植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen，其為SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。該植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen包含煙草花椰菜病毒35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列和玉米的10kDa光系統(tǒng)蛋白II（photosystem?II10kDa）基因（GenBank?ID：EU961665）的部分啟動(dòng)子序列。本發(fā)明還公開(kāi)了上述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在制備具有抗蟲(chóng)能力的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了上述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在提高植物抗蟲(chóng)活性中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種在植物綠色組織中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著世界人口的不斷增加，人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的需求也日益增大，作為生命能源供應(yīng)的糧食尤為重要，如水稻和玉米等。然而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，人類(lèi)賴(lài)以生存的糧食和經(jīng)濟(jì)作物極易受到蟲(chóng)害的侵襲而減產(chǎn)或使得農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降甚至產(chǎn)生對(duì)人體有毒、有害的物質(zhì)，造成較大損失。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑是減少蟲(chóng)草害的重要方法。但是，化學(xué)殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期、大量使用不僅令生產(chǎn)成本增高，還給生態(tài)環(huán)境和人畜安全帶來(lái)一系列危害。
[0003]當(dāng)今，人們對(duì)食物安全性和環(huán)保性日益重視，減少甚至杜絕化學(xué)農(nóng)藥的使用是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的新要求。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物成為一種有效的途徑。這種新的技術(shù)從1996年開(kāi)始在世界范圍內(nèi)大規(guī)模地應(yīng)用。目前，世界上應(yīng)用最為廣泛的抗蟲(chóng)基因是Bt (Bacillusthuringiensis)殺蟲(chóng)基因[1’2]。2010年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.48億111]12，占全球耕地總面積的10%，其中39%是轉(zhuǎn)入Bt殺蟲(chóng)基因M。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的種植可以大幅度減少殺蟲(chóng)劑的使用量，這不僅大大降低了農(nóng)民的種植成本，而且對(duì)保護(hù)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境都有積極的意義。
[0004]隨著對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物的進(jìn)一步的研究和廣泛的應(yīng)用，問(wèn)題也日益凸顯，主要體現(xiàn)在兩方面，一是害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性；二是轉(zhuǎn)基因作物食用安全性問(wèn)題，尤其是水稻，它作為全球一半以上人口的口糧，公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的食用安全性更是存在著顧慮和質(zhì)疑。目前用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)的Bt殺蟲(chóng)蛋白中Cry(Crystal Protein, Cry)蛋白是目前研究最深入、應(yīng)用最廣 泛的Bt殺蟲(chóng)毒素，但目前已發(fā)現(xiàn)多種害蟲(chóng)對(duì)其產(chǎn)生了抗性[4_7];而VIP(Vegetative Insecticidal Protein,VIP)殺蟲(chóng)蛋白是一種與ICPs完全不同的新型殺蟲(chóng)蛋白，對(duì)于擴(kuò)大殺蟲(chóng)譜、延緩害蟲(chóng)抗性都具有深遠(yuǎn)意義[8’9]。這些基因資源都已成為構(gòu)建抗蟲(chóng)農(nóng)作物新品種的重要武器。但是這些基因在轉(zhuǎn)基因植株中多利用組成型的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其表達(dá)，這種表達(dá)方式由于違背了植物的自然生理活動(dòng)規(guī)律，不僅可能達(dá)不到轉(zhuǎn)基因的目的，甚至對(duì)轉(zhuǎn)基因植物自身的生理活動(dòng)造成了極大傷害[1°_12]。
[0005]針對(duì)以上問(wèn)題，人們做了諸多研究以延緩昆蟲(chóng)抗性、提高殺蟲(chóng)活性并最大限度地降低轉(zhuǎn)基因作物的安全隱患問(wèn)題，例如堆疊多種殺蟲(chóng)基因，或使用組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子(PiOmoter)是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游調(diào)控基因表達(dá)的DNA序列，有組成型表達(dá)、誘導(dǎo)型表達(dá)和組織特異型表達(dá)3種類(lèi)型。組織特異型表達(dá)的啟動(dòng)子現(xiàn)在被認(rèn)為是對(duì)目的基因?qū)崿F(xiàn)高量表達(dá)的重要途徑，也是培育高效、安全的轉(zhuǎn)基因作物的首選[13]。
[0006]綠色組織特異啟動(dòng)子是高等植物組織特異性啟動(dòng)子中的一種，驅(qū)動(dòng)外源基因在莖葉等綠色組織中特異表達(dá)，它既可以用于以莖葉為主要收獲產(chǎn)物的作物，使蛋白質(zhì)產(chǎn)物富集于莖葉中，減少宿主植物無(wú)謂的物質(zhì)能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以種子、果實(shí)為主要收獲產(chǎn)物的作物，讓抗蟲(chóng)、抗除草劑等外源基因只在莖葉部分而不在種子果實(shí)等器官中表達(dá)，解除人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物食品安全性的顧慮[14]。同時(shí)，植物來(lái)源的啟動(dòng)子不會(huì)造成基因的逃逸。鑒于此，綠色組織特異性啟動(dòng)子在植物基因工程研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0007]上文中涉及的參考文獻(xiàn)具體如下:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen及其應(yīng)用植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子PGreen及其應(yīng)用。
[0023]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen,為SEQ ID NO:1 (即，序列表NOl)所示的核苷酸序列。
[0024]當(dāng)然，該啟動(dòng)子pGreen也可以為滿(mǎn)足以下任意一個(gè)條件的啟動(dòng)子:
[0025]在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO:1所示序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；
[0026]與SEQ ID NO:1所示序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
[0027]作為本發(fā)明的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen的改進(jìn):植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen包含煙草花椰菜病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列(NCBI Reference Sequence:NC_001497.1)和玉米的IOkDa光系統(tǒng)蛋白II (photosystem III OkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分啟動(dòng)子序列(具體為 TIGRmaize database (http://maize, jcv1.0rg/)中的 AZM5_84822genome序列中 EU961665基因上游-471bp~_41bp的序列)。
[0028]備注說(shuō)明:上述增強(qiáng)子序列和啟動(dòng)子序列在SEQ ID NO:1中為帶有不同下劃線(xiàn)的序列。
[0029]作為本發(fā)明的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen的進(jìn)一步改進(jìn):玉米的IOkDa 光系統(tǒng)蛋白 II (photosystem IIIOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分啟動(dòng)子序列為以下任一:[0030] I) SEQ ID NO:2 (即，序列表N02)所示的核苷酸序列；
[0031]2)SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；
[0032]3)由SEQ ID NO:2產(chǎn)生的具有控制基因在植物綠色組織特異表達(dá)的DNA功能片段。
[0033]本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，利用上述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen與目的基因連接所構(gòu)建而得。
[0034]本發(fā)明還提供了一種植物表達(dá)載體，利用上述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen構(gòu)建而得。
[0035]作為本發(fā)明的植物表達(dá)載體的改進(jìn):植物表達(dá)載體為pCambial300-p35S-G6-pGreen—CrylAc。
[0036]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在制備具有抗蟲(chóng)能力的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。植物為水稻、玉米、棉花、小麥、大豆或高粱。
[0037]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在提高植物抗蟲(chóng)活性中的應(yīng)用。植物為水稻、玉米、棉花、小麥、大豆或高粱。
[0038]備注說(shuō)明:本發(fā)明中玉米綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子的來(lái)歷:水稻中photosystemlIΙΟ-kDa的蛋白基因名為D540,玉米中與水稻D540的同源基因?yàn)镚enBankID:EU961665,該基因上游的部分啟動(dòng)子序列被發(fā)明人分離出來(lái)，也可以在植物綠色組織中特異性表達(dá)，該段啟動(dòng)子為T(mén)IGR maize database (http://maize, jcv1.0rg/)中的AZM5_84822genome序列中EU961665基因上游_471bp~_41bp的序列。發(fā)明人在這段啟動(dòng)子上游又加上了 35S增強(qiáng)子序列，從而形成了在植物綠色組織中高效特異表達(dá)的啟動(dòng)子pGreen。
[0039]本發(fā)明目的在于提供一種由玉米的IOkDa光系統(tǒng)蛋白II(photosystem IIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分啟動(dòng)子序列(見(jiàn)SEQ ID N0:2)并添加CaMV (35S)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列而得的啟動(dòng)子，其DNA序列為SEQ ID N0:1。該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因在植物莖、葉等綠色組織特異、高效表達(dá)，而在胚和胚乳中不表達(dá)或表達(dá)量極低至可檢測(cè)水平以下，命名為 pGreen。
[0040]本發(fā)明另一目的在于提供該啟動(dòng)子在制備轉(zhuǎn)基因植物以及提高植物抗蟲(chóng)和/或抗除草劑活性中的應(yīng)用。
[0041]本發(fā)明涉及分離、改良和應(yīng)用一種包含玉米的IOkDa光系統(tǒng)蛋白IKphotosystemIIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分啟動(dòng)子序列的DNA片段，該片段包含調(diào)控基因在植物莖、葉等綠色組織中特異表達(dá)的調(diào)控原件。其中所述片段如序列表SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示，或基本上相當(dāng)于SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列的亞片段。
[0042]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明啟動(dòng)子用于構(gòu)建綠色組織特異表達(dá)的表達(dá)載體。此外還可以將目的基因與本發(fā)明的啟動(dòng)子連接構(gòu)建表達(dá)盒，進(jìn)一步可將該表達(dá)盒導(dǎo)入植物表達(dá)載體，獲得綠色組織特異表達(dá)的重組表達(dá)載體。因此，本發(fā)明還包括由上述啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體、表達(dá)盒，以及含有上述表達(dá)盒的重組載體。
[0043]本發(fā)明的啟動(dòng)子可以用于制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法或花粉管通道等方式獲得轉(zhuǎn)基因植物，從而可以通過(guò)引入抗蟲(chóng)、抗除草劑、抗病等基因，培育出抗蟲(chóng)、抗除草劑、抗病等植物，提高植物抗蟲(chóng)、抗除草劑、抗病活性。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、高粱等。這些植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是已經(jīng)現(xiàn)有的技術(shù)。這些被轉(zhuǎn)入植物的抗性基因可以是現(xiàn)有的或/和根據(jù)現(xiàn)有基因改良的或/和新發(fā)現(xiàn)的基因。
[0044]本發(fā)明提供了一種可以增強(qiáng)植物轉(zhuǎn)基因安全性的方法。這種方法包括將上述具有啟動(dòng)子功能的DNA片段和需要的功能基因連接轉(zhuǎn)入植物，由于該啟動(dòng)子不在胚和胚乳中表達(dá)或表達(dá)量極低至可檢測(cè)水平以下，避免了轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生的食品安全問(wèn)題。
[0045]本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述具有啟動(dòng)子功能的DNA片段獲得的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入其它的植株。
[0046]在本發(fā)明實(shí)施例中，利用SEQ ID NO:1所述啟動(dòng)子pGreen構(gòu)建得到植物表達(dá)載體pCambial300-p35S-G6-pGreen_CrylAc (如圖1b所示)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將所述載體轉(zhuǎn)化水稻品種，可以獲得對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)和除草劑草甘膦均具有良好抗性的植株。且外源的殺蟲(chóng)蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻莖、葉特異性表達(dá)，而在其種子中不表達(dá)或表達(dá)量極低至可檢測(cè)量以下。
[0047]本發(fā)明的啟動(dòng)子為綠色組織特異表達(dá)，可以用于基因在綠色組織特異表達(dá)的研究。
[0048]本發(fā)明適用于所有植物，包括單子葉和雙子葉植物。即，包括水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、高粱等糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0050]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中載體示意圖；
[0051]a:初始載體pCambial 1300結(jié)構(gòu)示意圖；
[0052]b:植物轉(zhuǎn)化載體 pCambial 1300-p35S-G6-pGreen_CrylAc 的 T-DNA 結(jié)構(gòu)不意圖；
[0053]c:植物轉(zhuǎn)化載體 pCambial 1300-p35S-G6-pZmUb1-CryIAc 的 T-DNA 結(jié)構(gòu)不意圖。其中Ubi表示玉米ZmUbi啟動(dòng)子，35S表示花椰菜花葉病毒CaMV的35S啟動(dòng)子，pGreen表示本發(fā)明提供的綠色組織特異性啟動(dòng)子。
[0054]圖2是轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)棉鈴蟲(chóng)一齡幼蟲(chóng)的生物測(cè)定圖；
[0055]A:攜帶pGreen啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻,對(duì)棉鈴蟲(chóng)一齡幼蟲(chóng)有很好的抗性；
[0056]B:非轉(zhuǎn)基因親本水稻“秀水-134”作為陰性對(duì)照。
[0057]圖3是轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)草甘膦的抗性檢測(cè)圖；具體為:對(duì)溫室水培長(zhǎng)至約15cm的秧苗噴施稀釋100倍的41%草甘膦水劑，7天后拍照;A1、A2是轉(zhuǎn)pCambial1300-p35S-G6-pGreen-CrylAc抗蟲(chóng)抗除草劑水稻，CK是非轉(zhuǎn)基因親本水稻。
[0058]圖4是通過(guò)棉鈴蟲(chóng)生物測(cè)定和Western blot分析篩選出抗蟲(chóng)基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系，重新提取葉片和種子的可溶性蛋白測(cè)定融合蛋白表達(dá)水平圖；
[0059]M,預(yù)染蛋白marker ；+,陽(yáng)性對(duì)照，pET28a_Del_CryIAc-CryIIe表達(dá)載體表達(dá)的蛋白；_，陰性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因植株“秀水-134” ； 1，2和3分別表示攜帶pGreen啟動(dòng)子的不同轉(zhuǎn)基因株系；4和5分別表示攜帶ZmUbi啟動(dòng)子的不同轉(zhuǎn)基因株系；L，代表從植株葉片中提取的蛋白；S，代表從植株種子中提取的蛋白。攜帶pGreen的株系種子中檢測(cè)不到抗蟲(chóng)蛋白，而ZmUbi株系中可以檢測(cè)到。
[0060]圖5是轉(zhuǎn)基因水稻T1代S20株系單棵植株葉片、種子中抗蟲(chóng)蛋白表達(dá)分析圖；
[0061]a:隨機(jī)選取株系S20中10棵植株提取葉片可溶性蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)；M,預(yù)染蛋白marker ;+，原核菌株表達(dá)陽(yáng)性蛋白；_，非轉(zhuǎn)基因植株“秀水-134”作為陰性對(duì)
昭.[0062]b:選取編號(hào)為7，8, 9的植株提取葉片和種子中的可溶性蛋白進(jìn)行檢測(cè)；L,表不從植株葉片中提取的蛋白；S，表示從種子中提取的蛋白…和+同上；-，從非轉(zhuǎn)基因水稻種子中提取的蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0063]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0064]若未特別指明，本發(fā)明以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。
[0065]實(shí)施例1:植物表達(dá)雙元載體構(gòu)建
[0066]選取crylAc (已公開(kāi)基因，GenBank:AY225453.1)抗蟲(chóng)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，分別用本發(fā)明的綠色組織特異啟動(dòng)子PGreen (序列見(jiàn)SEQ ID NO:1)和組成型啟動(dòng)子ZmUbi (Zeamays Ubiquitin-1)(作為對(duì)照)驅(qū)動(dòng)抗蟲(chóng)基因表達(dá)，以抗草甘膦基因G6 (專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?200610052573.4)作為篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建雙元表達(dá)載體。
[0067]具體如下:
[0068]I)、對(duì) pCambial300 (Cambia, Australia ;圖1.a)載體進(jìn)行改造:
[0069]將原有的抗潮霉素基因替換為抗草甘膦基因G6，改造過(guò)的載體可以用Hind觀(guān)Kpn進(jìn)I行酶切，以它作為構(gòu)建T-DNA的基礎(chǔ)載體pCambial300-p35S_G6。
[0070]具體為:首先用PCR方法分別擴(kuò)增玉米Ubi基因和G6基因，通過(guò)PCR —方面在ZmUbi啟動(dòng)子基因兩端分別加上HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)，另一方面在G6基因兩端分別加上BamHI和XhoI+SacI位點(diǎn)。然后將PCR獲得的ubi基因和G6基因順次克隆入通用載體PMD19-T (Takara, Japan)載體中。用HindIII和XhoI酶切上述所得的載體，從而獲得pZmUb1-G6片段。接著，將載體pCambia 1300上的潮霉素抗性基因用XhoI酶切去除，將酶切后的載體回收后末端補(bǔ)平，與同樣末端補(bǔ)平的片段pZmUb1-G6連接,得到基礎(chǔ)載體pCambia1300-p35S-G6。
`[0071]2)、根據(jù)基因在水稻中表達(dá)密碼偏好性合成抗蟲(chóng)基因(Sangon Biotech，上海):
[0072]用正向Sy-ACGGGATC CA TGGA T AA CA ATCCG AA CA TC 和反向5’-ACGGAGCTCCTATTCCTCCATAAGGAG引物(下劃線(xiàn)部分分別為BamHI和SacI酶切位點(diǎn))擴(kuò)增CrylAc 基因；
[0073]擴(kuò)增體系50 μ 1:
[0074]
【權(quán)利要求】
1.植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen，其特征是為SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen，其特征是:所述植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen包含煙草花椰菜病毒35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列和玉米的 IOkDa 光系統(tǒng)蛋白 II (photosystem IIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分啟動(dòng)子序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen，其特征是:所述玉米的 IOkDa 光系統(tǒng)蛋白 II (photosystem IIlOkDa)基因(GenBank ID:EU961665)的部分啟動(dòng)子序列為以下任一: DSEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 2)SEQID NO:2所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸,且具有相同功能的核苷酸序列； 3)由SEQID NO: 2產(chǎn)生的具有控制基因在植物綠色組織特異表達(dá)的DNA功能片段。
4.一種表達(dá)盒，其特征是:利用如權(quán)利要求1~3任一所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子PGreen與目的基因連接所構(gòu)建而得。
5.一種植物表達(dá)載體，其特征是:利用如權(quán)利要求1~3任一所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen構(gòu)建而得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體,其特征是:植物表達(dá)載體為pCambial300-p35S-G6-pGreen_CrylAc0
7.如權(quán)利要求1~3任一所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在制備具有抗蟲(chóng)能力的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在制備具有抗蟲(chóng)能力的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用，其特征是:所述植物為水稻、玉米、棉花、小麥、大豆或高粱。
9.如權(quán)利要求1~3任一所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在提高植物抗蟲(chóng)活性中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物綠色組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子pGreen在提高植物抗蟲(chóng)活性中的應(yīng)用，其特征是:所述植物為水稻、玉米、棉花、小麥、大豆或高粱。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103525818SQ201310476765
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月14日
【發(fā)明者】秦毅, 方軍, 張先文, 沈志成 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)