培養(yǎng)基為添加6-BA0.5mg/L、NAA0.05mg/L、谷氨酰胺80mg/L和馬鈴薯提取物80g/L的MS基本培養(yǎng)基；
[0039](4)壯苗培養(yǎng):將生根的叢生苗(長出2~5條根系的叢生苗)接入1/2MS固體培養(yǎng)基中，在24°C，光照15001x條件下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，獲得葉片舒展、葉色濃綠，根系粗壯，苗高3cm的小苗。
[0040](5)生根苗移栽:打開瓶蓋煉苗2天后準(zhǔn)備進(jìn)行移栽，移栽前將小苗上的瓊脂和雜物洗凈，移栽至消毒后的育苗基質(zhì)上，澆透水，蓋上薄膜，保持濕度80%以上，置通風(fēng)陰涼處，在24°C、光照15001x條件下培養(yǎng)8天，杭白菊葉色濃綠，莖正常挺立，實(shí)現(xiàn)杭白菊的繁殖；基質(zhì)干濕適宜為好，太濕會(huì)引起爛根，太干會(huì)出現(xiàn)葉片干枯，并定期進(jìn)行噴藥預(yù)防病蟲害的發(fā)生。所述育苗基質(zhì)為細(xì)沙、腐殖土與谷糠灰按照質(zhì)量比5:2:2的比例配置而成，所述育苗基質(zhì)的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質(zhì)，塑料薄膜覆蓋3天后揭開薄膜再曝曬基質(zhì)I天，完成對(duì)育苗基質(zhì)的消毒。
[0041 ] 實(shí)施例2消毒劑對(duì)杭白菊外植體生長的影響
[0042]分別用質(zhì)量濃度10%的過氧化氫(H2O2)水溶液和質(zhì)量濃度0.1%的氯化汞(HgCl2)水溶液兩種消毒劑替代實(shí)施例1步驟(2)中的混合消毒液對(duì)杭白菊的外植體材料(即腋芽)進(jìn)行消毒，其它操作同實(shí)施例1，觀察統(tǒng)計(jì)不同消毒劑對(duì)杭白菊芽誘導(dǎo)和生長的影響(即觀察腋芽尖在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長)，結(jié)果見表1所示。結(jié)果表明，混合消毒液和質(zhì)量濃度0.l%HgCl2的消毒效果基本相同，質(zhì)量濃度10%的過氧化氫消毒效果稍差，污染率達(dá)到10%，生長緩慢。但是質(zhì)量濃度0.1ffigCl2消毒對(duì)芽的誘導(dǎo)有影響，誘導(dǎo)率僅88%，而且外植體有發(fā)褐現(xiàn)象，芽的生長也比較慢，可能是HgCl2毒害細(xì)胞對(duì)芽的誘導(dǎo)有一定的影響。
[0043]表1不同的消毒劑對(duì)杭白菊外植體生長的影響
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種杭白菊組織培養(yǎng)及繁殖方法，其特征在于所述方法按如下步驟進(jìn)行: (1)無菌材料的獲得及誘導(dǎo)培養(yǎng):切取長勢良好、無病蟲害的杭白菊幼嫩的腋芽，用自來水沖洗0.5~2h，然后在體積濃度為1%洗潔精的水溶液中振搖2~5mins，用無菌水沖凈；在超凈工作臺(tái)上用體積濃度70~75%乙醇水溶液浸泡30~60s，然后用混合消毒液浸泡10~20mins,再用無菌水沖洗3~5遍；在滅菌的濾紙上吸干水分，剝?nèi)?.3~0.6mm的腋芽尖，然后將腋芽尖接種到裝叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，蓋上瓶蓋并用封口膜封住瓶口，置于培養(yǎng)箱中，在24~26°C，光照1500~25001x條件下培養(yǎng)15~25天；所述混合消毒液為體積比1:200的吐溫20和84消毒液的混合液；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加6-BA1.0~3.0mg/L、ΝΑΑ0.05~0.5mg/L和谷氨酰胺80~120mg/L的MS基本培養(yǎng)基； (2)芽的增殖和生根:觀察步驟(1)所述24~26°C，光照1500~25001x條件下培養(yǎng)5~15天后，切口部位出現(xiàn)綠色突起，20~40天后出現(xiàn)叢生芽，再培養(yǎng)10~20天，當(dāng)叢生芽長到2~4cm時(shí)，將叢生芽切下轉(zhuǎn)接到芽增殖培養(yǎng)基中，在24~26°C，光照1500~25001x條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得叢生苗，再培養(yǎng)6~10天，叢生苗長出2~5條根系，完成芽增殖和生根，形成完整植株；所述芽增殖培養(yǎng)基為添加6-BA0.5~2.0mg/L、NAA0.05~0.2mg/L、谷氨酰胺80~120mg/L和馬鈴薯提取物80g/L~120g/L的MS基本培養(yǎng)基；所述馬鈴薯提取物是將馬鈴薯洗凈，去皮，稱取馬鈴薯80~120克，切成2 X 2cm3的小塊，放入500ml去離子水中，煮沸15~25mins，冷卻至50~60°C后，用雙層紗布過濾，濾液添加到MS基本培養(yǎng)基中，即 為在MS基本培養(yǎng)基中添加80g/L~120g/L馬鈴薯提取物； (3)壯苗培養(yǎng):將生根的叢生苗接入1/2MS固體培養(yǎng)基中，在24~26°C，光照1500~25001x條件下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，獲得葉片舒展、葉色濃綠，根系粗壯，苗高3~5cm的小苗； (4)生根苗移栽:打開瓶蓋煉苗2~4天后，將小苗植株上的瓊脂和雜物洗凈，移栽至消毒后的育苗基質(zhì)上，澆透水，蓋上薄膜，保持濕度80%以上，置通風(fēng)陰涼處，在24~26°C、光照1500~25001x條件下培養(yǎng)8~12d，杭白菊葉色濃綠，莖正常挺立，實(shí)現(xiàn)杭白菊的繁殖；所述育苗基質(zhì)為細(xì)沙、腐殖土與谷糠灰按照質(zhì)量比5:2:2的比例配制而成，所述育苗基質(zhì)的消毒方法為:采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質(zhì)，塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再曝曬基質(zhì)I~3天，完成對(duì)育苗基質(zhì)的消毒，或者采用體積濃度0.5%福爾馬林水溶液均勻噴灑基質(zhì)，塑料薄膜覆蓋3~5天后揭開薄膜再在60°C下干燥2天，完成對(duì)育苗基質(zhì)的消毒。
2.如權(quán)利要求1所述杭白菊組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加6-BA1.5mg/L、NAA0.2mg/L和谷氨酰胺100mg/L的MS基本培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述杭白菊組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)所述的芽增殖培養(yǎng)基為添加6-BA1.0mg/L、NAA0.lmg/L、谷氨酰胺100mg/L和馬鈴薯提取物100g/L的MS基本培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述杭白菊組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的MS基本培養(yǎng)基終濃度組成為:NH4NO31.65 克 / 升、KNO3L 9 克 / 升、CaCl2.2Η200.44 克 / 升、MgSO4.7Η200.37克 / 升、KH2PO40.17 克 / 升、ΚΙ0.83 毫克 / 升、Η3Β036.2 毫克 / 升、MnSO4.4Η2022.3 毫克 /升、ZnSO4.7Η208.6 毫克 / 升、Na2MoO4.2Η200.25 毫克 / 升、CuSO4.5Η200.025 毫克 / 升、CoCl2.6Η200.025 毫克 / 升、Na2EDTA37.25 毫克 / 升、FeSO4.7Η2027.85 毫克 / 升、肌醇 100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、鹽酸硫胺素0.4毫克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、煙酸.0.5毫克/升、蔗糖20~40克/升、瓊脂粉7~11克/升，溶劑為水，pH為5.6~6.0。
5.如權(quán)利要求1所述杭白菊組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述1/2MS固體培養(yǎng)基終濃度組成為:NH4NO30.825 克 / 升、KNO30.95 克 / 升、CaCl2.2Η200.22 克 / 升、MgSO4.7Η200.185克/升、KH2PO40.085克/升，瓊脂粉9克/升，溶劑為水，pH為5.6~6.0。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103975851SQ201410126818
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】鄒克琴, 李素芳, 王為民, 張興濤 申請(qǐng)人:中國計(jì)量學(xué)院