一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，胚性玉米愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料。使用基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將攜帶外源基因的轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3300金粉包裹后轟擊玉米胚性愈傷組織完成轉(zhuǎn)化，經(jīng)過組織培養(yǎng)、篩選、分化后進行煉苗、移栽得到一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新材料，通過回交和分子標記輔助選擇的方法驗證了該抗性基因在不同遺傳背景中的優(yōu)良表現(xiàn)，為后續(xù)抗螟蟲玉米新品種的培育提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源。
【專利說明】一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于玉米生物技術育種【技術領域】，具體涉及一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，通 過基因槍介導的轉(zhuǎn)化技術轉(zhuǎn)入抗蟲基因，對轉(zhuǎn)基因后代進行了一系列基因純合鑒定、表達驗證，農(nóng)藝性狀篩選、抗性鑒定，遺傳穩(wěn)定性研究；并通過回交和分子標記輔助選擇的方法將抗蟲基因?qū)胗N材料中獲得了高抗玉米螟的優(yōu)良玉米種質(zhì)材料。
【背景技術】
[0002]玉米(Zea mays L.)，學名玉蜀黍，是重要的糧食作物，也是重要的飼料和工業(yè)原料，在國民生計和經(jīng)濟建設中起著至關重要的作用。世界范圍內(nèi)玉米蟲害約350種，其中以蛀莖性和食葉性的鱗翅目害蟲玉米螟分布最為廣泛，危害最重，是世界性的重要玉米蟲害，嚴重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。世界上每年因為玉米螟危害造成10%以上的減產(chǎn)和經(jīng)濟損失，大發(fā)生年甚至絕收。因此有效地防治蟲害對玉米生產(chǎn)具有重要的意義。玉米材料中缺乏有效的天然抗性基因，很難利用傳統(tǒng)的育種技術手段篩選得到具有優(yōu)良抗蟲性的玉米材料，傳統(tǒng)的害蟲防治措施主要為化學防治，但是化學農(nóng)藥具有成本高、環(huán)境污染、易殘留、會毒害有益昆蟲和害蟲天敵等弊端不適宜長期使用。
[0003]植物基因工程的興起與發(fā)展，為玉米病蟲害的防治提供了一條嶄新的思路。利用基因工程手段培育抗蟲新品種具有不污染環(huán)境、對害蟲的殺蟲性具有專一性、育種周期短、育種和栽培成本低等優(yōu)點?，F(xiàn)在應用基因工程手段培育的抗蟲材料數(shù)量直線上升，幾乎涵蓋了所有的重要農(nóng)作物。在眾多的抗蟲基因中，Bt殺蟲蛋白基因是一類作用機理研究比較清楚，市場應用最廣泛和最有潛力的殺蟲蛋白。自從1993世界上第一例成功的轉(zhuǎn)crylAb基因抗蟲玉米出現(xiàn)，抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)展迅速，直到1996年，表達cryIAb基因的轉(zhuǎn)Bt基因玉米被批準商業(yè)應用于控制歐洲玉米螟危害。隨后，攜帶來自于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米越來越多地被用來控制玉米生產(chǎn)中主要的鱗翅目害蟲。具有CrylAb蛋白表達的玉米種質(zhì)用來進行玉米的雜交已經(jīng)被證明是一個可以減少農(nóng)藥使用，并減少對環(huán)境和人類潛在危害的有效管理措施。
[0004]隨著國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物研究的快速發(fā)展，有關Bt基因的專利覆蓋范圍越來越廣，而且近年來針對中國農(nóng)業(yè)微生物和植物生物技術方面的飛速發(fā)展，高技術的競爭日趨激烈；獲得我國自主知識產(chǎn)權(quán)的攜帶新型自主產(chǎn)權(quán)的Bt殺蟲基因的優(yōu)良種質(zhì)資源，并盡快用于新一代轉(zhuǎn)基因抗蟲作物育種，為我國轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的持續(xù)發(fā)展提供技術保障成為極為緊迫的任務。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供了一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，通過該方法可獲得一種玉米抗蟲轉(zhuǎn)基因新材料，命名為ZmKc，經(jīng)過各種分子生物學鑒定與功能鑒定和田間試驗以及分子標記輔助選擇育種，獲得的新的攜帶抗蟲轉(zhuǎn)基因的新材料全生育期表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，遺傳穩(wěn)定，適用于新型抗蟲玉米材料的生產(chǎn)并可以有效的在玉米分子育種中廣泛應用。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施:
[0007]本發(fā)明使用的為優(yōu)化后的crylC基因，即crylC*，其序列為SEQ ID N0.1所示。胚性玉米愈傷組織(引自華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳育種國家重點實驗室，參照PlantTransformation Facility (http://agron-www.agron.1astate.edu/ptf/)作為轉(zhuǎn)化受體材料。使用基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將攜帶外源基因的轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA3300金粉包裹后轟擊玉米胚性愈傷組織完成轉(zhuǎn)化，經(jīng)過組織培養(yǎng)、篩選、分化后進行煉苗、移栽得到轉(zhuǎn)化單株。對轉(zhuǎn)化材料及其后代進行一系列分子生物學實驗檢測和田間表型與主要農(nóng)藝性狀的測定，獲得了一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新材料，通過回交和分子標記輔助選擇的方法驗證了該抗性基因在不同遺傳背景中的優(yōu)良表現(xiàn)，為后續(xù)抗螟蟲玉米新品種的培育提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源。
[0008]一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，其步驟如下:
[0009](1)按照常規(guī)方案制備胚性玉米愈傷組織。
[0010](2)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建:
[0011]pCAMBIA3300載體用BamH I和Hind III進行雙酶切消化并重新連接cry 1C*基因獲得目的載體。然后使用限制性內(nèi)切酶saml切下載體上的潮霉素抗性基因，使用連接酶將帶有saml酶接頭的草丁膦抗性基因bar基因替換，獲得轉(zhuǎn)基因載體。
[0012](3)利用基因槍介導轉(zhuǎn)化的方法，將包裹有目的基因載體的金粉轟擊高滲培養(yǎng)后的胚性愈傷組織?；驑屴Z擊后恢復培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)入含有2mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2-3輪，每輪20-30天。篩選后將具有除草劑抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基分化成苗，得到一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米單株。
[0013]所述的crylO基因序列為SEQ ID N0.1所示。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0015](1)本研究首次實現(xiàn)了 crylC*基因在玉米中的轉(zhuǎn)化，得到了含有該基因的轉(zhuǎn)基因玉米優(yōu)良抗蟲新材料。
[0016](2)本研究對轉(zhuǎn)crylO基因玉米的高代自交材料的遺傳穩(wěn)定性和表達穩(wěn)定性進行了研究分析。完成了對抗蟲蛋白在不同時期不同組織的表達測定，為其優(yōu)良抗性提供了有效的表達證據(jù)。
[0017](3)由本方法獲得的轉(zhuǎn)基因玉米純系ZmKc，抗性好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良，為玉米抗螟蟲育種提供了優(yōu)異的新的種質(zhì)資源。
[0018](4)利用回交和分子標記輔助選擇的策略，將優(yōu)良的抗性基因?qū)氲讲煌z傳背景的玉米純系中，對回交導入材料后代表達的穩(wěn)定性和農(nóng)藝性狀進行了比較系統(tǒng)的分析，為轉(zhuǎn)基因玉米自交系的直接雜交應用及通過分子標記輔助選擇回交轉(zhuǎn)育的方法將外源基因?qū)氲狡渌r(nóng)藝性狀優(yōu)良的骨干自交系中提供了依據(jù)和成功范例。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為一種抗蟲基因轉(zhuǎn)化質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖中crylC*基因由Ubi啟動子驅(qū)動，連接在載體pCAMBIA3300多克隆位點。篩選標記基因為35S啟動子驅(qū)動的bar基因。[0021]圖2為一種Ttl代轉(zhuǎn)crylC*基因玉米PCR檢測結(jié)果。
[0022]圖中，泳道1:DNA分子量標記BM2000 ;泳道2:質(zhì)粒模板陽性對照；泳道3_8:獨立轉(zhuǎn)化單株DNA為模板PCR檢測。
[0023]圖3:是T1代crylC*基因Southern blot檢測結(jié)果，圖中，泳道1:DNA分子量標記λ /HindIII ;泳道2:質(zhì)粒陽性對照；泳道3_6:獨立轉(zhuǎn)化單株為模板Southern檢測。
[0024]圖4:是T1RcrylC*基因RT-PCR檢測結(jié)果，圖中，泳道M:DNA分子量標記BM2000 ；泳道P:質(zhì)粒模板陽性對照；泳道1:未轉(zhuǎn)化單株RNA模板對照；泳道(::假陽性轉(zhuǎn)化單株RNA模板對照；泳道1-8:獨立轉(zhuǎn)化單株RNA為模板RT-PCR檢測；泳道9_16:T3代單株RNA為模板RT-PCR檢測。
[0025]圖5:是T3 RCrylO蛋白ELISA檢測結(jié)果，圖中，a:獨立轉(zhuǎn)基因材料中抗蟲蛋白含量變化；b:同一轉(zhuǎn)化事件中不同時期抗蟲蛋白含量變化；c:不同組織中蛋白質(zhì)含量變化。
[0026]圖6:是T3代玉米螟抗性表型鑒定結(jié)果，圖中，a:田間蟲害抗性，箭頭指示蟲害部位；b:室內(nèi)葉片喂蟲表型，箭頭指示蟲害部位；c:莖桿蟲害表型，箭頭指示蟲害部位。
[0027]表1:是轉(zhuǎn)基因材料后代農(nóng)藝性狀測量結(jié)果。
【具體實施方式】
[0028]以下實例進一步定義本發(fā)明，并描敘了轉(zhuǎn)化crylC*基因、篩選分化轉(zhuǎn)化單株及轉(zhuǎn)基因種質(zhì)的篩選鑒定和功能驗證。根據(jù)以下的描述和實例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出適當?shù)耐晟坪托薷?，以使其適用各種用途和條件，在本發(fā)明中，所用技術方案及步驟如未特別說明，均為常規(guī)技術方案，可參照《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年。
[0029]實施例1:
[0030]一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，其步驟如下:
[0031 ] (1)胚性玉米愈傷組織的制備:
[0032]通過人工控制授粉，制備得到愈傷組織誘導材料H1-1I (A188*B73)材料種子，將F1代種子田間種植，進行嚴格自交授粉，掛牌記錄授粉材料和日期。授粉10-14天后取回幼穗，用75%酒精表面消毒后挑取幼胚(直徑1.2-1.8mm)置于N6誘導培養(yǎng)基,28°C暗培養(yǎng)誘導愈傷組織，待I型愈傷組織形成后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)，每20天繼代一次誘導胚性愈傷組織(疏松干燥、顏色鮮亮、生長迅速的體細胞胚)作為轉(zhuǎn)化受體。
[0033]具體步驟如下:
[0034]I)玉米的控制授粉
[0035]a)玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用別針別住，收集花粉。
[0036]b )雌穗花絲未抽出前，用小口袋將其套住，并用別針別好。
[0037]c)授粉前一天，當花絲伸長約2cm時，用剪刀剪去花絲頂部，促進其伸長。
[0038]d)第二天，當花絲伸長后，進行授粉，并掛牌記錄。
[0039]e) 10-14 天收獲，4°C存放。
[0040]2)幼胚的剝離和培養(yǎng)
[0041]a)收獲鮮穗(胚約1_)后于4°C存放1-2天。
[0042]b)將玉米雌穗的苞葉和花絲去凈，75%酒精浸泡3_5min，用刀切去頭尾部分。[0043]c)用手術刀切去籽粒上半部分(根據(jù)幼胚大小切去1/2-2/3)。
[0044]d)用小鑷子挑出幼胚。
[0045]e)將幼胚放入無菌水中清洗。
[0046]3)幼胚培養(yǎng)
[0047]a)將幼胚轉(zhuǎn)移到誘導培養(yǎng)基上，胚軸(較平的一面)向下，盾片向上。
[0048]b) 27_28°C暗培養(yǎng)3_4周，使之開始脫分化形成I型愈傷組織。
[0049]c)每2-3周繼代一次，經(jīng)過2-3次繼代，選擇生長迅速，質(zhì)地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。
[0050]所述培養(yǎng)基如下:
[0051]MS培養(yǎng)基(I升):MS大量元素、微量元素、有機物、鐵鹽、30g蔗糖、8g瓊脂、pH5.8 ;
[0052]N6培養(yǎng)基(I升):N6大量元素、微量元素、有機物、鐵鹽、20g蔗糖、0.69g脯氨酸、0.2g水解酪蛋白、7g瓊脂、pH5.8 ;
[0053]幼胚誘導培養(yǎng)基:N6培養(yǎng)基+2mg/L2，4-D ；
[0054]愈傷繼代培養(yǎng)基:N6培養(yǎng)基+2mg/L2，4-D+0.5gMES ；
[0055]高滲培養(yǎng)基:N6培養(yǎng)基+0.4M甘露醇；
[0056]篩選培養(yǎng)基:N6培養(yǎng)基+2mg/L2, 4_D+2mg/L草丁膦；
[0057]分化培養(yǎng)基:N6培養(yǎng)基 +2mg/L6-BA，pH5.8 ；
[0058]生根培養(yǎng)基:1/2MS培養(yǎng)基 +0.4mg/L NAA, ρΗ5.8 ；
[0059]備注:大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物的配方按Ν6、MS基本配方配制(朱至清，1975)，上述培養(yǎng)基均需高壓滅菌。
[0060]( 2 )植物轉(zhuǎn)化超表達載體構(gòu)建
[0061]根據(jù)pCAMBIA3300載體的多克隆位點和crylC*、bar基因的編碼區(qū)序列上的酶切位點分析，選擇BamH1、HindIII和saml作為內(nèi)切酶。首先以野生型基因型Bt殺蟲蛋白基因crylCa5為基礎，根據(jù)植物密碼子偏愛性堿基優(yōu)化后合成基因，其序列為SEQ ID N0.1所示，并根據(jù)已知序列信息合成除草劑抗性基因bar基因。pCAMBIA3300載體用BamH I和Hind III進行雙酶切消化并重新連接成目的載體。然后使用限制性內(nèi)切酶saml切下載體上的潮霉素(hygromycinphosphotransferase)抗性基因，使用連接酶將帶有saml酶接頭的草丁勝抗性基因 bar (phosphinotricinacetyltransferase)基因替換(圖1) (Tang etal.2006)。
[0062]pCAMBIA1300載體雙酶切體系總體積為40 μ 1，其中含有pCAMBIA3300質(zhì)粒8 μ 1、10ΧΚ 緩沖液(購自 Takara) 4 μ 1、BamH I 和 Hind III 各 I μ 1，雙蒸水 24 μ I。37°C酶切過夜后分別純化回收。連接反應體系中包含10XT4連接緩沖液I μ 1，T4DNA連接酶I μ 1，crylC*基因與載體pCAMBIA3300分別為4 μ I和I μ 1，并用雙蒸水補齊至10 μ 1，16°C連接過夜。之后以全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，并在含有100mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選，經(jīng)PCR檢測的陽性單克隆送測序，序列無誤的單克隆提取重組質(zhì)粒。攜帶目的基因的pCAMBIA3300載體雙酶切體系總體積為40 μ 1，其中含有pCAMBIA3300質(zhì)粒8μ 1、10XK緩沖液(購自Takara)4y l、samlly 1，雙蒸水25μ I。37°C酶切過夜后純化回收，得到去除潮霉素篩選基因的開鏈載體，與合成的bar基因進行連接，連接反應體系中包含10XT4連接緩沖液I μ 1，T4DNA連接酶I μ 1，bar基因與載體pCAMBIA3300分別為4μ I和I μ 1，并用雙蒸水補齊至10 μ 1，16°C連接過夜。之后以全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，并在含有100mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選，經(jīng)PCR檢測的陽性單克隆送測序，序列無誤的單克隆提取重組質(zhì)粒。應用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中并保存。
[0063](3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得:
[0064]利用基因槍介導轉(zhuǎn)化的方法，使用FOS1000/He biolistic gun and alldisposables from Bio-Rad(Hercules, CA)型基因槍，參照 Plant TransformationFacility (http://agron-www.agron.1astate.edu/ptf/)中提供的操作流程,將包裹有目的基因載體的金粉轟擊高滲培養(yǎng)后的胚性愈傷組織?；驑屴Z擊后恢復培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)入含有2mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2-3輪，每輪20-30天。篩選后將具有除草劑抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基分化成苗，得到Ttl代轉(zhuǎn)化單株。
[0065](4)基因組 DNA 的提取——CTAB 法(Soyle et al.):
[0066]I)取5g葉片，液氮研磨成粉(勿使材料融化)加入50mL離心管中；
[0067]2)加入 l5mLl.67XCTAB Buffer 充分混勻，65°C水浴 I 小時；
[0068]3)冷卻至室溫,加入15mL氯仿/異戍醇(24:1),輕輕搖晃混勻成乳池液,之后1000Orpm離心15分鐘；
[0069]4)將上清液轉(zhuǎn)入潔凈離心管，加2倍體積預冷的無水乙醇，輕輕顛倒數(shù)次，勾出DNA，放入另一潔凈的IOmL離心管；
[0070]5) 75%乙醇清洗DNA兩遍，室溫干燥2-3小時；
[0071]6)500μ L去離子水溶解DNA后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，再加入5μ L RNase (10mg/mL),37°C處理I小時；
[0072]7)加入500 μ L苯酚，充分混勻，離心5分鐘，上清轉(zhuǎn)入另一新離心管；
[0073]8)分別加入250 μ L苯酚和氯仿，充分混勻，離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)入另一新離心管；
[0074]9)加入500 μ L氯仿，充分混勻，離心5分鐘，上清液轉(zhuǎn)入潔凈的IOmL離心管；
[0075]10)加去離子水至3mL，然后加入1/10體積的3M NaAche2倍體積的預冷無水乙醇，上下顛倒數(shù)次；
[0076]11)75%乙醇清洗沉淀出的DNA兩次，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，室溫干燥并冗余500 μ L去離子水；
[0077]12)分光光度計測定DNA濃度。
[0078](5 )轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測:
[0079]1)PCR反應引物:使用目標基因序列設計PCR引物CrylO-F:gtccgttgaaagtgaatgat-3 和 CrylO-R:acacttacaagtggactc,目標片段 540bp ；
`[0080]2)PCR 反應體系:配制 20 μ LPCR 體系，包含 30ng 模板 DNA，2.0 μ LlOXbuffer, 1.0μ L2mMdNTPs, 1.5μ L25mM MgC12, 0.4 μ 110 μ M 引物和 1.5U Taq 酶；
[0081]3)PCR反應程序:在PCR儀上擴增_使用程序94°C變性5min ;94°C變性40s ；55°C退火45s ;72°C延伸50s ;共35個循環(huán)；72°C延伸5min ；
[0082]4)PCR產(chǎn)物使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。第3_8泳道分別為獨立轉(zhuǎn)化單株DNA為模板進行PCR擴增的條帶，均得到與陽性對照相同大小的540bp的特異性條帶。
[0083](6)基因槍轉(zhuǎn)化轟擊了 200塊愈傷組織，篩選得到9塊愈傷組織具有除草劑抗性。篩選、繼代擴繁后，分化得到120棵轉(zhuǎn)化單株獲得種子。其中PCR檢測篩選后得到87棵攜帶cry 1C*基因,命名為ZmKc。溫室種植，自交收獲Ttl代種子,用于后續(xù)表達驗證,功能驗證和遺傳穩(wěn)定性分析，選取其中的三株ZmKc-2-3，ZmKc-3-2, ZmKc-3-5作為田間抗性測試。
[0084]實施例2:
[0085]抗蟲轉(zhuǎn)基因植株后代整合與表達驗證，具體步驟如下:
[0086]T0代種子在武漢華中農(nóng)業(yè)大學田間種植，得T1代單株。拔節(jié)期使用CTAB法提取鮮葉DNA，使用目標基因序列設計PCR引物(CrylC*-F和CrylC*-R)進行PCR檢測，挑選攜帶目標基因的單株進行Southern雜交檢測，選取拷貝數(shù)較少的單株進行RT-PCR檢測和ELISA反應。
[0087](I)穗行種植轉(zhuǎn)基因植株種子，使用Ttl代相同的引物和PCR檢測方法，篩選攜帶目標基因的T1代單株進行后續(xù)驗證。
[0088](2) crylO基因整合情況Southern雜交檢測:
[0089]I)使用CTAB法提取鮮葉基因組DNA ；
[0090]2)基因組DNA酶切:15 μ g基因組DNA作為模板，限制性內(nèi)切酶BamHI配制50 μ L酶切體系，包含模板DNAlO μ L，酶(IOU/ μ L) 5 μ L，IOX Buffer5 μ L和無菌水30 μ L?；靹蚝?7°C酶切過夜；
[0091]3)酶切產(chǎn)物電泳:取5 μ L酶切產(chǎn)物進行電泳分離，檢查酶切效果；制備0.8%瓊脂糖凝膠，電泳分離酶切產(chǎn)物，開始使用高電壓，待溴酚藍跑出點樣孔2-3cm后降低電壓電泳10小時左右；
[0092]4)轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后，依次對凝膠進行如下處理:0.25M HCl中浸泡20分鐘，待凝膠中溴酚藍變成黃色；0.4M NaOH變性液中處理凝膠45分鐘；去離子水中浸泡30分鐘；
[0093]5)采用毛細管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后2X SSC漂洗尼龍膜，將尼龍月旲室溫晚干后80 C供I旲I小時，固定DNA樣品；
[0094]6)標記探針:使用PCR引物(CrylO-F和CrylO-R)擴增質(zhì)粒載體獲得540bp長度片段，使用隨機引物標記試劑盒配制反應體系=DNA模板，4.0 μ LPCR產(chǎn)物，2 μ L隨機引物，0.4μ LA/HindIII引物，7.6 μ LddH20，將上述體系混勻，95 °C變性3分鐘，迅速置于冰上 5 分鐘；加入試劑 10Xbuffer2.5μ L, dNTPs2.5 μ L, α -P [32] _dCTP5 μ L 和 kenowenzyme I μ L混勻后，37°C溫育1_2小時，95°C變性5分鐘后置于冰上5分鐘；
[0095]7)分子雜交:將已轉(zhuǎn)尼龍膜放入雜交管中，加入預熱的預雜交液，65°C預雜交4-6小時；換新雜交液，加入經(jīng)過雜交變性的探針，65°C雜交12-16小時；
[0096]8)洗膜:50mL2X SSC+0.5%SDS, 65°C洗膜 30 分鐘；50mLlX SSC+0.5%SDS, 65°C洗膜30分鐘；在洗膜過程中，不時采用放射性檢測儀對雜交膜進行檢測，以控制洗膜程度；
[0097]9)成像:洗膜結(jié)束后，取出尼龍膜，用保鮮膜包好，壓入磷屏中，12小時后掃描結(jié)果(圖3)。Southern雜交結(jié)果顯示T1代植株中crylC*基因具有1-4個拷貝。片段大小在4Kb至6.5Kb之間，其中大部分具有和陽性對照大小相似的片段。
[0098](3) cry 1C*基因表達情況RT-PCR檢測:
[0099]I)植物總 RNA 的提取(Trizol 法)(Chomczynski et al.):[0100]a)取玉米鮮葉0.lg，液氮冷凍研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入DEPC處理過的1.5mL離心管，加入 ImL Trizol (Invitrogen, USA),震蕩至徹底混勻；
[0101]b)室溫放置5分鐘后加入0.5mL氯仿，上下顛倒混勻；4°C, 12000rpm離心15分鐘，取上層轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管；
[0102]c)加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置30分鐘；
[0103]d) 40C，12000rpm離心15分鐘，棄掉上清，加lmL75%乙醇清洗；
[0104]e)4°C,12000rpm離心I分鐘，倒出液體；晾干管內(nèi)沉淀；
[0105]f)加 20 μ L 無 RNase 水，溶解 RNA。
[0106]2) RT-PCR 分析:
[0107]純化后取5ug 總 RNA,使用 M-MLV RTasecDNA Synthesis Kit (Takara, Japan)試劑盒進行RT-PCR反應，得到的cDNA為模板進行PCR反應檢測外源基因(圖3)。
[0108]a) PCR反應引物:使用目標基因序列設計PCR引物CrylO-F:gtccgttgaaagtgaatgat-3 和 CrylO-R:acacttacaagtggactc,目標片段 540bp ；
[0109]b)PCR 反應體系:配制 20μ LPCR 體系，包含 30ng 模板 DNA，2.0 μ LlOXbuffer, 1.0 μ L2mMdNTPs, 1.5μ L25mM MgC12, 0.4 μ 110 μ M 引物和 1.5U Taq 酶；
[0110]c)PCR反應程序:在PCR儀上擴增-使用程序94°C變性5min ;94°C變性40s ；55°C退火45s ;72°C延伸50s ;共35個循環(huán)；72°C延伸5min ；
[0111]d)PCR產(chǎn)物使用0.8%瓊脂`糖凝膠電泳檢測(圖4a)。泳道M:DNA分子量標記BM2000 ;泳道P:質(zhì)粒模板陽性對照；泳道W:未轉(zhuǎn)化單株RNA模板對照；泳道C:假陽性轉(zhuǎn)化單株RNA模板對照；泳道1-8:獨立轉(zhuǎn)化單株RNA為模板RT-PCR檢測。目標單株均獲得與陽性對照相同的540bp的電泳條帶。
[0112](4) CrylC*蛋白含量ELISA法測定:
[0113]I)選取RT-PCR檢測陽性的單株進行ELISA反應檢測CrylC*蛋白濃度。分別提取拔節(jié)期和灌漿期的葉片蛋白，使用ELISA反應檢測葉片中CrylC*蛋白含量。每個樣品取20mg新鮮葉片，于500 μ L提取緩沖液研磨均勻，靜置30分鐘吸取上清液20 μ L加入480 μ L提取緩沖液。ELISA 反應后，使用酶標儀(Multiskan ΜΚ3, Labsystem, P.R.China) 450nm 波長下檢測，依據(jù)檢測的結(jié)果可以計算出CrylC*蛋白含量。檢測結(jié)果顯示拔節(jié)期轉(zhuǎn)基因材料葉片CrylC*蛋白質(zhì)含量占葉片鮮重分別ZmKc-3-5為1.39 μ g/g,，ZmKc-2-3為4.03 μ g/g和ZmKc-3-2為2.97 μ g/g。而灌漿期這些材料中CrylC*蛋白含量在0.89 - 1.12 μ g/g之間(圖5)。整體變化趨勢表現(xiàn)為隨著植株從營養(yǎng)生長到生殖生長呈下降趨勢。
[0114]2)在蠟熟期，分別提取轉(zhuǎn)基因單株的不同組織:葉片、苞葉、雄穗、莖、雌穗、穗軸、花粉和籽粒。提取和檢測方法均與葉片中蛋白含量檢測方法相同，以ZmKc-2-3檢測結(jié)果分別為鮮葉中3.43μ8/^，苞葉中3.36μ8/^，雄穗中2.Tlyg/g，莖中0.99μ8/^，雌穗中
0.79 μ g/g,穗軸中2.71 μ g/g,花粉中0.19 μ g/g,籽粒中0.09 μ g/g。變化趨勢為營養(yǎng)器官中crylC*蛋白含量高于生殖器官，在籽粒中該蛋白含量最低。
[0115]實施例3:
[0116]攜帶crylC*的新材料田間抗性和表型分析,具體步驟如下:
[0117](I)田間抗性檢測
[0118]2011年田間種植T3代轉(zhuǎn)基因材料ZmKc-2-3, ZmKc-3-2, ZmKc-3-5株系和鄭58背景的ZmKc-2-3回交導入材料，以自交系鄭58為對照,全生育期不施用農(nóng)藥進行田間抗性鑒定，評估自然條件下亞洲玉米螟傷害。蟲害出現(xiàn)后第15天統(tǒng)計葉片被傷害的比例，對照鄭58葉片有43.71%被嚴重損傷，平均有5.75個葉片被損害，而轉(zhuǎn)基因單株葉片損傷不超過0.02個。待生長到乳熟期，統(tǒng)計莖桿被鉆蛀造成雄穗死亡的比例，對照受蟲害比例為39.36%，而轉(zhuǎn)基因植株幾乎沒有受到蟲害損傷(圖6)。
[0119](2)轉(zhuǎn)基因植株表型分析
[0120]以自交系鄭58為對照，測量鄭58為背景的轉(zhuǎn)基因?qū)氩牧媳硇?，每個材料調(diào)查100株計算平均值。成熟期測量株型(PT)、株高(PH)、穗位高(EH)和雄穗分支數(shù)(TB)，成熟期每行收獲12株測量穗長(EU、穗寬(EW)、穗行數(shù)(ER)、粒型(GT)和百粒重(HGW)。所有植株株型、雄穗分支數(shù)、穗長、穗寬、穗行數(shù)、粒型和百粒重均表現(xiàn)出一致性的特點。只有株高和穗位高比對照鄭58略高(表1)。
[0121]表1
[0122]
【權(quán)利要求】
1.一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建方法，其步驟如下: (1)按照常規(guī)方案制備胚性玉米愈傷組織； (2)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建: PCAMBIA3300BamH I_ind JJJ進行雙酶切消化并重新連接以基因獲得目的載體；然后使用限制性內(nèi)切酶切下載體上的潮霉素抗性基因，使用連接酶將帶有saml酶接頭的草丁膦抗性基因bar基因替換，獲得轉(zhuǎn)基因載體； (3)利用基因槍介導轉(zhuǎn)化的方法，將包裹有目的基因載體的金粉轟擊高滲培養(yǎng)后的胚性愈傷組織；基因槍轟擊后恢復培養(yǎng)7-10天后轉(zhuǎn)入含有2mg/L雙丙氨膦的篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2-3輪，每輪20-30天；篩選后將具有除草劑抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基分化成苗，得到一種可穩(wěn)定遺傳的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米單株； 所述的基因序列為SEQ ID` N0.1所示。
【文檔編號】A01H5/00GK103667340SQ201310651763
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】邱法展, 張祖新, 杜鄧襄, 張小波, 張方東, 鄭用璉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學