高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株hncs-93及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株BacillusthuringiensisHNCS-93及其應(yīng)用，保藏號(hào)：CGMCCNo.8446，該菌攜帶有殺蟲蛋白編碼基因cry1Ac和cry2Aa。該菌株以相對(duì)敏感小菜蛾、抗Btk小菜蛾、抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾為試蟲，經(jīng)毒力生物測(cè)定篩選對(duì)抗Bt及Cry1Ac毒蛋白小菜蛾有毒力的菌株。利用該菌株生產(chǎn)高效、廣譜的殺蟲劑，用于防治鱗翅目重要害蟲小菜蛾，同時(shí)對(duì)抗性害蟲具有很好的效果，有利于田間抗性小菜蛾的防治，提高了經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)人、畜及其他動(dòng)物無害，不污染環(huán)境，具有良好經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益，具有良好的應(yīng)用推廣前景。
【專利說明】高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株HNCS-93及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株高活性的蘇云金芽孢桿菌thuringiensis HNCS-93菌株，以及該蘇云金芽孢桿菌在防治鱗翅目害蟲或/和抗Bt鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽孢桿菌(ifeci77i/5.thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt),是一種分布非常廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌，在《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版中將其歸為第二類第十八群芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個(gè)種，種下區(qū)分不同的亞種。因貝利納(Berliner Ernst)于1911年在德國蘇云金地區(qū)的地中海粉螟(Anagastra kuehniella)中發(fā)現(xiàn)而得名。最初是由日本學(xué)者石渡在死亡的家蠶中分離到的，命名為Bt粹倒亞種(ifeci77i/5.thuringiensis subsp.scotto\在芽孢形成過程中，蘇云金桿菌可以產(chǎn)生多種類型的伴孢晶體蛋白，即δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)或殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein, ICPs),對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、銷翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲具有特異性的殺蟲活性，對(duì)線蟲(Nema todes)、螨類(Mi tes)和原生動(dòng)物(Protozoa)等也有控制作用。Bt,因其具有對(duì)害蟲高效、對(duì)人畜安全、對(duì)環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用，成為目前世界上應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的95%以上。
[0003]Bt殺蟲的主要因子是它的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,I CPs),昆蟲食入該毒蛋白晶體后，在中腸的聞PH環(huán)境和蛋白水解酶的作用下，毒蛋白晶體溶解并被激活。近30年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使人們對(duì)ICPs的分子結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，編碼Bt殺蟲晶體蛋白的基因被克隆、測(cè)序，轉(zhuǎn)入到了多種重要的糧棉作物中，如:棉花、玉米、馬鈴薯、煙草、水稻、番茄等，在減少害蟲危害、增加作物產(chǎn)量、減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染等方面發(fā)揮了重要作用(Zhaoet al, 2005)。自上世紀(jì)70年代以來，人類認(rèn)識(shí)和應(yīng)用Bt資源的速度和范圍得以空前發(fā)展。在我國，轉(zhuǎn)Bt基因作物的研究起步較晚，但進(jìn)展很快。在863高新技術(shù)計(jì)劃的資助下,于1991年開始了 Bt殺蟲基因CrylA人工合成，1992年底，中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心郭三堆等研究小組，在國內(nèi)首先合成了CrylA殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)基因，中科院田穎川、白永延等也先后合成和部分改造了 CrylA殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)基因，并導(dǎo)入煙草、甘藍(lán)和棉花中，獲得抗蟲植株。中科院生物技術(shù)研究所將人工合成的CrylA基因與修飾后的cirri即SCK基因組合在一起導(dǎo)入棉花中，成功研究出能同時(shí)產(chǎn)生兩種殺蟲蛋白的雙價(jià)抗蟲棉，并首次在國際上開發(fā)應(yīng)用。目前，國內(nèi)Bt基因?qū)朊藁ㄖ械难芯考吧唐坊a(chǎn)已有長(zhǎng)足發(fā)展。1995年，浙江大學(xué)核農(nóng)所舒慶堯等與加拿大渥太華大學(xué)合作，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將Bt基因?qū)搿靶闼?1"品種中，獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因植株，并于1998年通過浙江省技鑒委的技術(shù)鑒定，并定名為克螟稻，它是國內(nèi)第一個(gè)育成的自交繁殖代數(shù)最高，抗性遺傳最穩(wěn)定(100%抗性)、Bt毒蛋白含量表達(dá)最高(1%)、最具生產(chǎn)與育種應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲品系，并被農(nóng)業(yè)部生物基因工程安全管理委員會(huì)確定其生物安全等級(jí)為I級(jí)，即最安全等級(jí)。因該Bt基因?qū)Χ?、三化螟、大螟、稻縱卷葉螟、稻青蟲等8種水稻鱗翅目害蟲具有較高的抗性。由官春云教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組，采用基因工程技術(shù)將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入油菜細(xì)胞中，使油菜獲得抗蟲性，并在油菜中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。表達(dá)Bt殺蟲晶體蛋白(ICPs)的轉(zhuǎn)基因作物在害蟲防治中起著巨大的作用，對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響(Shelton，2002)。目前已發(fā)現(xiàn)對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella (L.)有毒力的基因有:cry IAa 'cry IAb 'cry IAc 'cry IB 'cry IC'cry IF、cry2A、cryl1、cry7Bal 取 cry劃、c/ySZ?,其中 crylAa、crylAb、crylAc 已在我國應(yīng)用。自1996年轉(zhuǎn)Bt cry基因作物的種植開始，轉(zhuǎn)Bt基因作物在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，種植面積逐年增長(zhǎng)。據(jù)2012年的統(tǒng)計(jì)顯示，轉(zhuǎn)Bt基因作物的種植面積已增長(zhǎng)至17，030萬公頃。[0004]蘇云金芽孢桿菌菌劑的應(yīng)用及轉(zhuǎn)Bt cry基因作物的種植，在控制田間害蟲方面效果顯著，有利于作物的產(chǎn)量和質(zhì)量的提高，同時(shí)減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)發(fā)揮了積極的作用。然而蘇云金芽孢桿菌制劑和轉(zhuǎn)Bt基因作物廣泛應(yīng)用，也使得部分害蟲對(duì)Bt產(chǎn)生了一定抗性。自1985年McGaughey報(bào)道了印度谷螟interpunctella (Huber)通過室內(nèi)選育對(duì)Bt產(chǎn)生抗性以來,害蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性這一課題就越來越引起科學(xué)家們的關(guān)注。小菜蛾iPlutella和粉紋夜蛾
fli)分別在田間和溫室對(duì)Bt制劑產(chǎn)生抗性。在田間，Kirsch和Schmutterer (1988)最早報(bào)道在菲律賓田間暴露于Bt殺蟲劑很多年的小菜蛾對(duì)Bt篩劑產(chǎn)生了抗藥性，隨后Tabashnik等(1990)報(bào)道在夏威夷田間小菜蛾也表現(xiàn)出對(duì)Bt產(chǎn)生了抗藥性，小菜蛾對(duì)Bt產(chǎn)生抗藥性終止了 Bt制劑對(duì)其控制作用。Shelton等(1993 )用兩種Bt殺蟲劑對(duì)1990年采于蕓苔植物的11個(gè)小菜蛾品系進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑連續(xù)使用很多年的佛羅里達(dá)地區(qū)的小菜蛾LC5tl最高，具有顯著差異。1992年又進(jìn)行了一些試驗(yàn)研究，對(duì)佛羅里達(dá)不同地區(qū)的小菜蛾用Bt殺蟲劑分別進(jìn)行田間及室內(nèi)生物測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對(duì)小菜蛾失去控制作用，表明小菜蛾對(duì)Bt殺蟲劑出現(xiàn)抗性。至今，小菜蛾在田間對(duì)Bt產(chǎn)生抗性在很多地區(qū)被發(fā)現(xiàn)(表1-1)。在溫室，粉紋夜蛾種群被報(bào)道能夠快速地對(duì)漢thuringiensis subsp.kurstaki產(chǎn)生抗性,達(dá)到一定程度的抗性水平,在實(shí)驗(yàn)室沒有Bt殺蟲劑選擇壓情況下,種群抗性水平會(huì)快速下降(Janmaat and Meyers Janmaat, 2003 )。
[0005]近幾年來，有報(bào)道稱某些主要靶標(biāo)害蟲在田間對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物產(chǎn)生抗性或耐受性增加。在美國東南部田間發(fā)現(xiàn)美洲棉鈴蟲對(duì)表達(dá)CrylAc的Bt棉花產(chǎn)生抗性(Tabashniket al.，2008);在南非發(fā)現(xiàn)了對(duì)表達(dá)CrylAb的Bt玉米產(chǎn)生抗性的玉米偕夜蛾種群(,Busseola fusca ) (Van Rensburg et al., 2007);另外在南非還發(fā)現(xiàn)了對(duì)表達(dá) CrylF 的Bt玉米產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾iSpdoptera frugiperda )種群；在我國的河北安慈和山東夏津，因連續(xù)多年大面積種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花,也發(fā)現(xiàn)了棉鈴蟲armigera、蝸群對(duì)轉(zhuǎn)CrylAc基因抗蟲棉的抗性水平呈明顯的上升趨勢(shì)
國內(nèi)，馮夏等報(bào)道深圳、東莞地區(qū)等供港菜區(qū)小菜蛾對(duì)Bt的抗藥性為17.2-30.2倍。李建洪等通過對(duì)深圳、東莞和廣州菜區(qū)的田間小菜蛾種群檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小菜蛾對(duì)蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)品Cs3ab-1991的抗藥性倍數(shù)分別為8.9,6.5,2.1倍。周程愛等報(bào)道長(zhǎng)沙地區(qū)的小菜蛾對(duì)Bt的抗藥性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍發(fā)展到2000年的6.2倍的低水平抗藥性。余德億等報(bào)道福建地區(qū)田間種群的小菜蛾對(duì)湖北Bt和福建Bt的抗藥性分別由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世儉等報(bào)道浙江省杭州、蕭山、金華、溫州四地的小菜蛾對(duì)Bt制劑還沒有產(chǎn)生抗藥性。王崇利等報(bào)道廣東惠州田間小菜蛾種群對(duì)CrylAb和CrylAc的抗性達(dá)到了高抗水平；對(duì)Btk制劑的抗性達(dá)到了中抗水平^CrylAa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江蘇南京田間小菜蛾種群對(duì)CrylAbXrylAc具有低至中等水平抗性(8_28倍)，對(duì)Btk制劑具有低水平抗性(3.5-7倍)。害蟲對(duì)Bt抗藥性的產(chǎn)生，是Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中有效性和持效性最大的威脅。
[0006]以上可以看出，小菜蛾對(duì)Bt產(chǎn)生的抗性問題已經(jīng)十分突出，因此篩選到對(duì)抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害蟲已迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于提供一株對(duì)抗Bt小菜蛾有高活性的蘇云金芽孢桿菌菌株，該菌株對(duì)鱗翅目害蟲、抗Btk鱗翅目害蟲以及抗CrylAc毒蛋白鱗翅目害蟲有毒殺作用，利用該菌株能開發(fā)一種廣譜、高效且對(duì)抗Bt害蟲有效的Bt殺蟲劑。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施: 從非正常飼養(yǎng)小菜蛾幼蟲體內(nèi)分離的一株蘇云金芽孢桿菌。用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)至伴孢晶體脫落。對(duì)相對(duì)敏感小菜蛾、抗Btk小菜蛾及抗CrylAc毒蛋白小菜蛾進(jìn)行生物測(cè)定，對(duì)上述供試害蟲均具有較強(qiáng)殺蟲作用。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析，分析菌株所含的殺蟲晶體蛋白基因類型。其命名為蘇云金芽孢桿菌Ilus thuringiensisHNCS-93 (簡(jiǎn)稱HNCS-93)。該菌株于2013年11月8日為中國微牛物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8446，經(jīng)檢測(cè)存活。
[0009]本發(fā)明與先有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明選擇了鱗翅目主要害蟲(小菜蛾)、為靶標(biāo)昆蟲，同時(shí)從田間采集對(duì)Bt (Kurstaki亞種)粉劑具抗性的小菜蛾種群并繼續(xù)汰選得到高抗的抗Bt小菜蛾種群和對(duì)CrylAc毒蛋白具有高抗的抗CrylAc毒蛋白小菜蛾種群，作為祀標(biāo)昆蟲，蘇云金芽孢桿菌也<^77心thuringiensis HNCS-93同時(shí)對(duì)上述鱗翅目主要害蟲及田間抗Bt及CrylAc毒蛋白害蟲，均具有較強(qiáng)的毒殺作用。利用該菌株生產(chǎn)高效、廣譜的殺蟲劑，用于防止鱗翅目重要害蟲小菜蛾，同時(shí)對(duì)抗性害蟲具有很好的效果，有利于田間抗性小菜蛾的防治，提高了經(jīng)濟(jì)價(jià)值，切對(duì)人、畜及其他動(dòng)物無害，不污染環(huán)境，具有良好經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益，具有良好的應(yīng)用推廣前景。由于Bt粉劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物的廣泛種植，小菜蛾對(duì)Bt抗性嚴(yán)重，對(duì)抗Bt小菜蛾有效的Bt殺蟲劑產(chǎn)品尚為見報(bào)道。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面通過【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
[0011]實(shí)施例1:菌株分尚與培養(yǎng)
1、從田間采集的非正常死亡小菜蛾幼蟲進(jìn)行表面處理，方法如下:用鑷子夾住幼蟲頭部，蘸取95%乙醇灼燒后，放入75%乙醇中2 S，再放入3%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，取出幼蟲用無菌水清洗3次。將處理好的蟲體放入裝有0.5 ml無菌水的1.5 ml離心管中打碎，制成蟲體懸液。取蟲體懸液0.1ml加入100ml無菌水中，30°C振蕩培養(yǎng)30min，在75_80°C水浴中熱處理14-20min。
[0012]2、將培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)濃度，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0013]3、培養(yǎng)3-4d后，挑選培養(yǎng)特征類似蘇云金桿菌的菌株涂片，用石碳酸復(fù)紅染色鏡檢，觀察有無伴孢晶體。
[0014]其中，分離培養(yǎng)基:牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、15~20 g瓊脂、水1000ml，調(diào)pH值至7.0。
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水lOOOmL，調(diào)pH值至7.0。
[0016]4、將產(chǎn)生芽孢和伴孢晶體的菌株檢出純化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，至伴孢晶體脫落。
[0017]5、取發(fā)酵液與TritonlOO混合均勻(TritonlOO終濃度為0.05%)，采用浸葉法對(duì)相對(duì)敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗CrylAc毒蛋白小菜蛾進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。具體方法:選老嫩適中的甘藍(lán)葉片洗凈晾干，剪成直徑2 cm大小，放入發(fā)酵液(含TritonlOO終濃度為0.05%)中，浸泡20s晾干，放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的平皿中。以無菌水混合TritonlOO (TritonlOO終濃度為0.05%)浸泡葉片作為對(duì)照。選取2-3齡小菜蛾幼蟲，每個(gè)處理10頭，設(shè)4個(gè)重復(fù)，置(溫度25°C、相對(duì)濕度65%-70%、光照比L:D=16:8)條件下飼養(yǎng)。3d后觀察小菜蛾幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率。
[0018]實(shí)施例2:菌株的鑒定
根據(jù)上述實(shí)施例1的實(shí)施方法，得到一株對(duì)鱗翅目害蟲、抗Bt鱗翅目害蟲、抗CrylAc毒蛋白鱗翅目害蟲及鞘翅目害蟲具有毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌菌株，命名為thuringiensis HNCS-93 (簡(jiǎn)稱 HNCS-93)，該菌株的保藏號(hào):CGMCC N0.8446。具體鑒定結(jié)果如下:
1、蘇云金芽孢桿菌thuringiensis HNCS-93的殺蟲活性:該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至伴孢晶體脫落，對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾iPlutella xylostalIa)相對(duì)敏感種群的致死中濃度(LC5tl)為5.07mg/L，對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾抗Btk種群的致死中濃度(LC5tl)為
6.57mg/L,對(duì)鱗翅目害蟲小菜蛾抗CrylAc毒蛋白種群的致死中濃度(LC5tl)為4.93mg/L。顯示出較強(qiáng)毒殺作用。
[0019]2、蘇云金芽孢桿菌thuringiensis HNCS-93的形態(tài)特征:菌落均呈白色圓形、扁平，表面干燥無光澤，邊緣缺刻；在普通LB平板上能生長(zhǎng)，為好氧菌；細(xì)胞桿狀，有鞭毛，革蘭氏染色為陽性，且一個(gè)營養(yǎng)細(xì)胞只有一個(gè)芽孢，芽孢為中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶體存在。
[0020]3、蘇云金芽孢桿菌thuringiensis HNCS-93的生理生化特性:
【權(quán)利要求】
1.一株對(duì)抗Bt小菜蛾有高活性的蘇云金芽孢桿菌{Bacillus thuringiensisHNCS-93)，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8446，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
2.如權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌在防治鱗翅目害蟲或/和抗Bt鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述鱗翅目害蟲是小菜蛾。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述小菜蛾是抗Bt小菜蛾。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK103667123SQ201310615159
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】符偉, 楊晶, 張卓, 方勇, 劉勇, 張德詠, 徐志德, 彭兆普, 馬明勇, 成燕清 申請(qǐng)人:湖南省植物保護(hù)研究所