一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組分及含量為NH4NO3400mg/L，MgSO4.7H2O370mg/L，CaCl2.2H2O95mg/L，Ca(NO3)2.4H2O695mg/L，KH2PO4340mg/L，K2SO4745mg/L，KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，ZnSO4.7H2O8.6mg/L，Na2Mo04.2H200.25mg/L，CuSO4.5H2O0.025mg/L，CoCl2.6H2O0.025mg/L，MnSO4.4H2O22.3mg/L，F(xiàn)eS04.7H2055.6mg/L，Na2-EDTA74.6mg/L。以本發(fā)明的配方為基本培養(yǎng)基，在初代培養(yǎng)基上莖段誘導(dǎo)率為82.5～90.5%，平均初代誘導(dǎo)率較在WPM培養(yǎng)基上提高3.7%；在繼代培養(yǎng)基上的增殖率平均為7.8，較在WPM培養(yǎng)基上的增殖率高9.0%。
【專利說明】一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到植物的組織培養(yǎng)，特別是涉及到藍(lán)莓的組織培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)莓(Blueberry)學(xué)名越桔，屬杜胃$花科(Ericaceae)越桔亞科(Vaccinioideae)越桔屬(Vacciniodeae)植物，多年生落葉或常綠灌木或小灌木。藍(lán)莓果實含有豐富的Vc、糖、酸及礦物質(zhì)，尤其富含花色素、S0D、果膠等營養(yǎng)保健成分，對改善人體大腦記憶和智力，增強(qiáng)心腦血管功能，改善視力，增強(qiáng)人體免疫力和組織抗氧化等有特效，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一。歐美的很多國家都把藍(lán)莓作為保健與功能食品。國際市場需求量大，供不應(yīng)求，市場售價昂貴。而且隨著人們生活水平和消費(fèi)能力提高，營養(yǎng)和保健意識增強(qiáng)，藍(lán)莓、樹莓、刺梨等小水果類因其營養(yǎng)和保健等作用日益受到消費(fèi)者喜愛，成為新興水果，發(fā)展前景廣闊。 [0003]我國藍(lán)莓種植和研究較晚，從20世紀(jì)80年代才開始引進(jìn)種植，但是近幾年呈迅猛態(tài)勢，在吉林、遼寧、山東、浙江、江蘇、貴州等地區(qū)種植面積大，經(jīng)濟(jì)效益顯著，開創(chuàng)了一條特色高效農(nóng)業(yè)發(fā)展之路。
[0004]傳統(tǒng)的扦插、壓條等繁殖方法繁殖系數(shù)和出苗率低，難以滿足迅速推廣優(yōu)良品種的需要。組織培養(yǎng)繁殖速度快，需要種苗少，能生產(chǎn)出無毒苗，因此被應(yīng)用于藍(lán)莓新品種的繁育。藍(lán)莓莖段培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、White、WPM( Woody PlantMedium )、改良 WPM (將 WPM 培養(yǎng)基中的 K2S04、CaCl2, FeSO4 和 Na2EDTA 以 KN03190mg/L、Ca(NO3)2.4H20684mg/L> C10H13FeN2NaO 873.4 mg /L 和鹽酸硫胺素 0.1 mg/L 代替)、knops培養(yǎng)基和B5等幾種。目前WPM及其改良型培養(yǎng)基是生產(chǎn)研究中較多為研究者所采用的基本培養(yǎng)基。
[0005]在組織培養(yǎng)中仍存在初代誘導(dǎo)率不高，育苗周期長，缺乏適合特定區(qū)域藍(lán)莓品種的適宜培養(yǎng)基。由于藍(lán)莓品種差異對培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分需求也有不同，因此通過組織培養(yǎng)方式生產(chǎn)藍(lán)莓種苗時依據(jù)品種需使用不同的培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明研究出一種適合我國南方地區(qū)栽植藍(lán)莓品種的、具有節(jié)約成本、初代誘導(dǎo)率和增殖率高，縮短育苗周期、芽的質(zhì)量好，得到的苗生根率高，出根能力強(qiáng)，葉片深綠色的
培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:.一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基其組分及含量為=NH4NO3 400 mg/L, MgSO4.7H20 370 mg/L, CaCl2.2H20 95 mg/L,Ca (NO3) 2.4H20 695 mg/L, KH2PO4 340 mg/L, K2SO4 745 mg/L, KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, ZnSO4.7H20 8.6 mg/L, Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H200.025 mg/L, MnSO4.4H20 22.3 mg/L, FeSO4.7H20 55.6 mg/L, Na2-EDTA 74.6 mg/L,甘氨酸2.0mg/L，肌醇 100 mg/L，鹽酸硫胺素(VB1) 1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L，煙酸 0.5mg/L,鹿糖30 g/L，瓊脂7.0 g/L, pH為5.4,余量為蒸懼水。
[0008]培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40-70°C時加入無菌ZT，pH值調(diào)至5.4。
[0009]培養(yǎng)基滅菌后最好冷卻至40-50°C時加入無菌ZT，pH值調(diào)至5.4。
[0010]ZT 加入量為 l-2mg/L。
[0011]一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的制備方法，包括步驟:
①.大量元素A液，其組分及含量為=NH4NO38.0g/L, MgSO4.7H20 7.4g/L ；
B 液，其組分及含量為=CaCl2.2H20 1.9 g/L, Ca(NO3)2.4Η2013.9 g/L ；
C 液，其組分及含量為=KH2PO4 6.8g/L，K2SO4H.9 g/L ；
②微量元素，其組分及含量為=KI0.083 g/L, H3BO3 0.62 g/L, ZnSO4.7H20 0.86 g/L,Na2MoO4.2H20 0.025 g/L, CuSO4.5H20 0.0025 g/L, CoCl2.6H20 0.0025 g/L, MnSO4.4H20
2.23 g/L ；
③鐵鹽，其組分及含量為=FeSO4.7H20 2.78 g/L，Na2-EDTA 3.73 g/L ；
④有機(jī)元素:Vb其組分及含量為:鹽酸硫胺素0.1 8/1，鹽酸吡哆醇0.05 g/L，煙酸0.05 g/L ；
甘氨酸含量為:0.2 g/L ；
肌醇含量為:10.0 g/L。
[0012]其中混合配制IL培養(yǎng)基的用量為A液、B液、C液各50ml，鐵鹽20ml，微量元素、甘氨酸、肌醇、VB各10ml，蔗糖30 g/L，瓊脂7.0 g/L，余量是蒸餾水；
⑤將上述配制好的培養(yǎng)基121°C溫度下滅菌20min.。
[0013]培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40_50°C時加入無菌ZT, pH值調(diào)至5.4。
[0014]ZT 加入量為 l_2mg/L。
[0015]有益效果
以本發(fā)明的配方為基本培養(yǎng)基，在初代培養(yǎng)基上莖段誘導(dǎo)率為82.5~90.5%，平均初代誘導(dǎo)率較在WPM培養(yǎng)基上提高3.7% ;在繼代培養(yǎng)基上的增殖率平均為7.8，較在WPM培養(yǎng)基上的增殖率高9.0%。苗生根率高，苗木健壯，育苗周期短，降低了成本，提高了苗木繁殖效率。
[0016]【具體實施方式】:
1、培養(yǎng)基的制備及滅菌
按照本培養(yǎng)基組分及含量配制母液:大量元素A液(NH4NO3 8.0g/L, MgSO4.7H20 7.4g/L, )、B 液(CaCl2.2H20 1.9 g/L, Ca(NO3)2.4Η2013.9 g/L)、C 液(KH2PO4 6.8g/L, K2SO4H.9g/L)，微量元素(ΚΙ 0.083 g/L, H3BO3 0.62 g/L, ZnSO4.7H20 0.86 g/L, Na2MoO4.2H20 0.025g/L, CuS04.5H20 0.0025 g/L, CoCl2.6H20 0.0025 g/L, MnSO4.4H20 2.23 g/L)、鐵鹽(FeS04.7H20 2.78 g/L，Na2_EDTA 3.73 g/L)、甘氨酸(0.2 g/L)、肌醇(10.0 g/L)、VB (鹽酸硫胺素0.1 g/L,鹽酸吡哆醇0.05 g/L,煙酸0.05 g/L)各1L。配制IL培養(yǎng)基的用量為A液、B液、C液各50ml，鐵鹽20ml，微量元素、甘氨酸、肌醇、VB各10ml。加入瓊脂7.0 g/L,蔗糖30.0 g/L,加蒸餾水定容至1L，煮沸后，裝入IL容量瓶中。在121°C溫度下滅菌20min。在超凈工作臺上，用無菌(0.22um微孔濾膜)過濾器過濾1.0 mg/ml的ZT溶液。滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至40-70°C，最好是40 - 50°C時每升加入l_2ml 1.0 mg/ml無菌ZT溶液，PH調(diào)至5.4。其中ZT -zeatin,玉米素，從玉米嫩籽中分離出的一種存在于高等植物中的天然細(xì)胞分裂素；分子式:c1(ih13n5o。
[0017]2、外植體莖段的初代培養(yǎng)
2.1初代培養(yǎng)基
培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40-70°C，最好是40 - 50°C時用無菌移液槍每升中加入2ml
1.0 mg/ml的無菌ZT溶液，搖勻后分裝到30根無菌試管中。將7-8cm莖段，70%酒精處理30s+0.l%HgCl26-8min，剪成單芽莖段接種在改良WPM+2mg/LZT的培養(yǎng)基上。。
[0018]2.2莖段誘導(dǎo)
4-6月份，剪取生長健壯，無病蟲害的當(dāng)年生枝條，去掉葉片，葉柄留l_2mm，剪成7~8cm的莖段，流水沖洗lh。在超凈臺上先在IL盛裝70%酒精的燒杯中浸泡30s，無菌水沖洗3次,再在IL盛裝0.1% HgCl2的燒杯中消毒6~8min,無菌水沖洗5次,每次5min,無菌濾紙吸干水分后剪成1.0-1.5cm單芽莖段，接種到分裝培養(yǎng)基的試管中。25°C，黑暗培養(yǎng)7d后，每天光照培養(yǎng)14h，光強(qiáng)19001x，黑暗培養(yǎng)lOh，40-50d后繼代。
[0019]誘導(dǎo)率=(萌芽莖段數(shù)/接種莖段數(shù))X 100%
3個品種接種在改良WPM培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率為82.5-90.5%,較在WPM培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率分別高4.1%, 1.9%, 5.2%。品種間誘導(dǎo)率有差異，其中都克 > 藍(lán)雨 > 燦爛。
[0020]表1不同品種芽誘導(dǎo)率
【權(quán)利要求】
1.一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基其組分及含量為:NH4NO3 400 mg/L, MgSO4.7H20 370 mg/L, CaCl2.2H20 95 mg/L, Ca (NO3) 2.4H20 695 mg/L,KH2PO4 340 mg/L, K2SO4 745 mg/L, KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, ZnSO4.7H20 8.6 mg/L,Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L,MnSO4.4H20 22.3mg/L, FeSO4.7H20 55.6 mg/L, Na2-EDTA 74.6 mg/L,甘氨酸 2.0mg/L,肌醇 100 mg/L,鹽酸硫胺素(VB1 )1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L，煙酸 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 7.0g/L,余量為蒸懼水。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40-70°C時加入無菌ZT，pH值調(diào)至5.4。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40-50°C時加入無菌ZT，pH值調(diào)至5.4。
4.如權(quán)利要求2或3所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述的ZT加入量為l_2mg/L。
5.一種用于藍(lán)莓組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的制備方法，包括步驟: ①.大量元素A液，其組分及含量為=NH4NO38.0g/L, MgSO4.7H20 7.4g/L ；
B 液，其組分及含量為=CaCl2.2H20 1.9 g/L, Ca(NO3)2.4Η2013.9 g/L ； C 液，其組分及含量為=KH2PO4 6.8g/L，K2SO4H.9 g/L ；
②微量元素，其組分及含量為=KI0.083 g/L, H3BO3 0.62 g/L, ZnSO4.7H20 0.86 g/L,Na2MoO4.2H20 0.025 g/L, CuSO4.5H20 0.0025 g/L, CoCl2.6H20 0.0025 g/L, MnSO4.4H202.23 g/L ；` ③鐵鹽，其組分及含量為=FeSO4.7H20 2.78 g/L，Na2-EDTA 3.73 g/L ； ④有機(jī)元素:Vb其組分及含量為:鹽酸硫胺素0.1 8/1，鹽酸吡哆醇0.05 g/L，煙酸0.05 g/L ；
甘氨酸含量為:0.2 g/L ；
肌醇含量為:10.0 g/L ； 其中混合配制IL培養(yǎng)基的用量為A液、B液、C液各50ml，鐵鹽20ml，微量元素、甘氨酸、肌醇、VB各10ml，蔗糖30.0g，瓊脂7.0g，余量是蒸餾水； ⑤將上述配制好的培養(yǎng)基121°C溫度下滅菌20min.。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40-50°C時加入無菌ZT，pH值調(diào)至5.4。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述的ZT加入量為l_2mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103548697SQ201310546475
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】涂俊凡, 秦仲麒, 李先明, 楊夫臣, 朱紅艷, 伍濤 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所