爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了元紫紅爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，先將玉米自交系幼胚誘導(dǎo)出愈傷，經(jīng)兩次繼代，選取其中玉米胚型愈傷組織，直接再生成完整植株，所述玉米自交系為N10或N04本發(fā)明就爆裂玉米研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其再生體系進(jìn)行構(gòu)建及優(yōu)化，從而為以爆裂玉米自交系為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提供平臺(tái)。本發(fā)明提供一種遺傳轉(zhuǎn)化的材料，利用爆裂玉米自交系作為轉(zhuǎn)化受體，背景純合，省略掉與輪回親本多次回交的工作，而且易于觀察轉(zhuǎn)化后代的表現(xiàn)型。本發(fā)明可以為爆裂玉米的轉(zhuǎn)化提供平臺(tái)，減輕了轉(zhuǎn)化后數(shù)代回交的工作量。且爆裂玉米植株，籽粒均有自己獨(dú)特的特點(diǎn)，便于轉(zhuǎn)化后代表現(xiàn)型的鑒定。
【專利說明】爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種玉米培育方法，具體涉及爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，隨著玉米自交系B73大規(guī)模測(cè)序的完成，克隆了很多有用基因，加之基因工程技術(shù)手段的不斷發(fā)展和日趨完善，為轉(zhuǎn)基因育種打下了良好的基礎(chǔ)。自從1984年第一株轉(zhuǎn)基因植株的獲得，世界開展了對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的各項(xiàng)研究，同時(shí)也對(duì)玉米進(jìn)行性狀改良和基因功能的研究。玉米遺傳轉(zhuǎn)化已是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。
[0003]要做轉(zhuǎn)基因的相關(guān)研究就要有優(yōu)良的轉(zhuǎn)化體系， 當(dāng)今世界對(duì)普通玉米的轉(zhuǎn)化體系已研究甚多，尤其是利用雜交種HiII的轉(zhuǎn)化研究，但轉(zhuǎn)基因后代需要進(jìn)行多代的回交來純化遺傳背景，才能得到研究者所需要的轉(zhuǎn)基因材料。近年來，研究者們也致力于研究玉米自交系的再生體系。2011年，田風(fēng)龍對(duì)玉米自交系齊319、昌7-2、18-599和178的幼胚誘導(dǎo)愈傷，然后用農(nóng)桿菌侵染的方法得到了 DWF4的轉(zhuǎn)基因植株。2011年，季麗麗等以922、H99、丹598和丹988四個(gè)玉米自交系為材料，優(yōu)化了幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。2009年，陶芳等分別用法059、4K060、4K061、4K261、4K2965個(gè)高油玉米自交系的幼胚建立并優(yōu)化了其再生體系。2007年，侯麗紅分別用高油玉米自交系GY220、GY246、GY302、GY798和GY923的幼胚建立了其再生體系。2004年，胡建廣等以超甜玉米自交系S1、S2、S3和粵甜3號(hào)等幼胚為試驗(yàn)材料，建立其高效成株系統(tǒng)。2007年，梁雪蓮等以香白糯玉米幼胚為實(shí)驗(yàn)材料，建立其再生體系，并以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功得到了 cpTI和Bar基因的轉(zhuǎn)化植株。而對(duì)爆裂玉米再生體系及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究至今還是空白。爆裂玉米自交系遺傳轉(zhuǎn)化的研究具有頗多優(yōu)點(diǎn)。首先，與普通玉米相比，爆裂玉米生育期較短；其次，與普通玉米相比，爆裂玉米植株小，各植株性狀均具有顯著差異；且其籽粒小，便于觀察具有差異的表現(xiàn)型。若研究的相關(guān)基因是控制植株性狀、籽粒大小、產(chǎn)量等方面的，以爆裂玉米為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過對(duì)后代各性狀的調(diào)查，可以很容易得到表現(xiàn)型的相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因的深層次研究。再次，以爆裂玉米自交系為受體的遺傳轉(zhuǎn)化，篩選所得Tl代陽性植株即有表現(xiàn)型，不需要再進(jìn)行多次回交純化遺傳背景，即可在早代進(jìn)行分析比較，省時(shí)省力。最后，爆裂玉米本身就具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，通過遺傳轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)，也是一個(gè)重要的研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，先將玉米自交系幼胚誘導(dǎo)出愈傷，經(jīng)兩次繼代，選取其中玉米胚型愈傷組織，直接再生成完整植株，所述玉米自交系為NlO或N04，它的步驟如下:
(I)取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗滅菌處理后，在超凈工作臺(tái)中撥取幼胚，胚軸朝下放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出第一次玉米愈傷組織；
(2)由步驟(1)得到的第一次玉米愈傷組織切去胚芽轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，15天后得到第二次玉米愈傷組織；
(3)由步驟(2)得到的第二次玉米愈傷組織夾碎后轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每隔15天繼代一次，繼代兩次，得到玉米胚型愈傷組織；
(4)由步驟(3)得到的玉米胚型愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上得到玉米叢生苗；
(5)將步驟(4)得到的玉米叢生苗分成單個(gè)苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中再生成完整植株。
[0006]所述步驟(1)、步驟(2)、步驟(3)中N04的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L+N6 維生素(1000x)Iml + 2，4-D 0.4 mg/L + L-脯氨酸 5 g/L + 鹿糖 30 g/L + 肌醇 0.1g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + AgNO3 36 μ M/L + 植物凝膠 3 g/L, pH 為 5.8。
[0007]所述步驟(1)、步驟(2)、步驟(3)中NlO的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L+N6 維生素(1000x)Iml + 2，4-D 2 mg/L + L-脯氨酸2.76 g/L + 蔗糖30 g/L + 肌醇0.1g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + AgNO3 13 μ M/L + 植物凝膠 3 g/L, pH 為 5.8。
[0008]所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + 植物凝膠 3 g/L, pH 為 5.8。
[0009]所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30g/L + NAA 0.2 mg/L + 植物凝膠 30 g/L, pH 為 5.8。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明就爆裂玉米研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其再生體系進(jìn)行構(gòu)建及優(yōu)化，從而為以爆裂玉米自交系為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提供平臺(tái)。本發(fā)明提供一種遺傳轉(zhuǎn)化的材料，利用爆裂玉米自交系作為轉(zhuǎn)`化受體，背景純合，省略掉與輪回親本多次回交的工作，而且易于觀察轉(zhuǎn)化后代的表現(xiàn)型。本發(fā)明可以為爆裂玉米的轉(zhuǎn)化提供平臺(tái)，減輕了轉(zhuǎn)化后數(shù)代回交的工作量。且爆裂玉米植株，籽粒均有自己獨(dú)特的特點(diǎn)，便于轉(zhuǎn)化后代表現(xiàn)型的鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0011]爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，先將玉米自交系幼胚誘導(dǎo)出愈傷，經(jīng)兩次繼代，選取其中玉米胚型愈傷組織，直接再生成完整植株，所述玉米自交系為NlO或N04，它的步驟如下:
(1)取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗滅菌處理后，在超凈工作臺(tái)中撥取幼胚，胚軸朝下放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出第一次玉米愈傷組織；
(2)由步驟(1)得到的第一次玉米愈傷組織切去胚芽轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，15天后得到第二次玉米愈傷組織；
(3)由步驟(2)得到的第二次玉米愈傷組織夾碎后轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每隔15天繼代一次，繼代兩次，得到玉米胚型愈傷組織；
(4)由步驟(3)得到的玉米胚型愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上得到玉米叢生苗；
(5)將步驟(4)得到的玉米叢生苗分成單個(gè)苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中再生成完整植株。
[0012]所述步驟(1)、步驟(2)、步驟(3)中N04的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L(購自 Sigma 公司，貨號(hào)為 m0404)+N6 維生素(1000x) Iml + 2，4-D 0.4 mg/L + L-脯氨酸 5g/L +蔗糖30 g/L +肌醇0.1 g/L +水解酪蛋白0.1 g/L + AgNO3 36 μ M/L +植物凝膠3 g/L，pH 為 5.8。
[0013]所述步驟(1)、步驟(2)、步驟(3)中NlO的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L(購自 Sigma 公司，貨號(hào)為 m5519)+N6 維生素(1000x) Iml + 2，4-D 2 mg/L + L-脯氨酸 2.76g/L +蔗糖30 g/L +肌醇0.1 g/L +水解酪蛋白0.1 g/L + AgNO3 13 μ M/L +植物凝膠 3 g/L，pH 為 5.8。
[0014]所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L (購自Sigma公司，貨號(hào)為m5519) + 肌醇 0.1 g/L + 蔗糖 30 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + 植物凝膠 3 g/L,pH 為 5.8。
[0015]所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L (購自Sigma公司，貨號(hào)為m5519) + 肌醇 0.1 g/L + 蔗糖 30 g/L + NAA 0.2 mg/L + 植物凝膠 30 g/L,pH 為 5.8。
[0016]接種與培養(yǎng):取授粉后10-11天的幼穗，70%酒精對(duì)苞葉進(jìn)行逐層滅菌處理，剝?nèi)グ~的玉米幼穗放入超凈工作臺(tái)中，用5%的次氯酸鈉滅菌處理，20分鐘后，取出幼穗，用解剖刀切去一半的胚乳，然后撥取幼胚，胚軸朝下放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。27土1°C暗培養(yǎng)3-5天后即可看到幼胚膨化長出胚芽，切去胚芽，把已膨化的幼胚轉(zhuǎn)移到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，
2-3周后即可看到形成的胚型愈傷。形成的胚型愈傷組織就可轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)一周左右，在胚型愈傷表明即可看到有綠色芽點(diǎn)形成。繼續(xù)培養(yǎng)一周后，開始有叢生苗分化出來，將叢生苗分割開來，每個(gè)苗分別轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。
[0017]本發(fā)明中愈傷組織的誘導(dǎo)，愈傷組織的分化及生根培養(yǎng)均在室內(nèi)進(jìn)行，在愈傷組織的培養(yǎng)階段，不需要光照的暗培養(yǎng)調(diào)條件是:溫度:27土1°C，培養(yǎng)時(shí)間:24h，在愈傷組織分化和生根培養(yǎng)階段采用光照培養(yǎng) 室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度:27土 TC，光照強(qiáng)度:1500-20001χ，每天光照14h。
【權(quán)利要求】
1.爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，其特征在于，先將玉米自交系幼胚誘導(dǎo)出愈傷，經(jīng)兩次繼代，選取其中玉米胚型愈傷組織，直接再生成完整植株，所述玉米自交系為NlO或N04，它的步驟如下: (1)取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗滅菌處理后，在超凈工作臺(tái)中撥取幼胚，胚軸朝下放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出第一次玉米愈傷組織； (2)由步驟(1)得到的第一次玉米愈傷組織切去胚芽轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，15天后得到第二次玉米愈傷組織； (3)由步驟(2)得到的第二次玉米愈傷組織夾碎后轉(zhuǎn)移到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每隔15天繼代一次，繼代兩次，得到玉米胚型愈傷組織； (4)由步驟(3)得到的玉米胚型愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上得到玉米叢生苗； (5)將步驟(4)得到的玉米叢生苗分成單個(gè)苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中再生成完整植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，其特征在于:所述步驟(1)、步驟(2)、步驟(3)中N04的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L +N6維生素 I ml + 2, 4-D 0.4 mg/L + L-脯氨酸 5 g/L + 鹿糖 30 g/L + 肌醇 0.1 g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + AgNO3 36 μ M/L + 植物凝膠 3 g/L, pH 為 5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，其特征在于:所述步驟(1)、步驟(2)、步驟(3)中NlO的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L +N6維生素 Iml + 2, 4-D 2 mg/L + L-脯氨酸 2.76 g/L + 鹿糖 30 g/L + 肌醇 0.1 g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L+ AgNO3 13 μ M/L + 植物凝膠 3 g/L, pH 為 5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，其特征在于:所述步驟(4)中的分化培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + 植物 凝膠 3 g/L, pH 為 5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法，其特征在于:所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30 g/L +NAA 0.2 mg/L + 植物凝膠 30 g/L, pH 為 5.8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103477980SQ201310401998
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】李玉玲, 董永彬, 薛曉靜 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)