一種液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種的方法及其保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種的方法及其保藏方法，其工藝步驟和工藝參數(shù)為：篩選液體培養(yǎng)高效菌株:優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，培養(yǎng)的菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm；搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖1-3%、玉米粉2-4%、酵母粉0.2-0.4%、麩皮1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO40.5-1.0%、PH值自然；提出了茶樹菇液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基配方；建立了茶樹菇液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝條件。本發(fā)明把發(fā)酵工程技術(shù)與茶樹菇生物學(xué)特性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，不僅獲得高質(zhì)量的茶樹菇液體菌種，并能有效地降低茶樹菇生產(chǎn)成本。液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種技術(shù)解決了茶樹菇生產(chǎn)菌種上的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明工藝生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、接種后出菇整齊，便于管理。
【專利說(shuō)明】一種液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹薛菌種的方法及其保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種的方法及其保藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菌種的生產(chǎn)是茶樹菇生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。食用菌菌種生產(chǎn)方法主要有固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種。目前，茶樹燕菌種的培養(yǎng)方式主要是固體培養(yǎng)。固體培養(yǎng)方式存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、菌齡不一致、生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)效率低、不便于機(jī)械化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)。液體培養(yǎng)生產(chǎn)食用菌菌種是一項(xiàng)多因素的生產(chǎn)技術(shù)，它涉及到菌株、用料及配方、深層發(fā)酵工藝等，工藝路線和工藝參數(shù)顯著影響到食用菌生產(chǎn)產(chǎn)量、質(zhì)量和效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于:提供一種米用液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹燕菌種的方法，將工業(yè)化生物液體發(fā)酵技術(shù)運(yùn)用到茶樹菇菌種生產(chǎn)領(lǐng)域，在相對(duì)可控的環(huán)境和設(shè)施條件下，高效率地組織起茶樹菇菌種生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)一條新型的茶樹菇菌種生產(chǎn)工藝。
[0004]本發(fā)明涉及液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種的方法，其工藝步驟和工藝參數(shù)為:
1、液體培養(yǎng)高效菌株的篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，培養(yǎng)的菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑L O-L 5ml。
[0005]2、搖瓶培養(yǎng)基配方
葡萄糖 1-3%、玉米粉 2-4%、酵母粉 0.`2-0.4%、麩皮 1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO4
0.5-1.0%、PH 值自然。
[0006]3、搖瓶培養(yǎng)工藝參數(shù):搖瓶裝料系數(shù)為20-30%、24_26°C下靜止培養(yǎng)時(shí)間為2_3天，搖瓶培養(yǎng)溫度為23-25°C、搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180-200r/min、搖瓶培養(yǎng)時(shí)間為3_4天，搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量為900-1200個(gè)/ml、菌球直徑為0.5-1毫米，培養(yǎng)液澄清度90%以上。
[0007]4、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方
馬鈴薯 15-25%、麥麩 2-4%、蛋白胨 2-4%,KH2PO40.1-0.15%,MgSO4 *7 H2O 0.05-0.1%、酵母粉0.2-0.4%、消泡劑1%。
[0008]5、發(fā)酵罐培養(yǎng)參數(shù)
發(fā)酵罐裝料系數(shù)為50-60%、接種量為10-15%、培養(yǎng)溫度為24-26 °C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為150-200r/min，通氣量為1:0.5-0.6V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間3_4天，發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌絲體含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量為200-260個(gè)/ml、菌球直徑為1.0-1.5ml、培養(yǎng)液澄清度90%以上、pH值為3.0-4.0。
[0009]6、茶樹菇液體菌種保藏
茶樹菇液體菌種保藏方法為:低溫、密閉條件下保藏。保藏有效期和保藏溫度對(duì)應(yīng)如下:保藏溫度為0-5°C時(shí)保藏有效期10-12天；保藏溫度為6-10°C時(shí)保藏有效期8_10天；保藏溫度為11_16°C時(shí)保藏有效期5-8天；保藏溫度為17-19°C時(shí)保藏有效期3_5天；保藏溫度為20-22°C時(shí)保藏有效期2-3天。
[0010]本發(fā)明以菌球數(shù)量、大小、表面毛刺多少、菌體得率為指標(biāo)篩選液體培養(yǎng)茶樹菇高效菌株；依據(jù)茶樹菇的生物學(xué)特性，以菌種生物量和菌種活性(接種后萌發(fā)時(shí)間、菌絲長(zhǎng)速)為檢驗(yàn)指標(biāo)，確定茶樹菇液體菌種搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方；以茶樹菇液體菌種性狀(密度、直徑)和菌種活性(萌發(fā)時(shí)間、菌絲長(zhǎng)速)為指標(biāo)，確定茶樹菇液體菌種搖瓶培養(yǎng)裝料系數(shù)、培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速和接種量的條件組合；按照茶樹菇搖瓶培養(yǎng)菌體生物量、搖瓶質(zhì)量變化隨培養(yǎng)時(shí)間的變化規(guī)律和菌種活性來(lái)判定茶樹菇菌種液體培養(yǎng)終點(diǎn)；依據(jù)發(fā)酵罐工作原理，以菌球直徑、菌球密度、菌絲體生物量為指標(biāo)和培養(yǎng)液PH變化規(guī)律來(lái)確定發(fā)酵罐液體培養(yǎng)裝料系數(shù)、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、接種量、發(fā)酵時(shí)間；以菌種活性(接種后萌發(fā)時(shí)間、菌絲長(zhǎng)速)為指標(biāo)確定茶樹菇液體菌種保藏方法。
[0011]本發(fā)明把發(fā)酵工程技術(shù)與茶樹菇生物學(xué)特性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，不僅獲得高質(zhì)量的茶樹菇液體菌種，并能有效地降低茶樹菇生產(chǎn)成本。液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種技術(shù)解決了茶樹菇生產(chǎn)菌種上的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，改變了目前茶樹菇菌種“試管一瓶子一小袋一大袋”的生產(chǎn)方式，為實(shí)現(xiàn)茶樹菇生產(chǎn)的規(guī)?；?、集約化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供配套技術(shù)。
[0012]本發(fā)明工藝具有以下特點(diǎn):
1、生產(chǎn)周期短。采用傳統(tǒng)的茶樹菇斜面母種一固體原種一固體栽培種的茶樹菇菌種生產(chǎn)方式，需要70天左右，而采用茶樹菇斜面母種一搖瓶菌種一發(fā)酵罐液體菌種的生產(chǎn)方式，生產(chǎn)周期只要20天左右。
[0013]2、生產(chǎn)成本低。相比固體菌種生產(chǎn)，不僅所需原料便宜，而且由于不使用傳統(tǒng)的菌種瓶或菌種袋，可省去裝瓶、挖瓶、接種等很多繁雜工藝，同時(shí)由于采取配套的高效率接種機(jī)和接種槍等接種工具接種，可節(jié)省大量的勞動(dòng)力、電耗和空間等，所以可降低生產(chǎn)成本。
[0014]3、接種后出菇整齊，便于管理。由于液體菌種菌齡一致、流動(dòng)性好、活性強(qiáng)、萌發(fā)點(diǎn)多，接種后菌絲萌發(fā)快，生長(zhǎng)速度一致，現(xiàn)蕾和出菇的時(shí)間一致性好，便于采收、管理和加工，可提高栽培效益。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
實(shí)施例1
本發(fā)明提供一種液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種的方法，其工藝步驟和工藝參數(shù)為:
1.液體培養(yǎng)高效菌株篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，其菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5ml ；
2.搖瓶培養(yǎng)
①搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖1_3%、玉米粉2-4%、酵母粉0.2-0.4%、麩皮1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%, MgSO4 0.5-1.0%、PH 值自然。
[0016]②搖瓶培養(yǎng)基配制:先清洗搖瓶，然后進(jìn)行空滅，滅菌方法同常規(guī)。按照搖瓶培養(yǎng)基配方稱取原料，土豆切片煮沸后維持10-15min，過(guò)濾后取濾液，麥麩煮沸后維持10-15min,過(guò)濾后取濾液,其余原料加熱溶解后與過(guò)濾液一起裝瓶，搖瓶裝料系數(shù)為20-30%，在溫度 121°C、壓力 0.15Mpa 下滅菌 30_40min。
[0017]③搖瓶培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)基滅菌后冷卻到28°C以下，按照無(wú)菌操作要求，在搖瓶培養(yǎng)基液面上接入3-4塊黃豆大小的斜面種子,菌種面朝上，24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)2-3天后，在溫度23-25°C、轉(zhuǎn)速180-200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)3_4天。發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量900-1200個(gè)/ml、菌球直徑0.5-1毫米、培養(yǎng)液澄清度90%以上。
[0018]3、發(fā)酵罐培養(yǎng)
①發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:馬鈴薯15-25%、麥麩2-4%、蛋白胨2-4%、KH2PO40.1-0.15%、MgSO4.7 H2O 0.05-0.1%、酵母粉 0.2-0.4%、豆油 1%。
[0019]②發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)液的配制及過(guò)濾同搖瓶培養(yǎng)基配制方法。
[0020]③發(fā)酵罐清洗和空滅:將發(fā)酵罐清洗后在溫度121-126°C、壓力0.12-0.15Mpa下滅菌 30_50min。
[0021]④上料:發(fā)酵罐空滅后從投料口加入配制好的培養(yǎng)液和豆油，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為50-60%，打開氣泵攪拌2-3min，在溫度121°C、壓力0.12-0.15Mpa下滅菌40_45min。
[0022]⑤滅菌:料液裝罐后在溫度123°C、壓力0.12Mpa條件下滅菌30_40min。
[0023]⑥接種:培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25_28°C，按照無(wú)菌操作要求，將搖瓶菌種按無(wú)菌操作要求從進(jìn)料口接入發(fā)酵罐，接種量10-15%。
[0024]⑦發(fā)酵罐培養(yǎng):啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)溫度24-26°C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為150-200r/min，通氣量 1:0.5V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間 3-4 天。
[0025]⑧發(fā)酵終點(diǎn)判定:接種24小時(shí)`后，每隔12小時(shí)，在火焰控制下從接種口取樣觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5ml，培養(yǎng)液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
[0026]本發(fā)明技術(shù)指標(biāo):相比固體菌種生產(chǎn)成本節(jié)省60%，污染率1.5%以下，菌種培養(yǎng)時(shí)間縮短18-21天，出菇時(shí)間縮短8-10天，茶樹菇產(chǎn)量提高16%。
[0027]實(shí)施例2:
1.液體培養(yǎng)高效菌株篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，其菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm ；
2.搖瓶培養(yǎng)
①搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖1%、玉米粉4%、酵母粉0.3%、麩皮2.0%、KH2PO40.5%、MgSO40.8%、PH值自然。
[0028]②搖瓶培養(yǎng)基配制:先清洗搖瓶，然后進(jìn)行空滅，滅菌方法同常規(guī)。按照搖瓶培養(yǎng)基配方稱取原料，土豆切片煮沸后維持15min,過(guò)濾后取濾液,麥麩煮沸后維持15min,過(guò)濾后取濾液，其余原料加熱溶解后與過(guò)濾液一起裝瓶，搖瓶裝料系數(shù)25%，在溫度121°C、壓力0.15Mpa 下滅菌 35min。
[0029]③搖瓶培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)基滅菌后冷卻到26°C，按照無(wú)菌操作要求，在搖瓶培養(yǎng)基液面上接入3塊黃豆大小的斜面種子，菌種面朝上，24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)3天后，在溫度23-25°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)4天。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量900-1200個(gè)/ml、菌球直徑0.5-lmm和培養(yǎng)液澄清度90%。[0030]3.發(fā)酵罐培養(yǎng)
①發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:馬鈴薯25%、麥麩2%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO4.7 H2O
0.06%、酵母粉0.2%、豆油1%。
[0031]②發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)液的熬制、過(guò)濾同搖瓶培養(yǎng)基配制方法。
[0032]③發(fā)酵罐清洗和空滅:將發(fā)酵罐清洗后在溫度121°C、壓力0.12Mpa下空滅30min。
[0033]④上料:發(fā)酵罐空滅后從投料口加入配制好的培養(yǎng)液和1%豆油，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60%,打開氣泵攪拌3min。
[0034]⑤滅菌:將料液在溫度121 °C、壓力0.12下滅菌45min。
[0035]⑥接種:培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25°C，按照無(wú)菌操作要求，將搖瓶菌種按無(wú)菌操作要求從進(jìn)料口接入發(fā)酵罐，接種量15%。
[0036]⑦發(fā)酵罐培養(yǎng):啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)溫度26°C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為180r/min，通氣量1:0.5V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間4天。
[0037]⑧發(fā)酵終點(diǎn)判定:接種24小時(shí)后，每隔12小時(shí)，在火焰控制下從接種口取樣觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌絲體含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm,培養(yǎng)液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
[0038]本發(fā)明技術(shù)指標(biāo):相比固體菌種生產(chǎn)成本節(jié)省60%，污染率1.5%以下，菌種培養(yǎng)時(shí)間縮短18-21天，出菇時(shí)間縮短8-10天，茶樹菇產(chǎn)量提高16%。
[0039]實(shí)施例3:
1.液體培養(yǎng)高效菌株篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，其菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm。
[0040]2.搖瓶培養(yǎng)
①搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖3%、玉米粉2%、酵母粉0.2%、麩皮1.0%、KH2PO4L 5%、MgSO41.0%、PH值自然。
[0041]②搖瓶培養(yǎng)基配制:先清洗搖瓶，然后進(jìn)行空滅，滅菌方法同常規(guī)。按照搖瓶培養(yǎng)基配方稱取原料，土?切片煮沸后維持IOmin,過(guò)濾后取濾液,麥鉄煮沸后維持IOmin,過(guò)濾取濾液，其余原料加熱溶解后與過(guò)濾液一起裝瓶，搖瓶裝料系數(shù)20%，在溫度121°C、壓力
0.15Mpa 下滅菌 35min。
[0042]③搖瓶培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)基滅菌后冷卻到28°C，按照無(wú)菌操作要求，在搖瓶培養(yǎng)基液面上接入3塊黃豆大小的斜面種子，菌種面朝上，24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)3天后，在溫度23-25°C、轉(zhuǎn)速200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)3天。發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量900-1200個(gè)/ml、菌球直徑0.5-lmm和培養(yǎng)液澄清度92%。
[0043]3.發(fā)酵罐培養(yǎng)
①發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:馬鈴薯15%、麥麩4%、蛋白胨4%、KH2PO40.1%、MgSO4.7 H2O
0.08%、酵母粉0.4%、菜油1%。
[0044]②發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)液的熬制、過(guò)濾同搖瓶培養(yǎng)基配制方法。
[0045]③發(fā)酵罐清洗和空滅:發(fā)酵罐清洗后在溫度121°C、壓力0.12Mpa下空滅30min。[0046]④上料:發(fā)酵罐空滅后從投料口加入配好的培養(yǎng)液和菜油1%，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為50%，打開氣泵攪拌2min。
[0047]⑤滅菌:將料液在溫度121 °C、壓力0.12下滅菌45min。
[0048]⑥接種:培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25°C，按照無(wú)菌操作要求，將搖瓶菌種從進(jìn)料口接入發(fā)酵罐，接種量為10%。
[0049]⑦發(fā)酵罐培養(yǎng):啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)溫度24°C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為180r/min，通氣量1:0.6V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間3天。
[0050]⑧發(fā)酵終點(diǎn)判定:接種24小時(shí)后，每隔12小時(shí)，在火焰控制下從接種口取樣觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌絲體含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5ml，培養(yǎng)液澄清度90%, pH值3.0-4.0。
[0051]實(shí)施例4:
1.液體培養(yǎng)高效菌株篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，其菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm ；
2.搖瓶培養(yǎng)
①搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖2%、玉米粉3%、酵母粉0.3%、麩皮3.0%, KH2PO4L O %、MgSO40.5%、PH值自然。
[0052]②搖瓶培養(yǎng)基配制:先清洗搖瓶，然后進(jìn)行空滅，滅菌方法同常規(guī)。按照搖瓶培養(yǎng)基配方稱取原料，土?切片煮沸后維持12min,過(guò)濾后取濾液,麥鉄煮沸后維持12min,過(guò)濾后取濾液，其余原料加熱溶解后與過(guò)濾液一起裝瓶，搖瓶裝料系數(shù)為24%，在溫度121 °C、壓力 0.15Mpa 下滅菌 35min。
[0053]③搖瓶培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)基滅菌后冷卻到26°C，按照無(wú)菌操作要求，在搖瓶培養(yǎng)基液面上接入3塊黃豆大小的斜面種子，菌種面朝上，24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)3天后，在溫度23-25°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)4天。發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量900-1200個(gè)/ml、菌球直徑0.5-lmm和培養(yǎng)液澄清度93%。
[0054]3.發(fā)酵罐培養(yǎng)
①發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:馬鈴薯20%、麥麩2%、蛋白胨3%、KH2PO40.12%、MgSO4.7 H2O 0.1%、酵母粉0.4%、豆油1%。
[0055]②發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)液的熬制、過(guò)濾同搖瓶培養(yǎng)基配制方法。
[0056]③發(fā)酵罐清洗和空滅:將發(fā)酵罐清洗后在溫度121°C、壓力0.12Mpa下空滅30min。
[0057]④上料:發(fā)酵罐空滅后從投料口加入配好的培養(yǎng)液和1%豆油，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為55%,打開氣泵攪拌3min。
[0058]⑤滅菌:將料液在溫度121 °C、壓力0.12下滅菌45min。
[0059]⑥接種:培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25°C，按照無(wú)菌操作要求，將搖瓶菌種按無(wú)菌操作要求從進(jìn)料口接入發(fā)酵罐，接種量為12%。
[0060]⑦培養(yǎng):啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)溫度26°C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為190r/min，通氣量1:0.5V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間4天。
[0061]⑧發(fā)酵終點(diǎn)判定:接種24小時(shí)后，每隔12小時(shí)，在火焰控制下從接種口取樣觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm,培養(yǎng)液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
[0062]實(shí)施例5:
1.液體培養(yǎng)高效菌株篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，其菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5ml ；
2.搖瓶培養(yǎng) ①搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖2%、玉米粉2%、酵母粉0.2%、麩皮3.0%、KH2PO4L 2%、MgSO40.9%、PH值自然。
[0063]②搖瓶培養(yǎng)基配制:先清洗搖瓶，然后進(jìn)行空滅，滅菌方法同常規(guī)。按照搖瓶培養(yǎng)基配方稱取原料，土豆切片煮沸后維持15min,過(guò)濾后取濾液,麥麩煮沸后維持15min,過(guò)濾后取濾液，其余原料加熱溶解后與濾液一起裝瓶，搖瓶裝料系數(shù)25%，在溫度121°C、壓力
0.15Mpa 下滅菌 35min。
[0064]③搖瓶培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)基滅菌后冷卻到26°C，按照無(wú)菌操作要求，在搖瓶培養(yǎng)基液面上接入4塊黃豆大小的斜面種子，菌種面朝上，24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)3天后，在溫度23-25°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)4天。發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量900-1200個(gè)/ml、菌球直徑0.5-1毫米和培養(yǎng)液澄清度92%。
[0065]3.發(fā)酵罐培養(yǎng)
①發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:馬鈴薯25%、麥麩2%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO4.7 H2O0.06%、酵母粉0.2%、豆油1%。
[0066]②發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)液的熬制、過(guò)濾同搖瓶培養(yǎng)基配制方法。
[0067]③發(fā)酵罐清洗和空滅:將發(fā)酵罐清洗后在溫度121°C、壓力0.12Mpa下空滅30min。
[0068]④上料:發(fā)酵罐空滅后從投料口加入配好的培養(yǎng)液和1%豆油，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60%,打開氣泵攪拌3min。
[0069]⑤滅菌:在溫度121 °C、壓力0.12下滅菌45min。
[0070]⑥接種:培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25°C，按照無(wú)菌操作要求，將搖瓶菌種從進(jìn)料口接入發(fā)酵罐，接種量為15%。
[0071]⑦培養(yǎng):啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)溫度26°C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為180r/min，通氣量1:0.5V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間4天。
[0072]⑧發(fā)酵終點(diǎn)判定:接種24小時(shí)后，每隔12小時(shí)，在火焰控制下從接種口取樣觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌絲體含量不再增加，菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm,培養(yǎng)液澄清度91%，pH值3.0-4.0。
[0073]實(shí)施例6:
1.液體培養(yǎng)高效菌株篩選
優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，其菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5ml ；
2.搖瓶培養(yǎng)
①搖瓶培養(yǎng)基配方:葡萄糖3%、玉米粉3%、酵母粉0.3%、麩皮2.0%、KH2PO4L 0%、MgSO40.8%、PH值自然。
[0074]②搖瓶培養(yǎng)基配制:先清洗搖瓶，然后進(jìn)行空滅，滅菌方法同常規(guī)。按照搖瓶培養(yǎng)基配方稱取原料，土豆切片煮沸后維持15min,過(guò)濾后取過(guò)濾濾液,麥麩煮沸后維持15min,過(guò)濾取濾液，其余原料加熱溶解后與濾液一起裝瓶，搖瓶裝料系數(shù)25%，在溫度121°C、壓力
0.15Mpa 下滅菌 35min。
[0075]③搖瓶培養(yǎng):搖瓶培養(yǎng)基滅菌后冷卻到26°C，按照無(wú)菌操作要求，在搖瓶培養(yǎng)基液面上接入3塊黃豆大小的斜面種子，菌種面朝上，24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)3天后，在溫度23-25°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)4天。發(fā)酵終點(diǎn)判斷:菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量900-1200個(gè)/ml、菌球直徑0.5-1.0mm和培養(yǎng)液澄清度94%。
[0076]3.發(fā)酵罐培養(yǎng)
①發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:馬鈴薯25%、麥麩2%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO4.7 H2O 0.06%、酵母粉0.2%、菜油1%。
[0077]②發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制:按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)液的熬制、過(guò)濾同搖瓶培養(yǎng)基配制方法。
[0078]③發(fā)酵罐清洗和空滅:發(fā)酵罐清洗后在溫度121°C、壓力0.12Mpa下空滅30min。
[0079]④上料:發(fā)酵罐空滅后從投料口加入配好的培養(yǎng)液和1%菜油，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60%,打開氣泵攪拌3min。
[0080]⑤滅菌:在溫度121 °C、壓力0.12下`滅菌45min。
[0081]⑥接種:培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25°C，按照無(wú)菌操作要求，將搖瓶菌種從進(jìn)料口接入發(fā)酵罐，接種量為15%。
[0082]⑦發(fā)酵罐培養(yǎng):啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)溫度26 °C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為180r/min，通氣量1:0.5V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間4天。
[0083]⑧發(fā)酵終點(diǎn)判定:接種24小時(shí)后，每隔12小時(shí)，在火焰控制下從接種口取樣觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm,培養(yǎng)液澄清度90%以上，pH值3.0-4.0。
【權(quán)利要求】
1.一種液體培養(yǎng)生產(chǎn)茶樹菇菌種的方法，其工藝步驟和工藝參數(shù)為: 1.1篩選液體培養(yǎng)高效菌株: 優(yōu)選液體培養(yǎng)菌球數(shù)量多、大小均勻、表面毛刺多的菌株，培養(yǎng)的菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑 1.0-1.5mm ； 1.2搖瓶培養(yǎng)基配方:
葡萄糖 1-3%、玉米粉 2-4%、酵母粉 0.2-0.4%、麩皮 1.0-3.0%、KH2PO40.5-1.5%、MgSO40.5-1.0%、PH 值自然； 1.3搖瓶培養(yǎng)工藝參數(shù): 搖瓶裝料系數(shù)為20-30%、24-26°C下恒溫靜止培養(yǎng)時(shí)間為2_3天，搖瓶培養(yǎng)溫度為23-25°C、搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180-200r/min、搖瓶培養(yǎng)時(shí)間為3_4天，搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量為900-1200個(gè)/ml、菌球直徑為0.5_lmm，培養(yǎng)液澄清度90%以上； 1.4發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:
馬鈴薯 15-25%、麥麩 2-4%、蛋白胨 2-4%、KH2PO40.1-0.15%、MgSO4.7 H2O 0.05-0.1%、酵母粉0.2-0.4%、消泡劑1% ； 1.5發(fā)酵罐培養(yǎng)參數(shù): 發(fā)酵罐裝料系數(shù)為50-60%、接種量為10-15%、培養(yǎng)溫度為24-26 °C、攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速為150-200r/min，通氣量為1:0.5-`0.6V/V/min，培養(yǎng)時(shí)間3_4天，發(fā)酵終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn):菌球表面多毛刺、菌球數(shù)量200-260個(gè)/ml、菌球直徑1.0-1.5mm、培養(yǎng)液澄清度90%以上、pH值3-4.0。
2.一種茶樹菇液體菌種保藏方法，其特征在于:低溫、密閉條件下保藏，保藏有效期和保藏溫度對(duì)應(yīng)如下:保藏溫度0-5°C時(shí)保藏有效期10-12天；保藏溫度6-10°C時(shí)保藏有效期8-10天；保藏溫度11_16°C時(shí)保藏有效期5-8天；保藏溫度17_19°C時(shí)保藏有效期3_5天；保藏溫度20-22°C時(shí)保藏有效期2-3天。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK103875446SQ201310505616
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】魏云輝, 陳慶隆, 鄭立平, 胡中娥, 胡麗芳, 魏小桃, 程浩 申請(qǐng)人:江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所