一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，該方法包括以下步驟：⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基；⑵制備種子培養(yǎng)基；⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基；⑷將美味牛肝菌菌絲接種至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基，經(jīng)恒溫培養(yǎng)得菌絲體；⑸菌絲體接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)振蕩培養(yǎng)得菌種種子液；⑹菌種種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液；離心、洗滌、烘干、磨粉后，得到菌絲體干粉末；⑺菌絲體干粉末先超聲提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液與正丁醇-三氯乙酸溶液混合后離心后即得多糖提取液；⑼多糖提取液加乙醇靜置，得沉淀物；⑽沉淀物離心、洗滌、干燥，即得美味牛肝菌多糖。本發(fā)明操作簡單，成本低，多糖得率高。
【專利說明】一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及真菌多糖【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法。【背景技術(shù)】
[0002]真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液中分離出的活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗輻射、降血脂、血糖和膽固醇、健胃護(hù)肝等多種藥理作用。真菌多糖的多種生物活性功能在臨床上的廣泛應(yīng)用，使其已成為生命科學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0003]美味牛肝菌eWis)屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、牛肝菌科中的一種與高等植物共生的外生菌根真菌，是一種藥、食兼用的珍稀食用菌。我國美味牛肝菌資源豐富，主要分布于河南、四川、云南、內(nèi)蒙古、福建、陜西等地。研究表明，美味牛肝菌菌絲體中主要含有碳水化合物、粗蛋白、胞內(nèi)多糖以及少量的脂類和纖維等成分，具有降低血脂，提高人體免疫力和明顯的抗癌作用。由于其優(yōu)良的食療保健功效，已成為我國出口創(chuàng)匯的重要菌類產(chǎn)品。美味牛肝菌多糖是一種有效的生物免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)血糖、血脂及膽固醇水平、改善免疫系統(tǒng)功能以及顯著的抗腫瘤等作用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、成本低、多糖得率高的美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg瓊脂，使其pH值為6.0-8.0,在90~l00°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為
1.05Kg/cm2、溫度為121 °C的條件下滅菌20min即得；
⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得；
⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得；
⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)美味牛肝菌菌絲至所述馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4~10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體；
(5)接一環(huán)所述活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL所述種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100?200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4?10天，制得pH值為 5. (T7. 0的菌種種子液；
(6)將所述菌種種子液按5?20%的接種量接種至含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于 恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4?10天，即得發(fā)酵液； 所述發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；所述菌絲體用蒸懼 水洗滌后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末；所述發(fā)酵培養(yǎng) 基在所述搖瓶中的裝瓶量為1(T30% ；
(7)在所述菌絲體干粉末中按1g:5 mL?20mL的料液比加入去離子水，在功率為 10(T300W的條件下超聲提取10?20 min后，在溫度為7(T90°C的條件下浸提次數(shù)2?4次，每 次llh，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑶將所述多糖浸提液與正丁醇-三氯乙酸溶液按lmL ：lmL的比例，充分混合，在轉(zhuǎn)速 150 r/min條件下，振蕩15min,再靜置45min,用高速冷凍離心機(jī)4000r/min離心20min,除 掉變性蛋白質(zhì)，將水相再加入相當(dāng)于其體積的正丁醇-三氯乙酸溶液，反復(fù)多次直到上清 液與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液；
⑶在所述多糖提取液中按其體積的2?4倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置 24h，得到沉淀物A ；
(10)將所述沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心10 min后，得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水乙醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得美味 牛肝囷多糖。
[0006]所述步驟⑷中美味牛肝菌菌絲是指采集于隴南康縣的美味牛肝菌 edulis KX920NG按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的美味牛肝菌菌絲；所述美味牛肝菌 edulis KX920NG在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO :M 2012113 (保藏 單位地址：中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏日期：2012年4月13日），其分子生物學(xué)鑒定后的 核酸序列提交至GenBank的登錄號為JQ086386。
[0007]所述步驟(8)中正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇與三氯乙酸按5mL :lmL混合而成 的混合液。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明采用超聲波輔助熱水浸提法取代傳統(tǒng)的水提醇析法，與原來工藝相比，降低 了提取液黏度、縮短了提取時間，多糖得率顯著提高。同時，超聲波輔助提取能加速真菌胞 內(nèi)多糖的釋放、擴(kuò)散及溶解，具有提取效率聞、時間短、多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
[0009]2、本發(fā)明整個過程中無需試劑和化學(xué)反應(yīng)，不但設(shè)備簡單，可操作性強(qiáng)，而且成本 低，易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的連續(xù)化和工業(yè)化。
[0010]3、本發(fā)明發(fā)酵菌絲體培養(yǎng)周期短，生長快，利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，從其發(fā)酵液或固 體培養(yǎng)物中得到菌絲體提取多糖，對進(jìn)一步深入開發(fā)美味牛肝菌資源具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1 一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟：
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基：將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸 25min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1. 0L依次加入5g葡萄糖和5g瓊脂，使其pH值為6.0-8.0，在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0012]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0013]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0014]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)美味牛肝菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體。
[0015]其中:美味牛肝菌菌絲是指采集于隴南康縣的美味牛肝菌沒edulisKX920NG按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的美味牛肝菌菌絲；美味牛肝菌Boletus edulisKX920NG在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2012113 (保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號為JQ086386。
[0016](5)接一環(huán)活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液。
[0017](6)將菌種種子液按5%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100 r/mi`n的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0018]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為10%。
[0019](7)在菌絲體干粉末中按I g:5 mL的料液比加入去離子水，在功率為100W的條件下超聲提取20 min后，在溫度為70°C的條件下浸提次數(shù)2次，每次lh，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0020](8)將多糖浸提液與正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在轉(zhuǎn)速150 r/min條件下,振蕩15min,再靜置45min,用高速冷凍離心機(jī)4000r/min離心20min,除掉變性蛋白質(zhì)，將水相再加入相當(dāng)于其體積的正丁醇-三氯乙酸溶液，反復(fù)多次直到上清液與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0021]其中:正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇與三氯乙酸按5mL:lmL混合而成的混合液。
[0022](9)在多糖提取液中按其體積的2倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0023](K))將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心10 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水乙醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝菌多糖。[0024]采用苯酚-硫酸法測定美味牛肝菌多糖含量，并按下式計算:
粗多糖含量(mg/g菌絲干重)=粗多糖總質(zhì)量(mg)/菌絲體干粉末質(zhì)量(g)。
[0025]實(shí)施例2 —種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入IOg葡萄糖和IOg瓊脂，使其PH值為6.0-8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0026]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0027]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分 裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0028]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)美味牛肝菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體。
[0029]其中:美味牛肝菌菌絲同實(shí)施例1。
[0030](5)接一環(huán)活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)10天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液。
[0031](6)將菌種種子液按20%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)10天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0032]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為30%。
[0033](7)在菌絲體干粉末中按I g:20mL的料液比加入去離子水，在功率為300W的條件下超聲提取10 min后，在溫度為90°C的條件下浸提次數(shù)4次，每次3h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0034](8)將多糖浸提液與正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在轉(zhuǎn)速150 r/min條件下,振蕩15min,再靜置45min,用高速冷凍離心機(jī)4000r/min離心20min,除掉變性蛋白質(zhì)，將水相再加入相當(dāng)于其體積的正丁醇-三氯乙酸溶液，反復(fù)多次直到上清液與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0035]其中:正丁醇-三氯乙酸溶液同實(shí)施例1。
[0036](9)在多糖提取液中按其體積的4倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0037](K))將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心10 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水乙醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝菌多糖。[0038]采用苯酚-硫酸法測定美味牛肝菌多糖含量，并按實(shí)施例1中的公式計算。
[0039]實(shí)施例3 —種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g瓊脂，使其pH值為6.0-8.0，在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0040]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0041]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0042]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)美味牛肝菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)7天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體。
[0043]其中:美味牛肝菌菌絲同實(shí)施例1。
[0044](5)接一環(huán)活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以150 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液。
[0045](6)將菌種種子液按12%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以150 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0046]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為20%。
[0047](7)在菌絲體干粉末中按I g:12mL的料液比加入去離子水，在功率為200W的條件下超聲提取15 min后，在溫度為80°C的條件下浸提次數(shù)3次，每次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0048](8)將多糖浸提液與正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在轉(zhuǎn)速150 r/min條件下,振蕩15min,再靜置45min,用高速冷凍離心機(jī)4000r/min離心20min,除掉變性蛋白質(zhì)，將水相再加入相當(dāng)于其體積的正丁醇-三氯乙酸溶液，反復(fù)多次直到上清液與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0049]其中:正丁醇-三氯乙酸溶液同實(shí)施例1。
[0050](9)在多糖提取液中按其體積的3倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0051](10)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心10 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水乙醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝囷多糖。
[0052]采用苯酚-硫酸法測定美味牛肝菌多糖含量，并按實(shí)施例1中的公式計算。
【權(quán)利要求】
1.一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟: ⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg瓊脂，使其pH值為6.0-8.0,在9(Tl00°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為.1.05Kg/cm2、溫度為121 °C的條件下滅菌20min即得； ⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌.20min即得； ⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌.20min即得； ⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)美味牛肝菌菌絲至所述馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于.28°C恒溫培養(yǎng)4~10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體； (5)接一環(huán)所述活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL所述種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，制得pH值為.5.0-7.0的菌種種子液 ； (6)將所述菌種種子液按5~20%的接種量接種至含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5~?Ο天，即得發(fā)酵液；所述發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；所述菌絲體用蒸懼水洗滌后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末；所述發(fā)酵培養(yǎng)基在所述搖瓶中的裝瓶量為10-30%; ⑴在所述菌絲體干粉末中按I g:5 mL~20mL的料液比加入去離子水，在功率為.10(T300W的條件下超聲提取1(T20 min后，在溫度為7(T90°C的條件下浸提次數(shù)2~4次，每次llh，合并提取液，得到多糖浸提液； ⑶將所述多糖浸提液與正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在轉(zhuǎn)速.150 r/min條件下,振蕩15min,再靜置45min,用高速冷凍離心機(jī)4000r/min離心20min,除掉變性蛋白質(zhì)，將水相再加入相當(dāng)于其體積的正丁醇-三氯乙酸溶液，反復(fù)多次直到上清液與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液； ⑶在所述多糖提取液中按其體積的2~4倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置.24h，得到沉淀物A; (10)將所述沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心10 min后,得到沉淀物B,該沉淀物B經(jīng)無水乙醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝囷多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，其特征在于:所述步驟⑷中美味牛肝菌菌絲是指采集于隴南康縣的美味牛肝菌沒edulis KX920NG按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的美味牛肝菌菌絲；所述美味牛肝菌沒edulis KX920NG在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2012113，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號為JQ086386。
3.如權(quán)利要求1所述的一種美味牛肝菌菌絲多糖的提取方法，其特征在于:所述步驟⑶中正丁醇-三氯乙 酸溶液是指正丁醇與三氯乙酸按5mL =ImL混合而成的混合液。
【文檔編號】A01G1/04GK103554287SQ201310480673
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】陳朋, 嚴(yán)曉娟, 梁寧, 胡先望 申請人:甘肅省商業(yè)科技研究所