一種瘤菌根菌菌株及其應(yīng)用和菌根真菌接種法
【專利摘要】一種瘤菌根菌（Epulorhiza?sp.）菌株S1（CGMCC?No.8145）及其在促進鐵皮石斛生長和促進鐵皮石斛多糖積累中的應(yīng)用。以鐵皮石斛（Dendrobium?officinale)的組培苗為材料，對其進行人工接種S1（Epulorhiza?sp.）菌株，共培養(yǎng)60天后，S1真菌與寄主根形成了共生關(guān)系，接菌苗的鮮重增長量、干重、株高、莖長、莖粗、莖節(jié)數(shù)、節(jié)間長、分蘗株數(shù)、新根數(shù)和多糖含量顯著高于對照，多糖含量高出未接菌苗含量的141.63%，約是未接菌苗多糖含量的2.4倍。采用該項新技術(shù)，可極大地促進鐵皮石斛組培苗的生長；提高鐵皮石斛組培苗的生物量和多糖含量。該項技術(shù)方法操作性強，可生產(chǎn)出高質(zhì)量的鐵皮石斛組培苗，為鐵皮石斛的高效栽培技術(shù)以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來較高的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種瘤菌根菌菌株及其應(yīng)用和菌根真菌接種法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體地,涉及一種瘤菌根菌菌株(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)及其在促進鐵皮石斛生長和多糖積累中的應(yīng)用和使用其的菌根真菌接種法。
【背景技術(shù)】:
[0002]石斛屬(Dendrobium)是蘭科(Orchidaceae)中的第二大屬，全世界石斛屬原生種的數(shù)量約有1100多種，主要分布在南亞、東亞和東南亞區(qū)域(Wang et al., 2011;Chen etal.，2010)。中國有81種，2變種(皺成勇和劉燕，2010)。石斛屬多種植物具有較高的藥用價值，有生津、止咳、潤喉、提高機體免疫力等功效，如鐵皮石斛、金釵石斛和鼓槌石斛等(中華人民共和國藥典委員會，2010)。
[0003]鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬中名貴的藥用植物，主要分布于云南、廣西、安徽等地。由于其對咽喉疾病、提高人體免疫力乃至腫瘤都具有顯著療效，成為了馳名中外的保健佳品。近年來由于市場對鐵皮石斛需求日益增加，如何改善鐵皮石斛人工栽培技術(shù)成為生產(chǎn)者需解決的重要問題。
[0004]鐵皮石斛(Dendrobium officinale)在海拔達1600m的林下古樹和水溝旁陸峭的巖壁上生長(Hou and Guo，2009)，具有重要的藥用價值，富含多糖，具有提高免疫力和抑制腫瘤細胞生長的功能(Luo et al., 2000;Li`n et al.，2011)。近些年來,天然藥物產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，人們在高額利潤的驅(qū)動下，常年毫無節(jié)制的采挖，野生鐵皮石斛數(shù)量急劇下降，而且它們的野外生境受到嚴(yán)重破壞，致使其處于瀕危境地(Liu et al.，2010)。因此，尋求有效的保護、重建其野外生境和可持續(xù)利用的途徑刻不容緩。為了保護這些珍貴的野生蘭科植物，擴繁技術(shù)是其有效途徑之一。目前，擴繁主要采用組培技術(shù)，但蘭科植物組培苗移栽成活率較低，生長比較緩慢(金輝等，2009)。制約人工大量生產(chǎn)和發(fā)展的障礙可能是組培苗到大田栽培的中間環(huán)節(jié)。在野外生境中，蘭科植物要與真菌共生形成菌根，才能健壯的生長(Smith et al.，2008)。本發(fā)明【背景技術(shù)】所涉及到的參考文獻有:金輝，許忠祥，陳金花等，2009.鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養(yǎng)過程中的相互作用.植物生態(tài)學(xué)報，33 (3):433-441 ;中華人民共和國藥典委員會，2010.中華人民共和國藥典.北京:化學(xué)工業(yè)出版社；皺成勇，劉燕，2010.我國石斛屬植物研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，38 (12):6164-6166 ;周玉杰，楊福孫，宋希強等，2009.菌根真菌對華石斛幼苗生長及光合性能的影響.北方園藝，12:11-15 ;Altschul SF, Gish ff, Miller W et al., 1990.Basic localalignment search tool.Journal of Molecular Biology, 215:403-410 ;Chen J, Hu KX,Hou XQ et al.,2010.Endophytic fungi assemblages fromlODendrobium medicinalplants (Orchidaceae).World Journal of Microbiology&Biotechnology, 27:1009-1016；Doyle JJ, Doyle JL, 1987.A rapid DNA isolation procedure for small quantitiesof fresh leaf tissues.Phytochemical Bulletin, 19:11 - 15 ；Hou XQ, Guo SX,2009.1nteraction between a Dark Septate Endophytic Isolate from Dendrobium sp.andRoots of D.nobile Seedlings.Journal of Integrative Plant Biology, 51:374-381 ； Lin Y，Li J，Li B et al., 2011.Effects of light quality on growth and development of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale in vitr0.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 105:329-335 ;Liu HX，Luo YB，Liu H,2010.Studies of mycorrhizal fungal of Chinese orchids and their role in orchid conservation in China-A Review.Botany Review,76:241-262 ；Luo HLjCai TYj Cheng QLj2000.Enhancement of Dendrobium candidum polysaccharides on killing effect of LAK cells of umbilical cord and peripheral cancer patients in vitr0.Chinese Journal of Cancer Research, 19:1124-1126 ；Ma M，Tan TKj Wong SM, 2003.1dentification and molecular phylogeny of Epulorhiza isolates from tropical orchids.Mycological Research, 107:1041-1049 ；Smith SE，Read DJj2008.Mycorrhizal symbiosis.Academic Press, New York ；Wang H，F(xiàn)ang HY，Wang YQ et al., 2011.1n situ seed baiting techniques in Dendrobium officinale Kimuraet Migo and Dendrobium nobile Lindl.: the endangered Chinese endemic Dendrobium (Orchidaceae).World Journal of Micro biology&Biotechnology，27:2051-2059。[0005]目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見有該種瘤菌根菌菌株(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)及其在促進鐵皮石斛生長中的應(yīng)用和在促進鐵皮石斛多糖積累中的應(yīng)用報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
:[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株SKCGMCC N0.8145) 及其在促進鐵皮石斛生長中的應(yīng)用和在促進鐵皮石斛多糖積累中的應(yīng)用和方法。[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:[0008]一種瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株(CGMCC N0.8145)。[0009]所述的瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)在促進鐵皮石斛生長中的應(yīng)用。[0010]所述的瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)在促進鐵皮石斛多糖積累中應(yīng)用。[0011]所述的應(yīng)用，是以鐵皮石斛4個月苗齡的組培苗為材料，對其進行人工接種SI (Epulorhiza sp.)菌株,培養(yǎng)60天后，SI真菌與寄主根形成共生關(guān)系。[0012]所述的應(yīng)用中，接種是在無菌條件下將鐵皮石斛4個月苗齡的組培苗轉(zhuǎn)接入 100ml/瓶的共生培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+7.5%蔗糖+7.5%瓊脂)的玻璃組培瓶中，每瓶8株苗，7天后，選取無污染的苗，取一 PDA平板培養(yǎng)基上活化的SI菌株瓊脂塊，接入組培瓶中心的培養(yǎng)基上，使染菌的瓊脂塊離8株苗的距離大致相同，置于溫度26±1°C，光照50 μ mol.m-2s-1 12h/d的組培室內(nèi)共培養(yǎng)。[0013]一種促進鐵皮石斛的生長和多糖積累的菌根真菌接種法，將所述的瘤菌根菌 (Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)人工接種到鐵皮石斛4個月苗齡的組培苗上， 置于溫度26±1°C，50 μ mol.m_2.s—1，12h/d的組培室內(nèi)共培養(yǎng)培60天后，SI真菌與寄主根形成共生關(guān)系。[0014]如所述的方法，組培苗的獲得是將鐵皮石斛完整的成熟蒴果沖洗干凈，75%乙醇表面消毒15min后,在0.1%升萊溶液中浸泡IOmin,無菌蒸懼水漂洗3次,用無菌濾紙吸干后，將種子播種于含有改良Harvais培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在溫度26± 1°C,光照50 μ mol.mis1,12h/d的組培室內(nèi)培養(yǎng)，種子萌發(fā)成幼苗后，無菌轉(zhuǎn)入另一含改良Harvais培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)4個月；無菌條件下，將上述鐵皮石斛4個月苗齡的組培苗轉(zhuǎn)接入每瓶100ml含有1/2MS培養(yǎng)基+7.5%蔗糖+7.5%瓊脂的共生培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶8株苗，7天后，選取無污染的苗，用打孔器打取PDA平板培養(yǎng)基上活化的SI菌株瓊脂塊，每瓶接入一個帶菌的瓊脂小塊，置于瓶中心的培養(yǎng)基上，使染菌的瓊脂塊離8株苗的距離大致相同；置于溫度26± 1°C,光照50 μ mol.m_2.s_\ 12h/d的組培室內(nèi)共培養(yǎng),60天后，SI真菌顯著地促進了鐵皮石斛幼苗的生長和可溶性多糖的積累。
[0015]如所述的方法，培養(yǎng)基的組成為:
[0016]PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20% (煮汁)葡萄糖2%瓊脂1.5% ；
[0017]改良Harvais 培養(yǎng)基:Ca (NO3).4H20200mg/L, NH4NO3140mg/L, KH2PO4IOOmg/L, MgSO4.7H20100mg/L, KNO3IOOmg/!, KC150mg/L, H3BO30.5mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L, ZnSO4.7H200.5mg/L, Na2MoO4.2H200.02mg/L, Co (NO3)2.6H200.025mg/L, KI0.lmg/L, MnSO4.H2Ol.54mg/L, (NH4) 3C6H50719mg/L, Fe (NH4) 3 (C6H5O7) 225mg/L, KT0.25mg,椰乳 20ml,蔗糖 20g,瓊脂 9g，活性炭 0.3g, 土豆 30g, PH5.6-5.8 ；
[0018]1/2MS 培養(yǎng)基:NH4N03825mg/L, KN03950mg/L, CaCl2.2H20220mg/L, MgSO4.7H20185mg/L, KH2P0485mg/L, KI0.83mg/L, H3B036.20mg/L, MnSO4.4H2022.30mg/L, ZnSO4.7H208.6Omg/L, Na2MoO4.2H200.2 5mg/L, CuSO4.5H200.02 5mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, FeSO4.7H2027.80mg/L, Na-EDTA.2H2037.30mg/L,肌醇 lOOmg/L,煙酸0.5mg/L,鹽酸批卩多醇(維生素B6) 0.5mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) 0.5mg/L,甘氨酸
2.0mg/Lο
`[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)益性在于:
[0020]本發(fā)明主要通過對鐵皮石斛組培苗進行接菌試驗，篩選鐵皮石斛的菌根真菌,為組培苗人工接種菌根真菌，提高移栽成活率，促進其快速生長發(fā)育提供技術(shù)支持。
[0021]本發(fā)明以鐵皮石斛4個月齡的組培苗為材料，對其進行人工接種SI (Epulorhizasp.)菌株。共培養(yǎng)60天后，SI真菌與寄主根形成了共生關(guān)系，接菌苗的鮮重增長量、干重、株高、莖長、莖粗、莖節(jié)數(shù)、節(jié)間長、分蘗株數(shù)、新根數(shù)和多糖含量顯著高于對照，多糖含量高出未接菌苗141.63%，是未接菌苗的2.4倍。采用該項新技術(shù)，可極大地促進鐵皮石斛的生長；提高鐵皮石斛生物量和多糖含量。該項技術(shù)方法操作性強，可生產(chǎn)出高質(zhì)量的鐵皮石斛組培苗，為鐵皮石斛的高效栽培技術(shù)以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來較高的經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】:
[0022]下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
[0023]實施例1:
[0024]I材料與方法
[0025]1.1內(nèi)生真菌的分離
[0026]取野生鐵皮石斛(2009年4月采自云南西雙版納亞熱帶森林中)的健康根，用水洗凈，在超凈工作臺上，放入0.1%升汞溶液中浸泡8~lOmin，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干，在無菌培養(yǎng)皿中橫切成0.5~Icm的小段,置于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),每皿放8個小段，25°C恒溫暗培養(yǎng)。待菌絲從根組織上長出并形成一定大小菌落時，從菌落的邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)移到另一 PDA平板上純培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)10~15d后，置于4°C冰箱保存。通過離體接種實驗，檢測到SI菌株對鐵皮石斛有很好的促進作用。[0027]1.2S1菌株的分子生物學(xué)鑒定:[0028]DNA提取:在PDA平板培養(yǎng)基上活化菌株后，無菌條件下挑取少量菌絲于1.5ml離心管中。采用CTAB法提取真菌的DNA (Doyle and Doyle, 1987)。[0029]PCR擴增:利用引物ITS1/ITS4對SI菌株的5.8S rDNA上的ITS區(qū)域進行擴增(Ma et al.，2003)。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L):2.5 μ LlO XBuffer (with Mg+), 2 μ L dNTP (2.5mM), 0.5μ L Taq polymerase (2.5U), 2 μ I (5 μ M *L_1)的各種引物，2 μ LDNA，14 μ L ddH20。反應(yīng)條件為94°C變性3min，進入94°C變性Imin的35個循環(huán)，53°C退火50s，72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，1.5%瓊脂糖膠檢測。將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。[0030]序列分析:將測得的序列用軟件ContigExpress進行校對，然后通過BLAST搜索在 GenBank 中進行序列比對(http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)，與 GenBank 中的序列相似度大于95%的,可以鑒定為同屬真菌(Altschul et al.，1990)。[0031]1.3真菌接種物[0032]將SI接種于含有PDA培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿(直徑9cm)中，25°C暗培養(yǎng)3周后，備用。[0033]1.4接種實驗[0034]1.4.1鐵皮石斛組培苗的獲得[0035]將鐵皮石斛完整的成熟蒴果，用流水沖洗干凈，75%乙醇表面消毒15min。然后在 0.1%升汞溶液中浸泡lOmin，無菌蒸餾水漂洗3次。用無菌濾紙吸干后，剖開。將種子播種于含有改良Harvais培養(yǎng)基(121 °C滅菌30min)的培養(yǎng)瓶(直徑8cm)中，放入溫度26 ± I °C， 光照50 μ mol.m_2.s_S 12h/d的組培室內(nèi)培養(yǎng)。種子萌發(fā)成幼苗后，無菌轉(zhuǎn)入另一含改良 Harvais培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。[0036]1.4.2接種方法[0037]選取上述步驟鐵皮石斛4個月苗齡的組培苗，在超凈工作臺上，轉(zhuǎn)接入玻璃組培瓶中(容積600ml，瓶口內(nèi)徑5cm)的定量(100ml/瓶)共生培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+7.5%蔗糖+7.5%瓊脂)中(Hou and Guo，2009)，每瓶8株幼苗。接苗前先在電子天平上稱裝有培養(yǎng)基的組培瓶重量(精確到0.01g),接入苗后，再稱重，計算每瓶的苗重。7天后，選取無污染的苗，用打孔器(0.33cm2)打取PDA平板培養(yǎng)基上活化的SI菌株瓊脂塊，每瓶接入一個帶菌的瓊脂小塊，置于瓶中心的培養(yǎng)基上，使染菌的瓊脂塊離8株苗的距離大致相同；對照組接入同樣大小無菌瓊脂塊。每個處理重復(fù)25瓶。所有接菌處理苗和對照苗均置于溫度 26±1°C，光照50 μ mol.m-2.s'12h/d的組培室內(nèi)培養(yǎng)。
[0038]1.5共生真菌的分離[0039]取共培養(yǎng)60天后的鐵皮石斛組培苗的根，分離方法同1.1內(nèi)生真菌的分離。[0040]1.6生長指標(biāo)的數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析[0041]共培養(yǎng)60天后，準(zhǔn)確稱取處理組苗和對照組苗的重量，結(jié)合處理前的重量，計算苗鮮重的增長量。測量株高、主莖長、莖粗、節(jié)間長。統(tǒng)計每瓶中8株苗的新根數(shù)、分蘗株數(shù)和莖節(jié)數(shù)，然后將苗置80°C烘箱中48h，記錄苗的干重，以上均以瓶為單位統(tǒng)計。稱量完干重之后將其磨成粉末，采用苯酚-硫酸法(中華人民共和國藥典委員會，2010)對石斛多糖含量進行測定。所有數(shù)據(jù)都使用SPSS17.0for Windows進行分析，不同處理間的差異比較采用單因素方差分析(ANOVA)和LSD檢驗。所有統(tǒng)計圖用SigmaPlotl0.0for Windows軟件繪制。
[0042]2結(jié)果與討論
[0043]2.1Sl菌株的分子鑒定
[0044]利用引物ITS1/ITS4能對SI菌株DNA的ITS區(qū)域擴增出約750bp的特異條帶，測序結(jié)果校對后，在GenBank中Blast結(jié)果為與Epulorhiza sp.有96%的相似度(表1 )。根據(jù)Altschul et al.(1990)的判定標(biāo)準(zhǔn)，SI菌株是Epulorhiza sp.真菌。該菌種已于2013年09月09日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號:CGMCC N0.8145，保存期限:30年。同時本 申請人:在實驗室內(nèi)將該菌株接種于若干支PDA斜面培養(yǎng)基試管，于25°C的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng),10~15d后,置于4°C冰箱保藏備用。
[0045]表1Sl基于ITS序列的Blast結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種瘤菌根菌（Epulorhiza sp.)菌株（CGMCC No. 8145)。
2.權(quán)利要求1所述的瘤菌根菌（Epulorhizasp.)菌株SI (CGMCC No. 8145)在促進鐵 皮石斛生長中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的瘤菌根菌（Epulorhizasp.)菌株SI (CGMCC No. 8145)在促進鐵 皮石斛多糖積累中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于以鐵皮石斛4個月苗齡的組培苗為材料， 對其進行人工接種SI (Epulorhiza sp.)菌株，培養(yǎng)60天后,S1真菌與寄主根形成共生關(guān) 系。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的接種是在無菌條件下，將鐵皮石斛4個 月苗齡的組培苗轉(zhuǎn)接入100ml/瓶的共生培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+7. 5%蔗糖+7. 5%瓊脂）的 玻璃組培瓶中，每瓶8株苗，7天后，選取無污染的苗，取一 PDA平板培養(yǎng)基上活化的S1菌株 瓊脂塊，接入組培瓶中心的培養(yǎng)基上，使染菌的瓊脂塊離8株苗的距離大致相同，置于溫度 26±1°C，光照50iimol.nT2. s_1,12h/d的組培室內(nèi)共培養(yǎng)。
6.一種促進鐵皮石斛的生長和多糖積累的菌根真菌接種法，其特征在于將權(quán)利要求1 所述的瘤菌根菌（Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC No. 8145)人工接種到鐵皮石斛4個月 苗齡的組培苗上，置于溫度26 土 1°C，光照50 u mol. m_2. s' 12h/d的組培室內(nèi)共培養(yǎng)培60 天后，S1真菌與寄主根形成共生關(guān)系。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的組培苗的獲得是將鐵皮石斛完整的成 熟蒴果沖洗干凈，75%乙醇表面消毒15min后，在0. 1%升萊溶液中浸泡lOmin,無菌蒸懼水 漂洗3次，用無菌濾紙吸干后，將種子播種于含有改良Harvais培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在溫度 26土 1°C,光照50 li mol. m_2. s_\ 12h/d的組培室內(nèi)培養(yǎng),種子萌發(fā)成幼苗后，無菌轉(zhuǎn)入另一 含改良Harvais培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)4個月；無菌條件下，將上述鐵皮石斛4個月苗 齡的組培苗轉(zhuǎn)接入每瓶100ml含有1/2MS培養(yǎng)基+7. 5%蔗糖+7. 5%瓊脂的共生培養(yǎng)基的組 培瓶中，每瓶8株苗，7天后，選取無污染的苗，用打孔器打取PDA平板培養(yǎng)基上活化的S1菌 株瓊脂塊，每瓶接入一個帶菌的瓊脂小塊，置于瓶中心的培養(yǎng)基上，使染菌的瓊脂塊離8株 苗的距離大致相同，置于溫度26± 1°C,光照50 ii mol. m 2. s \ 12h/d的組培室內(nèi)共培養(yǎng),60 天后，S1真菌顯著地促進了鐵皮石斛幼苗的生長和可溶性多糖的積累。
8.如權(quán)利要求5或6或7所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的組成為：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20% (煮汁）葡萄糖2%瓊脂1.5%;改良 Harvais 培養(yǎng)基：Ca (N03) ? 4H20200mg/L, NH4N03140mg/L, KH2P04100mg/ L, MgS04 ? 7H20100mg/L, KN03100mg/L, KC150mg/L, H3B030. 5mg/L, CuS04 ? 5H200. 025mg/ L, ZnS04 ? 7H200. 5mg/L, Na2Mo04 ? 2H200. 02mg/L, Co (N03)2 ? 6H200. 025mg/L, KI0. lmg/ L, MnS04 ? H201. 54mg/L, (NH4) 3C6H50719mg/L, Fe (NH4) 3 (C6H507) 225mg/L, KT0. 25mg,椰乳 20ml, 蔗糖 20g,瓊脂 9g，活性炭 0. 3g, 土豆 30g, PH5. 6-5. 8 ；1/2MS 培養(yǎng)基：NH4N03825mg/L, KN03950mg/L, CaCl2 ? 2H20220mg/L, MgS04 ? 7H20185mg/ L, KH2P0485mg/L, KI0. 83mg/L, H3B036 . 20mg/L, MnS04 ? 4H2022. 30mg/L, ZnS04 ? 7H208. 60mg/L, Na2Mo04 ? 2H200. 25mg/L, CuS04 ? 5H200. 025mg/L, CoCl2 *6H200. 025mg/L, FeS04 ? 7H2027. 80mg/ L, Na-EDTA ? 2H2037. 30mg/L,肌醇 lOOmg/L,煙酸 0. 5mg/L,鹽酸吡哆醇（維生素 B6) 0. 5mg/ L,鹽酸硫胺素(維生素B1) 0. 5mg/L,甘氨酸2. 0mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103497900SQ201310467768
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】嚴(yán)寧, 王秋霞, 紀(jì)大干, 李樹云, 胡虹 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所