一株抗生素溶桿菌06-4及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株抗生桿素溶菌06-4及其應(yīng)用，屬植物保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的抗生桿素溶菌06-4已經(jīng)保藏。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2008年03月17日；保藏號：CGMCC?NO.2402。本發(fā)明的抗生桿素溶菌06-4在制備防治水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病、及煙草黑脛病生防制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明具有高效、無毒、安全無殘留，06-4菌株活菌控病、促生效果較好，綜合性狀較好，易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，其生產(chǎn)菌株抗生素溶桿菌（Lysobacter?antibioticus)06-4能夠用于制備大田防治水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病、及煙草黑脛病的生防制劑。
【專利說明】—株抗生素溶桿菌06-4及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一株抗生桿素溶菌06-4及其應(yīng)用，屬植物保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]植物細(xì)菌性病害危害大、損失重、分布較廣。由稻黃單胞菌水稻變種[Xanthomonasoryzae pv.0ryzae (Ishiyama) Swings]引起的水稻白葉枯病可導(dǎo)致水稻重病田減產(chǎn)50%以上。魔芋為天南星科魔芋屬的多年生草本植物，能大量提取葡甘露聚糖，是一種經(jīng)濟(jì)效益高的地區(qū)經(jīng)濟(jì)作物。由胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora, Pcc)引起的魔芋細(xì)菌性軟腐病在世界范圍內(nèi)發(fā)病嚴(yán)重，造成的損失30%_50%，嚴(yán)重者可達(dá)80%甚至絕收。在大田生長期和儲藏期周年發(fā)生為害，感病葉片或球莖變軟，從病部流出帶菌汁液又侵染新的植株，使之發(fā)病，嚴(yán)重時引起成片倒苗。煙草是茄科一年生草本植物，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。煙草青枯病(Ralstonia solanacearum)及煙草黑胚病(Phytophthora nicotianae Breda de Hean var.nicotianae)是一種分布廣泛、為害嚴(yán)重的世界性煙草主要病害，尤其是細(xì)菌性青枯病是一種世界性的土傳病害，危害番茄、辣椒、煙草、馬鈴薯等400余種經(jīng)濟(jì)作物。
[0003]針對上述細(xì)菌病害，由于大量使用防治細(xì)菌病害的化學(xué)農(nóng)藥，抗藥菌株不斷出現(xiàn)化學(xué)農(nóng)藥使用和殘留嚴(yán)重阻礙了經(jīng)濟(jì)作物的出口貿(mào)易。隨著我國人民生活水平的提高，蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的安全質(zhì)量問題收到高度關(guān)注，尤其是農(nóng)藥殘留問題。目前對于細(xì)菌性害國內(nèi)外主要采取的保守控制措施為:農(nóng)業(yè)栽培措施，抗病品種等，但效果均不理想。因此，研究開發(fā)高效、無毒、安全無殘留、使用簡便的防治植物細(xì)菌病害的生物制劑，已經(jīng)是我國農(nóng)業(yè)發(fā)展中迫在眉睫的問題。
[0004]從玉米植株莖桿分離的抗生素溶桿菌06-4針對上述細(xì)菌病害在室內(nèi)抑菌及田間防治方面均有良好效果。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見利用抗生素溶桿菌菌株應(yīng)用于大田防治水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病、煙草黑脛病及魔芋軟腐病的公開報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一株高效、無毒、安全無殘留的抗生素溶桿菌06-4及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus) 06-4已經(jīng)保藏。保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日期:2008年03月17日；保藏號:CGMCC N0.2402
[0007]本發(fā)明的生產(chǎn)菌株抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus)06-4,分離自云南省富源縣玉米根際，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化、Biolog全自動鑒定系統(tǒng)測定和16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，該生產(chǎn)菌株抗生素溶桿菌(Lysobacterantibioticus)06-4 為一個新菌株。
[0008]該菌株具有以下·特征:[0009](I)菌落圓形，有光澤，光滑，不透明稀液狀，產(chǎn)生黑褐色色素，初期培養(yǎng)為暗黃色，后期培養(yǎng)為棕褐色，不產(chǎn)芽孢，有滑動現(xiàn)象。
[0010](2)該菌株抑菌譜廣、抑菌能力強(qiáng)，能在十字花科蔬菜、煙草等多種作物根際定植，對紅掌葉疫病菌、馬鈴薯青枯病菌、水稻白葉枯病菌等病原細(xì)菌都有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是紅掌葉疫病菌。菌株06-4對真菌也具有較好的抑制作用，對尖鐮孢菌抑制效果最好，其次是煙草黑脛病菌，而對三七疫霉病菌和立枯絲核菌的抑菌效果也非常明顯。
[0011](3) Biolog生菌理生化特征:L-阿拉伯糖L-arabinose、D-阿拉伯糖醇D-Arabitol> D-半乳糖 D-Galactose、a_D_ 葡萄糖 a-D-Glucose、D-甘露醇 D-Mannitol、D-山梨醇D-Sorbitol、鹿糖Sucrose、甲基丙酮酸Methlpyruvate、單甲基玻拍酸Monomethyl-Succinate、乙酸 Acetic acid、cis-烏頭酸 cis-Acontic acid、梓樣酸Citric acid、甲酸 Formic acid、D-半乳糖酸內(nèi)酯 D-Galactonic acid lacton、D-半乳糖醒酸 D-Galacturonic acid、D-葡糖酸 D-Gluconic acid、D-葡糖胺酸 D-Glucosaminicacid、D-葡糖醒酸 D-Glucuronic acid、a —酮戍二酸 a-Ketoglutaricacid、a —酮基戍酸a-Ketovaleric acid、丙二酸 Malonic acid、丙酸 Prpionic acid、奎尼酸 Quinic acid、D-葡糖二胺 D-sacchric acid、玻拍酸 Succinic acid、溴玻拍酸 Bromosuccinic acid、L-丙氨酸 L-Alanine、L-丙氨酰-甘氨酸 L-Alanylglycin、L-天冬酰胺 L-Asparagine、L-天冬氨酸 L-Aspartic acid、L_ 谷氨酸 L-Glutamic acid、L_ 腦氨酸 L_Proline、Y-氨基丁酸 Y-Aminobutyric acid、D-L-a-憐酸甘油 DL-a-Glycerophosphate
[0012]本發(fā)明的抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus) 06_4菌株,用于大田防治水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病、及煙草黑脛病。即:將保藏的06-4接種到斜面培養(yǎng)基上(斜面培養(yǎng)基配方:蛋白胨20g，甘油10ml，K2HP04l.5g,MgSO4.Η201.5g，水1000ml)放置于28± 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，能用作斜面菌種；將斜面菌種接到液體培養(yǎng)基中制成菌懸液，在搖瓶用液體培養(yǎng)法 將種子放大培養(yǎng)至發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:1L的配方為蛋白胨 4.5g，酵母膏 1.5g，MgSO4 -H2Ol.0g，K2HPO4L Og，葡萄糖 7g，甘油 IOml，PH6.0-7.0，培養(yǎng)溫度28±1，°C時間48h);空罐消毒和實(shí)罐消毒:空罐消毒條件為0.15Mpa，50min，實(shí)罐消毒條件為0.14Mpa，30min。滅完菌冷卻后，接種發(fā)酵種子液，轉(zhuǎn)速120rpm，溫度28±1，V通風(fēng)量24m3/h。培養(yǎng)54-72h，培養(yǎng)中12h后每個4h抽樣檢查一次。發(fā)酵后的發(fā)酵液加入硅藻土制成固體試劑，常溫干燥2~3天；也能混入草炭制備成生物菌肥，進(jìn)行使用。
[0013]本發(fā)明具有高效、無毒、安全無殘留，06-4菌株活菌控病、促生效果較好，綜合性狀較好，易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，其生產(chǎn)菌株抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus) 06_4能夠用于制備大田防治水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病及煙草黑脛病的生防制劑。
【具體實(shí)施方式】:
[0014]本發(fā)明的抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus)06-4已經(jīng)保藏。保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日期:2008年03月17日；保藏號:CGMCC N0.2402
[0015]本發(fā)明的抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus) 06-4菌株,用于大田防治水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病及煙草黑脛病。即:將保藏的06-4接種到斜面培養(yǎng)基上(斜面培養(yǎng)基配方:蛋白胨20g，甘油10ml, K2HPO4L 5g，MgSO4.H2Ol.5g，水1000ml)放置于28± 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，能用作斜面菌種；將斜面菌種接到液體培養(yǎng)基中制成菌懸液，在搖瓶用液體培養(yǎng)法將種子放大培養(yǎng)至發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:1L的配方為蛋白胨 4.5g，酵母膏 1.5g，MgSO4 -H2Ol.0g，K2HPO4L 0g，葡萄糖 7g，甘油 IOml，PH6.0-7.0，培養(yǎng)溫度28±1，°C時間48h);空罐消毒和實(shí)罐消毒:空罐消毒條件為0.15Mpa，50min，實(shí)罐消毒條件為0.14Mpa，30min。滅完菌冷卻后，接種發(fā)酵種子液，轉(zhuǎn)速120rpm，溫度28±1，V通風(fēng)量24m3/h。培養(yǎng)54-72h，培養(yǎng)中12h后每個4h抽樣檢查一次。發(fā)酵后的發(fā)酵液能加入硅藻土制成固體試劑，常溫干燥2~3天；也能混入草炭制備成生物菌肥，進(jìn)行使用。
[0016]用本發(fā)明的生產(chǎn)菌株制備的發(fā)酵液，通過噴霧或者灌根的方式施用。已在溫室和云南省楚雄州元謀縣、玉溪市元江縣、及玉溪市馬龍縣地進(jìn)行了田間防效試驗，證明了該菌株發(fā)酵液對水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病、煙草黑脛病病害的防效顯著、穩(wěn)定，能夠有效地控制各類細(xì)菌病害及真菌病害，防治效果可達(dá)53.2-76.9%。玉溪市馬龍縣田間試驗結(jié)果表明，生防菌06-4能有效的防治煙草黑脛病及煙草青枯病；玉溪市元江縣及楚雄州元謀縣田間試驗結(jié)果表明生防菌06-4能穩(wěn)定有效的防治水稻白葉枯病；楚雄州元謀縣田間試驗結(jié)果表明生防菌06-4能穩(wěn)定有效的防治馬鈴薯青枯病；在離體試驗中，菌株06-4對接種魔芋軟腐病菌的帶病種球腐爛防治效果也十分顯著，最高可達(dá)95.4。
[0017]下面用實(shí)施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0018]實(shí)施例一:生防菌06-4對植物病原菌的拮抗作用測定
[0019]1.供試材料
[0020]1.1供試菌株:供試生防菌株:抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus)06-4。供試植物病原菌菌株:胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium.carotovora.subsp.carotovora)強(qiáng)致病力菌株:MY9 ;香料煙角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci):T5 ;水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae):53、X13、Y4、Α10、Q6-39、X6、Y6、Q15-1、Q15 ;紅掌葉疫病菌(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae):XCD-S> 大白菜軟腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora):Eff ;馬蹄蓮軟腐菌(E.carotovorasubsp carotovora):WM2 ；煙草野火病菌(Pseudomonas syringaepv.tabaci) =CXltl，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物多樣性與病害控制國家工程中心細(xì)菌研究室提供。馬鈴薯青枯病菌(Ralstonia solanacearum)Tb23由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所何禮遠(yuǎn)教授提供；三七腐霉病菌(Pythium sp.) SQ1、香莢蘭根腐病菌(Fusarium orysporumSchlf.sp.Vanillae (Tucker) Gordon) Fl為云南省植物病理重點(diǎn)實(shí)驗室真菌研究室劉云龍教授提供。水稻稻痕病病原菌(Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.) DW、玉米大斑病病原菌(Exserohilum turcicum(pass.) Leonard&Suggs) DB、玉米小斑病病原菌(Bipolarismaydis (Nishik.&Miyabe) shoem) XB、為云南省植物病理重點(diǎn)實(shí)驗室何月秋教授提供。煙草黑胚病病原菌(Phytophthora nicotianae Breda de Hean var.nicotianae)97007>97008由云南省玉溪煙科所方敦煌副研究員提供。
[0021]1.2供試試劑
[0022]NA培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂17g，水1000mL,pH7.0) ；PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，瓊脂15g，葡萄糖15g，水1000mL)。2.試驗方法
[0023]菌懸液的制備:將得到的抗生素溶桿菌和病原細(xì)菌分別接入裝有50ml的NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28°C、160r/min搖床上培養(yǎng)48h。將菌懸液用無菌水適當(dāng)稀釋，搖均勻后，用600nm波長、Icm比色皿測定OD值。測定時用無菌NA培養(yǎng)基作空白對照。用無菌水稀釋使得菌懸液的為OD值0.3，待用。[0024]對病原細(xì)菌抑菌作用的測定:取上步所得病原細(xì)菌菌懸液200ul加入培養(yǎng)皿中，將冷卻至45°C左右的NA培養(yǎng)基倒入已加過病原細(xì)菌菌懸液的培養(yǎng)皿中，混勻。等完全凝固后，放置牛津杯于培養(yǎng)基表面，取上步所得06-4菌懸液200 μ I加入牛津杯,28°C中培養(yǎng)2-4d。觀察、記錄試驗結(jié)果。
[0025]對病原真菌抑菌作用的測定:在PDA平板中心接種植物病原菌菌盤(直徑5mm)，兩側(cè)2cm處接種06-4菌株。置28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌情況。
[0026]3試驗結(jié)果
[0027]表1結(jié)果顯示，生防細(xì)菌06-4為廣譜生防菌，對由黃單胞屬細(xì)菌引起的水稻白葉枯病、細(xì)菌性條斑病、紅掌葉疫病，由歐文氏菌屬細(xì)菌的魔芋軟腐病、大白菜軟腐病，有較好防治作用；對水稻稻瘟病、蘆薈根腐病、香莢蘭根腐病、煙草黑脛病，真菌病害均有防治作用，對土傳病害的控制具有較大的應(yīng)用潛力。其中，防治效果最好的病害包括:水稻白葉枯病、馬鈴薯青枯病、煙草青枯病、煙草黑脛病病害。
[0028]表1生防菌06-4菌株對植物病原細(xì)菌的抑菌效果
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一株抗生桿素溶菌06-4，其保藏號為:CGMCC N0.2402。
2.權(quán)利要求1所述的抗生桿素溶菌06-4在制備防治水稻白葉枯病，馬鈴薯青枯病、煙草青枯病及煙草黑脛病生防制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P1/00GK103667129SQ201310651899
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】姬廣海, 周麗洪, 魏蘭芳, 肖炳光 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)