來自海島棉海1與棉花纖維強度有關的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子育種【技術領域】，具體涉及來自海島棉海1與棉花纖維強度有關的分子標記及其應用。所述分子標記為HAU1980240、NAU3177160、CGR5149280、NAU3405220和NAU1325210。本發(fā)明有助于克服現(xiàn)有育種技術對纖維品質鑒定存在的不足，能提高纖維強度的選擇效率，加快優(yōu)質纖維新品種的培育進程。
【專利說明】來自海島棉海1與棉花纖維強度有關的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及棉花分子育種【技術領域】，具體涉及到來自海島棉海I與棉花纖維強度有關的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002]棉花是世界上重要的經濟作物，棉纖維是重要的紡織工業(yè)原料，棉花在我國國民經濟中占具重要地位。隨著紡織工業(yè)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，對棉花纖維品質的要求也越來越高。我國大面積種植的是陸地棉品種，棉花育種工作者在上世紀80年代前主要集中在產量的提高上，纖維品質的提高沒有得到足夠的重視，使得我國的棉花品種大多表現(xiàn)為產量高，品質差。進入90年代中后期，纖維品質的育種已成為棉花分子育種的一個重要目標。纖維強度概念纖維強度是指纖維拉斷時所能承受的最大負荷。纖維強度是纖維品質性狀的一項重要指標。
[0003]海島棉具有優(yōu)異的纖維品質，纖維長、強、細，但產量低，而陸地棉產量高，適應性廣，但品質差(Percy et al.，2006)。在陸地棉和海島棉中，陸地棉因產量高，適應性廣，被大面積種植，而海島棉雖然纖維品質好，但產量低而不被廣泛種植。因此挖掘海島棉的優(yōu)異纖維品質基因，把海島棉優(yōu)異纖維品質基因轉移到陸地棉背景中，對我國陸地棉纖維品質的提聞有著重要的意義。
[0004]采用傳統(tǒng)的育種方法提高陸地棉的纖維比強度，首先要通過陸地棉和海島棉或亞洲棉等雜交，通過多代的回交，獲得具有高強纖維基因漸滲的種質材料，與現(xiàn)有的陸地棉栽培品種雜交，通過多代的回交及自交選擇，以打破纖維品質性狀與產量性狀間的負相關。每個世代需要足夠大的選擇群體，都要對纖維品質進行測定，而每一世代的選擇都需等到棉花吐絮后收取棉花進行纖維品質檢測后才能決定，這就導致了育種的群體要大，選擇工作量大，成本較高且周期長。而且纖維 品質性狀受環(huán)境影響較大，使得育種進展緩慢。
[0005]由于傳統(tǒng)育種的整個過程中的選擇主要是表型選擇，這對質量性狀而言一般是有效的，但對纖維品質等這樣的數(shù)量性狀來說，則存在準確性差、效率低等許多缺點。要提高選擇的效率，理想的方法應該是能夠直接對基因型進行選擇。
[0006]分子標記輔助選擇是借助分子標記對目標性狀的基因型直接進行選擇，而不必考慮作物生長時期和發(fā)育條件，可在早期進行選擇，又能減少來自同一位點不同等位基因或不同位點的非等位基因間的相互干擾，有利于快速壘集目標基因，加速回交育種進程，克服不利性狀連鎖，極大地縮短了育種時間，減少了群體種植規(guī)模。分子標記輔助選擇對同步改良纖維品質和產量、多性狀基因聚合、快速培育棉花新品種等具有無比優(yōu)越性。現(xiàn)有技術對分子標記篩選做了大量的工作，利用不同的群體進行連鎖圖譜的構建和重要纖維品質性狀的QTL(Quantitative trait loci,簡寫QTL)篩選,得到了大量的與纖維品質相關的QTL。在海島棉纖維品質性狀的基因挖掘方面，利用不同的陸海雜種群體進行連鎖圖譜的構建和重要纖維品質性狀的QTL篩選，取得了很大研究進展。
[0007]這些研究結果為纖維品質性狀的分子標記輔助選擇打下了良好的基礎，有些QTLs或與之連鎖的分子標記已應用于分子標記輔助選擇育種中。
[0008]但是，前人的研究中多數(shù)是利用分離群體，或只在單個環(huán)境下檢測得到的結果，因此缺乏可靠性和穩(wěn)定性，且有些研究最初的目的只是為了進行目標基因的定位，在實驗材料的選擇上沒有考慮和育種材料相結合，還很難應用到育種中。

【發(fā)明內容】

[0009]為了克服傳統(tǒng)育種中表型選擇準確性差、效率低、周期長、成本高等許多缺點，解決纖維品質育種進展緩慢的問題。本發(fā)明以生產上大面積種植的陸地棉品種中棉所45和中36為輪回親本，海島棉品系海1為供體親本，構建了兩套陸海雜交回交高代棉花染色體片段代換系，并進行了多環(huán)境產量和品質性狀的評價，為挖掘海島棉纖維品質性狀的QTL、直接培育用于育種的新品系奠定了基礎。
[0010]本發(fā)明的目的是提供來自海島棉海I與棉花纖維強度有關的分子標記。
[0011]本發(fā)明的再一目的是提供一種陸地棉纖維強度輔助育種方法。
[0012]本發(fā)明的再一目的是提供上述來自海島棉海I與棉花纖維強度有關的分子標記的應用。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的來自海島棉海1與棉花纖維強度有關的分子標記，所述分子標記為HAU198024(1、NAU3177.、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU1325210，
[0014]其中，各分子標記的特異性引物序列和擴增的目的片段長度如下:
[0015]①HAU1980240
[0016]正向引物序列為AGTGCAACGGCTTAGGATAC，
[0017]反向引物序列為 GTGGATGAATGAGGCATCTG，可擴增長度為240bp的海I的DNA片段；
[0018]②NAU3177160
[0019]正向引物序列為AGCAAATTGAAAAGCACCTC,
[0020]反向引物序列為 GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可擴增長度為160bp的海I的DNA片段；
[0021]③CGR5149.[0022]正向引物序列為CTACCAAACGCTCCCTTACG，
[0023]反向引物序列為 CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可擴增長度為280bp的海I的DNA片段；
[0024]④NAU3405220
[0025]正向引物序列為AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
[0026]反向引物序列為 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可擴增長度為220bp的海I的DNA片段；
[0027]⑤NAU1325210
[0028]正向引物序列為GCTCACACAGATGGAGTTTG,
[0029]反向引物序列為 CCATGGGTATGGATTTCTTC，可擴增長度為210bp的海I的DNA片段。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的與陸地棉纖維強度輔助育種方法，使用SSR標記HAU198024Q、NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220和NAU132521(I在與海島棉海I等有關的育種群體中對纖維強度性狀進行分子標記選擇，可提高陸地棉的纖維強度。該方法所用的分子標記HAU1980240, NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU132521(I 分別與棉花纖維強度性狀的5 個 QTLs:qFS-2_l、qFS-15-l、qFS-16-l、qFS-19-l 和 qFS-22-1 (FS 是纖維強度的英文單詞fiber strength的縮寫。QTL的命名:q+性狀名稱英文縮寫+染色體序號+同一染色體上控制該性狀QTL的順序編號。如:qFS-2_l表示在第2條染色體上控制纖維強度的第I個QTL。)緊密連鎖。這5個纖維強度性狀的QTLs:qFS-2_l、qFS-15-l、qFS-16-l、qFS-19-l 和 qFS-22-l，分別位于染色體 Chr2、Chrl5、Chrl6、Chr19 和 Chr22 上，都來源于海島棉海1，對棉花纖維強度的貢獻率分別為4.40-5.70%,6.17-6.41%,6.21-13.60%、5.91-7.89% 和 3.14-6.88%，加性效應分別為 0.87-0.96、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89和 1.04-1.58cN/tex。
[0031]本發(fā)明不僅有助于篩選高強纖維材料，為今后海島棉海I雜交、回交后代及其衍生品系的纖維強度性狀育種利用提供了極大的便利，同時也為主效QTL的精細定位及基因
克隆奠定基礎。
[0032]使用本發(fā)明可以在苗期預測纖維強度的高低并進行淘汰，進而可以快速篩選高強纖維的株系用于棉花纖維品質育種，輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。通過與高強纖維性狀的QTLs緊密連鎖的分子標記在與海島棉海I等有關的育種群體中的分子標記選擇，快速地提高現(xiàn)有陸地棉品種的纖維品質，以克服現(xiàn)有技術存在的上述不足。
[0033]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn):
[0034]根據(jù)本發(fā)明的與海島棉海I相關的陸地棉纖維強度性狀提高的分子標記選擇方法，使用與海島棉海I纖維強度性狀緊密連鎖的SSR標記HAU198024(1、NAU3177.、CGR5149280,NAU3405220和NAU132521(I在與海島棉海I有關的育種群體中進行分子標記選擇，可提高陸地棉棉纖維強度 0.87-0.96 、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89 和 1.04-1.58cN/tex。該方法包括以下步驟:苗期單株提取DNA ;使用分子標記HAU198024(1、NAU317716(|、CGR514928(1、NAU340522(^PNAU132521(i對群體單株的基因型進行分子檢測；對檢測結果進行分析；選擇帶有海島棉海I特征條帶的植株，這些中選單株的纖維強度得到不同程度的提高。
[0035]通過這些分子標記選擇可獲得纖維強度得到提高的陸地棉品種，加速棉花纖維品質的育種進程。
[0036]上述一種提高陸地棉纖維強度性狀的分子標記選擇方法，所涉及的分子標記是通過以下方法按照下列步驟獲得的:
[0037](I)以海島棉海I為供體親本、分別以中棉所45和中棉所36為輪回親本，通過雜交高代回交，連續(xù)自交，構建了兩套陸海雜交高代回交自交的染色體片段代換系群體:中棉所 45 X 海 IBC4F3:4 和中棉所 36 X 海 1BC5F3:4 ；
[0038](2)以中棉所36X海IBC1F1為作圖群體(135個單株)，利用不同來源的23569對SSR引物(引物序列在網(wǎng)站http://www.cottonmarker.0rg免費下載或有關文獻中公布)對中棉所36和海I及其F1進行多態(tài)性檢測，篩選含有海i顯性帶的引物，多態(tài)性引物進一步篩選BC1F1單株群體，獲得多態(tài)性位點結果，構建覆蓋整個基因組的SSR分子連鎖圖譜；
[0039](3)對332個染色體片段代換系(中棉所45X海IBC4F3:4)，設置2年3個環(huán)境(2010安陽、2011年新疆和安陽)的 試驗，進行田間農藝性狀的調查和纖維品質測定，并提取每個代換系DNA (2011年安陽)，以上述(2)構建的分子連鎖圖譜為基礎，在每條染色體上每5-lOcM選擇一個標記，共選擇459個標記引物，對染色體片段代換系DNA進行基因型檢測；
[0040](4)利用2年3個環(huán)境(2010安陽、2011年庫爾勒和安陽)的纖維強度性狀的表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)，采用QTL IciMapping V3.2軟件(王健康，2009)，進行纖維強度性狀的多環(huán)境QTL定位分析，獲得的2個環(huán)境穩(wěn)定的纖維強度性狀的6個QTLs，其中5個QTLs:qFS-2-l、qFS-15-l、qFS-16-l、qFS-19-l 和 qFS-22-l (附表 4)，分別位于染色體 Chr2、Chrl5、Chrl6、Chrl9和Chr22上，增效基因都來源于海島棉海I，對棉花纖維強度的貢獻率分別為 4.40-5.70%,6.17-6.41%,6.21-13.60%,5.91-7.89% 和 3.14-6.88%,加性效應分別為 0.87-0.96、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89 和 1.04-1.58cN/tex ;與這 5 個纖維強度性狀的 QTLs 緊密連鎖的 SSR 分子標記分別為 HAU198024(1、NAU317716Q、CGR514928(1、NAU340522(i和 NAU132521。。
[0041]各分子標記的引物序列和擴增的目的片段長度如下:
[0042]①HAU1980240
[0043]正向引物序列為AGTGCAACGGCTTAGGATAC，
[0044]反向引物序列為 GTGGATGAATGAGGCATCTG，可擴增長度為240bp的海I的DNA片段。
[0045]②NAU3177160
[0046]正向引物序列為AGCAAATTGAAAAGCACCTC,
[0047]反向引物序列為 GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可擴增長度為160bp的海I的DNA片段。
[0048]③CGR5149.[0049]正向引物序列為CTACCAAACGCTCCCTTACG，
[0050]反向引物序列為 CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可擴增長度為280bp的海I的DNA片段。
[0051]④NAU3405220
[0052]正向引物序列為AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
[0053]反向引物序列為 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可擴增長度為220bp的海I的DNA片段。
[0054]⑤NAU1325210
[0055]正向引物序列為GCTCACACAGATGGAGTTTG,
[0056]反向引物序列為 CCATGGGTATGGATTTCTTC，可擴增長度為210bp的海I的DNA片段。
[0057]本發(fā)明的有益效果如下:
[0058]本發(fā)明提供了一種提高陸地棉纖維強度性狀的分子標記選擇方法，使用分子標記HAU198024Q、NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU132521(I 在與海島棉海 I 有關的育種群體中進行分子標記選擇，可提高纖維強度0.87-0.96、1.50-1.50、1.02-1.08、1.59-1.89和
1.04-1.58cN/tex。
[0059]使用這些分子標記可以在棉花苗期進行選擇，提高纖維強度性狀的選擇效率。本發(fā)明不但有助于解決我國棉花纖維品質育種進展緩慢的問題，而且有助于克服現(xiàn)有育種技術對纖維品質鑒定存在的成本高、時間長、穩(wěn)定性低、準確性差、效率低等不足，快速地提高現(xiàn)有陸地棉品種的纖維品質，大大加快我國高優(yōu)質纖維新品種的培育與種子產業(yè)化進程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1為來源于海島棉海I纖維強度性狀的5個QTLs在連鎖圖上的位置。qFS_2_l、qFS-15-U qFS-16-U qFS-19-l 和 qFS-22-l 分別位于染色體 Chr2、Chrl5、Chrl6、Chrl9 和Chr22 上，分別與 SSR 分子標記 HAU198024(1、NAU317716(1、CGR514928(1、
[0061]NAU3405220 和 NAUl32521c1 緊密連鎖。[0062]FS是纖維強度的英文單詞fiber strength的縮寫。
[0063]QTL的命名:q+性狀名稱英文縮寫+染色體序號+同一染色體上控制該性狀QTL的順序編號。如:qFS-2_l表示在第2條染色體上控制纖維強度的第I個QTL。
【具體實施方式】
[0064]下面通過具體實施例方式的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
[0065]實施例1篩選分子標記
[0066](I)染色體片段代換系的構建及表型數(shù)據(jù)的獲得
[0067]以海島棉海I為供體親本、以中棉所45和中棉所36為輪回親本，構建了兩套陸海雜交高代回交的染色體片段代換系群體。輪回親本中棉所36 (CCRI36)是中國農業(yè)科學院棉花研究所培育的早熟的優(yōu)異的陸地棉推廣品種(國審棉990007)，中棉所45 (國審棉2003002)是中國農業(yè)科學院棉花研究所培育的具有高產抗倒伏、耐黃萎病特性中熟品種，而供體親本海I (Hail)是帶有顯性無腺體基因的高抗黃萎病的海島棉栽培種。
[0068]2003年夏在河南安陽分別以陸地棉中棉所45和中棉所36為受體親本，海島棉海I為供體親本雜交產生F1,同年冬季在海南三亞分別以中棉所45和中棉所36為母本回交得BC1F1 ；2004年夏在河南安陽種植BC1F1，利用這些單株為父本，輪回親本中棉所45和中棉所36為母本雜交，按照父本單株號混收雜交鈴，獲得116個中棉所45 X海IBC2F1株系和133個中棉所36 X海IBC2F1株系雜交種子。
[0069]2005年夏在河南安陽種植中棉所45X海I的116個BC2F1株系和133個中棉所36 X海IBC2F1株系，每個株系種植I行，行長5m，行寬80cm，株距25cm，苗期拔除有腺體植株，每行保證20株苗，同時每10個系種植輪回親本I行，以輪回親本為父本，繼續(xù)回交，按家系混收種子。
[0070]2006年夏在河南安陽種植中棉所45X海I的116個BC3F1家系及中棉所45，種植及雜交方式與2005年相同；2007年在河南安陽種植116個BC4F1家系，每個家系種I行，每20個株系種植I行中棉所45作為對照，行長5m，株距25cm，按家系收取自然鈴獲得BC4F2 ；2008年在安陽種植116個BC4F2家系，種植方式與2007年相同，按家系收取自然鈴獲得BC4F3。2009年種植116個BC4F3家系(每個家系I行約20株，共2328株)，按單株收取自然鈴，測定纖維品質，纖維樣送中國農業(yè)部纖維品質檢驗監(jiān)督檢測中心以HVI1000測定纖維的上半部平均長度、整齊度、馬克隆值、伸長率和斷裂比強度(簡稱強度)。獲得2328個BC4F3單株纖維品質數(shù)據(jù)。按照每個家系選擇2-4株的原則，共選擇332個BC4F3單株，2010年在河南安陽種成BC4F3:4株行，行長5m，行寬80cm，株距25cm，對株行進行常規(guī)田間調查和纖維品質測定。對獲得的332個株系于2011年設置2環(huán)境(河南安陽、新疆庫爾勒)試驗，田間種植采用地膜覆蓋的方式播種，安陽單行區(qū)兩重復種植，行長5m，行寬80cm，株距25cm，新疆庫爾勒2行區(qū)兩重復種植，行長3m，行距按新疆當?shù)貙捳性O置，株距為10cm。對株系按照小區(qū)進行常規(guī)田間調查和纖維品質測定。獲得了 2年3個環(huán)境的纖維品質的數(shù)據(jù)(附表2和附表3)。
[0071]表13個環(huán)境中染色體片段代換系纖維強度性狀描述性統(tǒng)計分析
[0072]
【權利要求】
1.來自海島棉海I與棉花纖維強度有關的分子標記，其特征在于，所述分子標記為HAU198024(1、NAU3177.、CGR514928(1、NAU3405220 和 NAU1325210， 其中，各分子標記的特異性引物序列和擴增的目的片段長度如下:
① HAU1980240 正向引物序列為 AGTGCAACGGCTTAGGATAC， 反向引物序列為GTGGATGAATGAGGCATCTG，可擴增長度為240bp的海I的DNA片段； (2)NAU3177160 正向引物序列為 AGCAAATTGAAAAGCACCTC， 反向引物序列為GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可擴增長度為160bp的海I的DNA片段； ③CGR5149.正向引物序列為 CTACCAAACGCTCCCTTACG， 反向引物序列為CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可擴增長度為280bp的海I的DNA片段；
④NAU340522(i 正向引物序列為 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC， 反向引物序列為GAAGTGCAAA`AACCGTACCT，可擴增長度為220bp的海I的DNA片段；
⑤NAU1325210 正向引物序列為 GCTCACACAGATGGAGTTTG， 反向引物序列為CCATGGGTATGGATTTCTTC，可擴增長度為2IObp的海I的DNA片段。
2.—種陸地棉纖維強度輔助育種方法,其特征在于， 該方法包括以下步驟: (1)DNA提取，使用與海島棉海I纖維強度性狀緊密連鎖的分子標記HAU198024Q、NAU317716(1、CGR514928(1、NAU3405220和NAU132521(I對群體單株的基因型進行分子檢測； (2)對檢測結果進行分析，選擇帶有海島棉海I特征條帶的植株，獲得纖維強度得到提聞的陸地棉品種， 其中，所述與海島棉海I纖維強度性狀緊密連鎖的分子標記HAU198024(1、NAU3177.、CGR5149280,NAU3405220和NAU1325210的特異性引物序列和擴增的目的片段長度如下:
① HAU1980240 正向引物序列為 AGTGCAACGGCTTAGGATAC， 反向引物序列為GTGGATGAATGAGGCATCTG，可擴增長度為240bp的海I的DNA片段；
(2)NAU3177160 正向引物序列為 AGCAAATTGAAAAGCACCTC, 反向引物序列為GTCACCCTTTTGCTGTTTTT，可擴增長度為160bp的海I的DNA片段； ③CGR5149.正向引物序列為 CTACCAAACGCTCCCTTACG， 反向引物序列為CGGAATCTTTCAAGGATGGA，可擴增長度為280bp的海I的DNA片段；
④NAU340522(i 正向引物序列為 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC， 反向引物序列為GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可擴增長度為220bp的海I的DNA片段；⑤NAU1325210正向引物序列為 GCTCACACAGATGGAGTTTG，反向引物序列為CCATGGGTATGGATTTCTTC，可擴增長度為2IObp的海I的DNA片段。
3.權利要求1所述來自海島棉海I與棉花纖維強度有關的分子標記在棉花育種中的應 用。
【文檔編號】A01H1/04GK103497949SQ201310481269
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權日:2013年10月15日
【發(fā)明者】袁友祿, 石玉真, 馬留軍, 蘭孟焦, 楊澤茂, 張金鳳, 張保才, 李俊文, 劉愛英, 王濤, 龔舉武, 商海紅, 鞏萬奎 申請人:中國農業(yè)科學院棉花研究所