制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法，包括：將體細胞在細胞培養(yǎng)液A中培養(yǎng)1-3天；在細胞培養(yǎng)液B中繼續(xù)培養(yǎng)1-6天；然后在細胞培養(yǎng)液C中繼續(xù)培養(yǎng)1-6天；以及收集雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞；本發(fā)明還提供了一種用于制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的試劑盒。使用本發(fā)明的方法及試劑盒在非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的產(chǎn)量、純度、生產(chǎn)速度方面具有顯著優(yōu)勢。
【專利說明】制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法、 試劑盒、干細胞及應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說，涉及制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體 生殖干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多 種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞是一 類具備無限自我更新和分化潛能的早期胚胎細胞，是當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時內(nèi)層細胞 圖案的細胞，其具有可以向各胚層范疇的細胞分化的能力。成體細胞是指存在于人和哺乳 動物特定組織或器官中（包括骨髓、神經(jīng)、肌肉、表皮、睪丸或腎臟等）的具有修復和再生能 力的干細胞，在特定條件下，成體干細胞產(chǎn)生新的干細胞或按一定的程序化形成新的功能 細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡，與胚胎干細胞不同的是，成體干細胞 只可以向其定居的組織類型分化。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各 種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學界稱為"萬用細胞"。睪丸里的生殖干細胞，是睪丸中所 有精細胞和內(nèi)分泌細胞的母親細胞、種子細胞。睪丸里的生殖干細胞在男性和雄性動物的 生命進程中，是一個進行性和累計性的消耗過程。生殖干細胞的消耗殆盡時，睪丸老化，喪 失生精和排精功能，荷爾蒙降低，男性和雄性動物進入老年。因此，生殖干細胞的消耗，睪丸 功能枯渴，睪丸衰老與男性和雄性動物的整體衰老及壽命的長短有密切關(guān)聯(lián)。
[0003] 現(xiàn)在國際上主要采用兩種方法制備生殖干細胞。一種方法是通過自然的胚胎干細 胞體外分化形成異體生殖細胞，應用于研究領(lǐng)域，；第二種方法是從睪丸或卵巢分離培養(yǎng)制 備自體生殖干細胞，應用不孕不育的治療領(lǐng)域，分離培養(yǎng)耗時困難，生殖細胞來源困難，獲 取數(shù)量極其稀少。
[0004] 應用自體生殖干細胞移植，進行衰老睪丸的再生和再造，是延緩睪丸衰老，恢復和 提升機體各種機能和延長壽命的有效方法。但是，如何獲得足夠數(shù)量、安全性低的男性和雄 性動物自體生殖干細胞，是一個有待研發(fā)的醫(yī)學生物學難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)中獲取的男性和雄性動物自體生殖干細胞數(shù)量少、安全性低的問 題，本發(fā)明提供了一種制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法，該方法包 括：
[0006] 將體細胞以5X IO6的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中。體細胞包括但不限于雄性動物 的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞等。
[0007] 在37°C和5%的CO2的環(huán)境中，將體細胞或單個核細胞在細胞培養(yǎng)液A( RPMI 1640 培養(yǎng)液）中培養(yǎng)1-3天。培養(yǎng)液A中含有：
[0008] 1-100 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N3O. 2HC1)，優(yōu)選值為 10 μ M ;
[0009] l-100ng/ml的干細胞因子，優(yōu)選值為lOng/ml ;
[0010] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素3,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0011] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素6,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0012] l-100ng/ml的白細胞介素11，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0013] l-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0014] l-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0015] 1-100 μ g/ml的巖藻多糖，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0016] 1-100 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0017] I-IOOnM 的 AMD 3100 (1，1，-[1,4-亞苯基二（亞甲基）]-二-1,4, 8, 11)，優(yōu)選 值為IOnM ;
[0018] 1-100 μ M 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)，優(yōu)選值為 10 μ M ;以及
[0019] 1-100 μ M的氨羥二磷酸二鈉，優(yōu)選值為10 μ Μ。
[0020] 在37°C和5%的CO2的環(huán)境中，將體細胞或單個核細胞在細胞培養(yǎng)液B (DMEM培養(yǎng) 液）中培養(yǎng)1-6天。培養(yǎng)液B中含有：
[0021] 1-100 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N3O · 2HC1)，優(yōu)選值為 10 μ M ;
[0022] 1-100 μ M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇，優(yōu)選值為10 μ M ;
[0023] 1-100 μ g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (ΒΜΡ-2)，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0024] 1-100 μ g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5)，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0025] l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為100ng/ml ;
[0026] l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0027] 100-10000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0)，優(yōu)選值為3000IU/ml ;
[0028] l_200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子）（⑶NF)，優(yōu)選值為20ng/ml ;
[0029] l-1000ng/ml的干細胞因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0030] l-l〇〇〇ng/ml的白細胞介素3,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0031] l-l〇〇〇ng/ml的白細胞介素6,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0032] l-1000ng/ml的白細胞介素11，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0033] l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0034] l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0035] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，優(yōu)選值為 10ng/ml ;
[0036] 1-100 μ M的煙酰胺，優(yōu)選值為10 μ M ;
[0037] l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（ΝΤ4)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0038] l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0039] l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0040] l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0041] l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-1)，優(yōu)選值為10ng/ml ;以及
[0042] 1-1000 μ g/ml的地塞米松，優(yōu)選值為10 μ g/ml。
[0043] 在37°C和5%的CO2的環(huán)境中，將體細胞或單個核細胞在細胞培養(yǎng)液C (M16培養(yǎng) 液）中培養(yǎng)1-6天。培養(yǎng)C中含有：
[0044] 1-100 μ M的RHO激酶抑制劑Y-27632,優(yōu)選值為10 μ M ;
[0045] l-1000ng/ml的支持細胞特異蛋白（ΑΜΗ)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0046] l-1000ng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SF1))，優(yōu)選值為 10ng/ml ；
[0047] l-1000ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY) (Y染色體性別決定區(qū))，優(yōu)選值為 10ng/ml ；
[0048] 1-100 μ g/ml的高泳動家族性別決定基因9 (S0X9)，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0049] l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為100ng/ml ;
[0050] l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0051] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO)，優(yōu)選值為3000IU/ml ;
[0052] l_200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF)，優(yōu)選值為20ng/ml ;
[0053] l-100ng/ml的干細胞因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0054] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素3,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0055] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素6,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0056] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素11，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0057] l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0058] l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0059] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，優(yōu)選值為 10ng/ml ;
[0060] 1-100μ M 的煙酰胺（Nicotinamide)，優(yōu)選值為 10μ M ;
[0061] l-1000ng/ml的表皮生長因子（EGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0062] l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0063] l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0064] l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0065] l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0066] l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-1)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0067] l-1000ng/ml的生長因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;以及
[0068] 1-100 μ g/ml的地塞米松，優(yōu)選值為10 μ g/ml。
[0069] 輕輕吹打分別在細胞培養(yǎng)液A、細胞培養(yǎng)液B及細胞培養(yǎng)液C中培養(yǎng)后的細胞，使 細胞完全懸浮后，收集細胞于離心管中，進行離心操作，然后使用生理鹽水對懸浮的細胞進 行清洗操作，重復3次后，將細胞懸浮于生理鹽水中，得到非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體 生殖干細胞。
[0070] 將得到的非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞以IXlOVml至IX 106/ml 的細胞密度與等體積的二甲基亞砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，將混合物降溫 至-80°C，然后轉(zhuǎn)移到_186°C液氮中深低溫保存。
[0071] 在本方法中，所使用的優(yōu)選培養(yǎng)液為：
[0072] 培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含有：
[0073] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0074] 10ng/ml的干細胞因子；
[0075] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0076] lOng/ml的白細胞介素6 ;
[0077] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0078] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0079] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0080] 10 μ g/ml的巖藻多糖；
[0081] 10 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯；
[0082] IOnM 的 AMD 3100 (1，1' -[1,4-亞苯基二（亞甲基）]-二-1,4, 8, 11);
[0083] 10 μ M 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及
[0084] 10 μ M的氨羥二磷酸二鈉。
[0085] 培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有：
[0086] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Υ-27632 ;
[0087] 10 μ M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇；
[0088] 10μ g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (ΒΜΡ-2);
[0089] 10 μ g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5);
[0090] l〇〇ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0091] l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子；
[0092] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO);
[0093] 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF);
[0094] 10ng/ml的干細胞因子；
[0095] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0096] l-1000ng/ml 的白細胞介素 6 ;
[0097] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0098] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0099] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0100] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0101] 10 μ M的煙酰胺；
[0102] 10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（ΝΤ4);
[0103] 10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF);
[0104] 10ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF);
[0105] 10ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF);
[0106] 10ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-I);以及
[0107] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0108] 培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有：
[0109] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0110] l〇ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH);
[0111] 10ng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SFl)) ;10ng/ml的Y染 色體性別決定基因（SRY);
[0112] 10 μ g/ml的高泳動家族性別決定基因9 (S0X9);
[0113] 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0114] lOng/ml的酸性成纖維細胞生長因子；
[0115] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO);
[0116] 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF);
[0117] 10ng/ml的干細胞因子；
[0118] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0119] 10ng/ml的白細胞介素6 ;
[0120] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0121] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0122] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0123] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0124] 10 μ M 的煙醜胺（Nicotinamide);
[0125] 10ng/ml的表皮生長因子（EGF);
[0126] 10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4);
[0127] 10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF);
[0128] 10ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF);
[0129] 10ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF);
[0130] 10ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-I);
[0131] 10ng/ml的生長因子；以及
[0132] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0133] 本發(fā)明還提供了一種用于制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的試 劑盒。試劑盒包括細胞培養(yǎng)液A、細胞培養(yǎng)液B和細胞培養(yǎng)液C。其中：
[0134] 培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含有：
[0135] 1-100 μ M的RHO激酶抑制劑Y-27632,優(yōu)選值為10 μ M ;
[0136] l-100ng/ml的干細胞因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0137] l-100ng/ml的白細胞介素3,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0138] l-100ng/ml的白細胞介素6,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0139] l-100ng/ml的白細胞介素11，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0140] l-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0141] l-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0142] 1-100 μ g/ml的巖藻多糖，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0143] 1-100 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0144] I-IOOnM 的 AMD 3100 (1，I' -[1,4-亞苯基二（亞甲基）]-二-1,4, 8, 11)，優(yōu)選 值為IOnM ;
[0145] 1-100 μ M 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)，優(yōu)選值為 10 μ M ;以及
[0146] 1-100 μ M的氨羥二磷酸二鈉，優(yōu)選值為10 μ Μ。
[0147] 培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有：
[0148] 1-100 μ M的RHO激酶抑制劑Υ-27632,優(yōu)選值為10 μ M ;
[0149] 1-100 μ M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇，優(yōu)選值為10 μ M ;
[0150] 1-100 μ g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (BMP-2)，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0151] 1-100 μ g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5)，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0152] l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為100ng/ml ;
[0153] l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0154] 100-10000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0)，優(yōu)選值為3000IU/ml ;
[0155] l_200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF)，優(yōu)選值為20ng/ml ;
[0156] l-1000ng/ml的干細胞因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0157] l-1000ng/ml的白細胞介素3,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0158] l-1000ng/ml的白細胞介素6,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0159] l-l〇〇〇ng/ml的白細胞介素11，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0160] l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0161] l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0162] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，優(yōu)選值為 10ng/ml ;
[0163] 1-100μΜ的煙酰胺，優(yōu)選值為ΙΟμΜ;
[0164] l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（ΝΤ4)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0165] l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0166] l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0167] l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0168] l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-1)，優(yōu)選值為10ng/ml ;以及
[0169] 1-1000 μ g/ml的地塞米松，優(yōu)選值為10 μ g/ml。
[0170] 培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有：
[0171] 1-100μΜ的RHO激酶抑制劑Y-27632,優(yōu)選值為ΙΟμΜ ;
[0172] l-1000ng/ml的支持細胞特異蛋白（ΑΜΗ)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0173] l-1000ng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SF1))，優(yōu)選值為 10ng/ml ；
[0174] l-1000ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0175] 1-100 μ g/ml的高泳動家族性別決定基因9 (S0X9)，優(yōu)選值為10 μ g/ml ;
[0176] l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為100ng/ml ;
[0177] l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0178] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0)，優(yōu)選值為3000IU/ml ;
[0179] l_200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF)，優(yōu)選值為20ng/ml ;
[0180] l-100ng/ml的干細胞因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0181] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素3,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0182] l-l〇〇ng/ml的白細胞介素6,優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0183] l-100ng/ml的白細胞介素11，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0184] l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0185] l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0186] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，優(yōu)選值為 10ng/ml ;
[0187] 1-100μ M 的煙酰胺（Nicotinamide)，優(yōu)選值為 ΙΟμΜ ;
[0188] l-1000ng/ml的表皮生長因子（EGF)，優(yōu)選值為lOng/ml ;
[0189] l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0190] l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0191] l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0192] l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0193] l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-1)，優(yōu)選值為10ng/ml ;
[0194] l-1000ng/ml的生長因子，優(yōu)選值為10ng/ml ;以及
[0195] 1-100 μ g/ml的地塞米松，優(yōu)選值為10 μ g/ml。
[0196] 優(yōu)選地，試劑盒的組成包括：
[0197] 培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含有：
[0198] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0199] 10ng/ml的干細胞因子；
[0200] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0201] l〇ng/ml的白細胞介素6 ;
[0202] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0203] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0204] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0205] 10 μ g/ml的巖藻多糖；
[0206] 10 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯；
[0207] IOnM 的 AMD 3100 ;
[0208] 10 μ M 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及
[0209] 10 μ M的氨羥二磷酸二鈉。
[0210] 培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有：
[0211] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Υ-27632 ;
[0212] 10 μ M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇；
[0213] 10μ g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (ΒΜΡ-2);
[0214] 10 μ g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5);
[0215] 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0216] 10ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子；
[0217] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO);
[0218] 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF);
[0219] 10ng/ml的干細胞因子；
[0220] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0221] l-1000ng/ml 的白細胞介素 6 ;
[0222] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0223] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0224] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0225] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0226] 10 μ M的煙酰胺；
[0227] lOng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4);
[0228] 10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF);
[0229] 10ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF);
[0230] 10ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF);
[0231] 10ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-I);以及
[0232] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0233] 培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有：
[0234] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0235] 10ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH);
[0236] 10ng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SFl));
[0237] 10ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY);
[0238] 10 μ g/ml的高泳動家族性別決定基因9 (S0X9);
[0239] 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0240] 10ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子；
[0241] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO);
[0242] 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF);
[0243] 10ng/ml的干細胞因子；
[0244] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0245] 10ng/ml的白細胞介素6 ;
[0246] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0247] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0248] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0249] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0250] 10 μ M 的煙醜胺（Nicotinamide);
[0251] 10ng/ml的表皮生長因子（EGF);
[0252] 10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4);
[0253] 10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF);
[0254] 10ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF);
[0255] 10ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF);
[0256] 10ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-I);
[0257] 10ng/ml的生長因子；以及
[0258] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0259] 該試劑盒可以在用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病的藥物的自體生殖干 細胞的制備過程中應用，其中可以治療的涉及器官再生再造和修復的疾病包括睪丸衰老； 自體生殖干細胞包括雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞。可以使用本發(fā)明中提供 的制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法制備自體生殖干細胞以及雄性 非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞。
[0260] 通過本發(fā)明的上述方法及試劑盒，并且本發(fā)明改善了用于獲得男性或雄性非睪丸 源性蛋白誘導性自體生殖干細胞生產(chǎn)技術(shù)，在男性或雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖 干細胞的產(chǎn)量、純度、生產(chǎn)速度方面具有顯著優(yōu)勢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0261] 圖1是周圍單個核細胞（PBMC)在顯微鏡下的示圖。
[0262] 圖2是PBMC逆向分化后得到的非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞(M-PiGSC) 在顯微鏡下的示圖。
[0263] 圖3至圖6是示出了細胞鑒定結(jié)果的表型檢測圖。
[0264] 圖7是M-PiGSC細胞的染色體核型檢測圖。
[0265] 圖8示出了干細胞轉(zhuǎn)化率測定的結(jié)果的曲線圖。

【具體實施方式】
[0266] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的 范圍。
[0267] 實施例1試劑盒的制各
[0268] 在10-100級潔凈度的安全操作臺里操作，4-10度的低溫條件下配制。
[0269] 在500ml的RPMI 640培養(yǎng)液中，分別加入：
[0270] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0271] 10ng/ml的干細胞因子；
[0272] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0273] 10ng/ml的白細胞介素6 ;
[0274] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0275] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0276] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0277] 10 μ g/ml的巖藻多糖；
[0278] 10 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯；
[0279] IOnM 的 AMD 3100 (1，1' _[1，4-亞苯基二（亞甲基）]-二-1，4, 8, 11);
[0280] 10 μ M 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及
[0281] 10 μ M的氨羥二磷酸二鈉。
[0282] 充分溶解，然后經(jīng)0. 22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液Α。
[0283] 在500ml的DMEM培養(yǎng)液中，分別加入：
[0284] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0285] 10 μ M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇；
[0286] 10μ g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (ΒΜΡ-2);
[0287] 10 μ g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5);
[0288] 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0289] 10ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子；
[0290] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO);
[0291] 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF);
[0292] 10ng/ml的干細胞因子；
[0293] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0294] l-1000ng/ml 的白細胞介素 6 ;
[0295] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0296] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0297] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0298] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0299] 10 μ M的煙酰胺；
[0300] 10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（ΝΤ4);
[0301] 10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF);
[0302] 10ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF);
[0303] 10ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF);
[0304] 10ng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-I);以及
[0305] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0306] 充分溶解，然后經(jīng)0. 22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液B。
[0307] 在500ml的M16培養(yǎng)液中，分別加入：
[0308] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ;
[0309] 10ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH);
[0310] l〇ng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SFl));
[0311] l〇ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY);
[0312] 10 μ g/ml的高泳動家族性別決定基因9 (S0X9);
[0313] 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0314] 10ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子；
[0315] 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO);
[0316] 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF);
[0317] 10ng/ml的干細胞因子；
[0318] 10ng/ml的白細胞介素3 ;
[0319] 10ng/ml的白細胞介素6 ;
[0320] 10ng/ml的白細胞介素11 ;
[0321] 10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF);
[0322] 10ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF);
[0323] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0324] 10 μ M 的煙醜胺（Nicotinamide);
[0325] 10ng/ml的表皮生長因子（EGF);
[0326] 10ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4);
[0327] 10ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF);
[0328] 10ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF);
[0329] 10ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF);
[0330] lOng/ml的類胰島素生長因子-I (IGF-I);
[0331] 10ng/ml的生長因子；以及
[0332] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0333] 充分溶解，然后經(jīng)0. 22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液C。
[0334] 將細胞培養(yǎng)液A、細胞培養(yǎng)液B以及細胞培養(yǎng)液C分別置于試劑盒的三個相互隔離 的容器內(nèi)，從而制成用于制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的試劑盒。
[0335] 實施例2非睪丸源件蛋白誘導件雄件自體牛葙干細朐（M-PiGSC)的制各
[0336] 如圖1所示，抽取男性靜脈血液(人靜脈血來源于
【發(fā)明者】本人及志愿者)50ml，使用 常規(guī)Ficoll離心分離技術(shù)對男性靜脈血液進行離心分離，從而獲取血液單個核細胞。將獲 得的單個核細胞以5xl0 6的密度，用實施例1中配制的細胞培養(yǎng)液A，在37°C和5%的CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；然后換用實施例1中配制的細胞培養(yǎng)液B，繼續(xù)對單個核細胞以5xl0 6的 密度進行培養(yǎng)6天；然后換用實施例1中配制的細胞培養(yǎng)液C，繼續(xù)對單個核細胞以5xl06 的密度進行培養(yǎng)6天。輕輕吹打分別在細胞培養(yǎng)液A、細胞培養(yǎng)液B及細胞培養(yǎng)液C中培 養(yǎng)后的體細胞或單個核細胞，使細胞完全懸浮后，收集細胞于離心管中，進行離心操作，然 后使用生理鹽水對懸浮的細胞進行清洗操作，重復3次后，將細胞懸浮于生理鹽水中。如 圖2所示，得到非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞。將得到的非睪丸源性蛋白誘 導性雄性自體生殖干細胞以IXlOVml至IXlO 6Ail的細胞密度與等體積的二甲基亞砜和 10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，將混合物降溫至-80°C，然后轉(zhuǎn)移到-186°C液氮中深 低溫保存。
[0337] 實施例3
[0338] 實施例3使用與實施例2相同的方法制備非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干 細胞。其不同之處僅在于選擇3-5月齡的Balb/C雄性小鼠(購買自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī) 學院(天津)，動物合格證號=SCXK (津）2010-0002)，采集其周圍血及股骨血液，從而替代男 性靜脈血液。
[0339] 通過以下試驗對實施例2及實施例3制得的M-PiGSC進行類型性鑒定及安全鑒 定。
[0340] 實驗1細胞鑒定
[0341] 1)用已預先制得的聚-D-賴氨酸的載玻片，選擇實施例2中制備的非睪丸源性蛋 白誘導性雄性自體生殖干細胞的最佳的細胞懸液濃度，用細胞制片離心機在1800RCF下 轉(zhuǎn)動拋片2分鐘制成玻片并做好標記，拋片上細胞密度(細胞均勻，密度適當)。拋片晾干后 存放于-20度冰箱中凍存。從-20度冰箱中取出細胞玻片在室溫晾干，在反面用記號筆劃 定區(qū)域。然后使用4%多聚甲醒(購買自Solarbio)固定，經(jīng)過2%的Triton X-IOO打孔10 分鐘以及磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值為7. 4)的清洗后，使用10%正常山羊血清在室溫的條件 下封閉1小時，得到樣品。將第一抗體試劑加入樣品中，所使用的第一抗體為兔抗人c-Kit 多克隆抗體（1:100;購買自Abcam公司，產(chǎn)品編號為ab5506)，在4°C的條件下使樣品中的 抗原與第一抗體反應12小時(過夜)。然后在使用磷酸鹽緩沖液（PBS)清洗樣品后，將與第 一抗體相對應的第二抗體加入到樣品中，第二抗體為FITC標記標記的羊抗兔IgG (1:200 ; 購買自Chemicon公司，產(chǎn)品編號為AP132F)使樣品中的第一抗體與第二抗體反應1小時。 在室溫的條件下使用DAPI (1:1000)進行染核步驟。在使用磷酸鹽緩沖液PBS清洗后，對樣 品進行封片劑封片操作，所使用封邊劑為甘油/PBS封片劑（甘油：PBS=1 :9, pH8. 0-8. 5,美 工生物公司制造)。最后使用尼康熒光顯微鏡觀察拍照，在6-8小時內(nèi)完成各種拍照。
[0342] 2)使用與1)中相同的方法進行細胞鑒定，其不同之處僅在于所使用的第一抗體為 兔抗人DDX4/MVH多克隆抗體（1:100,購買自Abcam公司，產(chǎn)品編號為abl3840)。
[0343] 3)使用與1)中相同的方法進行細胞鑒定，其不同之處僅在于所使用的第一抗體為 兔抗人Fragilis多克隆抗體（1:100;購買自Abcam公司，產(chǎn)品編號為ab74699)。
[0344] 4)使用與1)中相同的方法進行細胞鑒定，其不同之處僅在于所使用的干細胞為實 施例3中制備的非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞，并且所使用的第一抗體為兔 抗鼠 DAZL多克隆抗體（1:100;購買自Abcam公司，產(chǎn)品編號為ab34139)。
[0345] 實驗結(jié)果
[0346] 圖3至圖6是示出了細胞鑒定結(jié)果的表型檢測圖，其中，圖3示出了實施例2制得 的細胞在與一抗(兔抗人c-Kit多克隆抗體)及二抗（FITC標記標記的羊抗兔IgG)反應后， 可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分，從而說明實施例2中所制得的細胞為男性非睪丸源性 蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞。
[0347] 圖4示出了實施例2制得的細胞在與一抗(兔抗人DDX4/MVH多克隆抗體）及二抗 (FITC標記標記的羊抗兔IgG)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分，從而說明實施 例2中所制得的細胞為男性非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞。
[0348] 圖5示出了實施例2制得的細胞在與一抗(兔抗人Fragilis多克隆抗體）及二抗 (FITC標記標記的羊抗兔IgG)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分，從而說明實施 例2中所制得的細胞為男性非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞。
[0349] 圖6示出了實施例3制得的細胞在與一抗(兔抗鼠 DAZL多克隆抗體)及二抗（FITC 標記標記的羊抗兔IgG)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分，從而說明實施例3中 所制得的細胞為雄性小鼠的非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞。
[0350] 實驗2染色體分折
[0351] 挑取十個實施例2中制備的非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞集落，將 其接種于細胞培養(yǎng)液中，在5%的C02, 37°C條件下培養(yǎng)68小時。在培養(yǎng)終止前2-4小時，向 培養(yǎng)液中加入秋水仙素(用Iml注射器5號針尖滴加2滴)，使培養(yǎng)液中的秋水仙素的濃度 為0. 07 μ g/ml。將處理后的培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)移到潔凈的離心管中，以IOOOrpm的離心速率在 離心機中進行8-10分鐘的離心操作,然后棄上清液。取8ml低滲液在37°C下進行預熱,然 后將其加入上述離心管中，并用滴管攪拌均勻，置于37°C的恒溫水浴中進行15分鐘-25分 鐘的低滲處理。向低滲處理后的濁液中加入〇. 5ml的固定液，輕輕振蕩試管使其混合均勻， 然后在IOOOrmp的離心速率下在離心機中進行8-10分鐘的離心操作。在離心操作之后，去 除試管中的上清液，再向試管中加入5ml的固定液，靜置20分鐘，然后在IOOOrmp的離心速 率下在離心機中進行8-0分鐘的離心操作，去除上清液。將上述加固定液的操作重復進行 3次。最終形成DNA懸液。使用滴管吸取制得的DNA懸液10ml-20ml，將其滴在干燥潔凈的 載玻片上，輕輕吹散，氣干。然后使用1:10的Giemsa染色劑對其進行5分鐘-10分鐘的染 色。使用細水洗去多余的染色液，氣干。在顯微鏡下使用低倍物鏡進行觀察，尋找分散良 好、染色適中的分裂相，然后使用油鏡觀察染色體形態(tài)并計數(shù)，數(shù)碼照相機照相。
[0352] 實驗結(jié)果
[0353] 如圖7所示，實施例2中制得的非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞 (M-PiGSC)的DNA數(shù)量及形態(tài)均與體細胞中DNA的數(shù)量及形態(tài)相同。實驗結(jié)果說明使用本 發(fā)明中的方法沒有改變細胞DNA基因組。
[0354] 實驗3干細胞轉(zhuǎn)化率(生產(chǎn)率）測定
[0355] 根據(jù)與實施例2及實施例3中的方法，按下表中分組個方式對人和小鼠的PBMC分 別進行分組培養(yǎng)：
[0356]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法，包括： 將體細胞在細胞培養(yǎng)液A中培養(yǎng)1-3天； 在細胞培養(yǎng)液B中繼續(xù)培養(yǎng)1-6天； 然后在細胞培養(yǎng)液C中繼續(xù)培養(yǎng)1-6天；以及 收集雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞； 其中所述培養(yǎng)液A是RPMI1640培養(yǎng)液，其中含有： 1-100 ii M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N30. 2HC1); l-100ng/ml的干細胞因子； l-100ng/ml的白細胞介素3 ; l-100ng/ml的白細胞介素6 ; l-100ng/ml的白細胞介素11 ; l-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 1-100 li g/ml的巖藻多糖； 1-100 g/ml的葡聚糖硫酸酯； l-100nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亞苯基二（亞甲基）]-二 _1，4,8，11); 1-100 iiM 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 1-100 ii M的氨羥二磷酸二鈉； 其中所述培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有： 1-100 ii M 的 RH0 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N30 ? 2HC1); 1-100 ii M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇； l-100ii g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2); 1-100 ii g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5); l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 100-10000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0); l-200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF); l-1000ng/ml的干細胞因子； l-1000ng/ml的白細胞介素3 ; l-1000ng/ml的白細胞介素6 ; l-1000ng/ml的白細胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 ii M的煙酰胺； l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l);以及 1-1000 li g/ml的地塞米松； 其中所述培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有： 1-100 ii M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ; l-1000ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH); l-1000ng/ml的I型類固醇原生生長因子（SF1); l-1000ng/ml的Y染色體性別決定區(qū)（Y染色體性別決定基因（SRY)); l-100ii g/ml的高泳動家族性別決定基因9(SOX9); l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); l-200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF); l-100ng/ml的干細胞因子； l-100ng/ml的白細胞介素3 ; l-100ng/ml的白細胞介素6 ; l-100ng/ml的白細胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 uM 的煙醜胺（Nicotinamide); l-1000ng/ml的表皮生長因子（EGF); l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l); l-1000ng/ml的生長因子；以及 1-100 ii g/ml的地塞米松。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述培養(yǎng)液A中的培養(yǎng)條件是溫度為37°C和 5%的C02環(huán)境。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含有： 10 ii M的RH0激酶抑制劑Y-27632 ; 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l〇yg/ml的巖藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，-[1，4_ 亞苯基二（亞甲基）]-二-1，4,8，11); 10 iiM 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 U M的氨羥二磷酸二鈉； 所述培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有： 10. ii M 的 RH0 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N30 ? 2HC1); 10. M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇； 10U g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; l-1000ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（G-CSF); 10ng/ml 激活素 A(activin A); 10. M的煙酰胺； l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l);以及 10. ii g/ml的地塞米松； 所述培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; l〇ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH); lOng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY); 10U g/ml的高泳動家族性別決定基因9(SOX9); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; lOng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的煙醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生長因子（EGF); l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生長因子；以及 lOii g/ml的地塞米松。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含有： 10 ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l〇yg/ml的巖藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亞苯基二（亞甲基）]-二 _1，4,8，11); 10iiM 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 的氨羥二磷酸二鈉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; 10. M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇； 10U g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; l-1000ng/ml的白細胞介素6 ; lOng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10. M的煙酰胺； l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l);以及 lOii g/ml的地塞米松。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有： 10 ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; l〇ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH); lOng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY); 10U g/ml的高泳動家族性別決定基因9(S0X9); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的煙醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生長因子（EGF); l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生長因子；以及 lOii g/ml的地塞米松。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，進一步包括： 將收集的所述自體生殖干細胞細胞冷凍保存，所述冷凍保存步驟包括： 將產(chǎn)生的所述自體生殖干細胞以lX105/ml至lX106/ml的細胞密度與等體積的二甲 基亞砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合； 降溫至_80°C ; 然后轉(zhuǎn)移到_186°C液氮中深低溫保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述體細胞包括但不限于雄性動物的臍帶血 細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞等。
9. 一種用于制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的試劑盒，包括： 細胞培養(yǎng)液A、細胞培養(yǎng)液B和細胞培養(yǎng)液C ; 其中所述培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含有： 1-100 ii M 的 RH0 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N30. 2HC1); l-100ng/ml的干細胞因子； l-100ng/ml的白細胞介素3 ; l-100ng/ml的白細胞介素6 ; l-100ng/ml的白細胞介素11 ; l-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 1-100 li g/ml的巖藻多糖； 1-100 g/ml的葡聚糖硫酸酯； l-100nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亞苯基二（亞甲基）]-二 _1，4,8，11); 1-100 iiM 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 1-100 ii M的氨羥二磷酸二鈉； 其中所述培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有： 1-100 ii M 的 RH0 激酶抑制劑 Y-27632 (C14H21N30 ? 2HC1); 1-100 ii M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇； l-100ii g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2); 1-100 ii g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5); l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 100-10000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0); l-200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF); l-1000ng/ml的干細胞因子； l-1000ng/ml的白細胞介素3 ; l-1000ng/ml的白細胞介素6 ; l-1000ng/ml的白細胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 ii M的煙酰胺； l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l);以及 1-1000 li g/ml的地塞米松； 其中所述培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有： 1-100 ii M 的 RHO 激酶抑制劑 Y-27632 ; l-1000ng/ml的AMH(支持細胞特異蛋白）； l-1000ng/ml的I型類固醇原生生長因子（SF1); l-1000ng/ml的Y染色體性別決定區(qū)（Y染色體性別決定基因（SRY)); l-100ii g/ml的高泳動家族性別決定基因9(SOX9); l-1000ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l-1000ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); l-200ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF); l-100ng/ml的干細胞因子； l-100ng/ml的白細胞介素3 ; l-100ng/ml的白細胞介素6 ; l-100ng/ml的白細胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 uM 的煙醜胺（Nicotinamide); l-1000ng/ml的表皮生長因子（EGF); l-1000ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l-1000ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l-1000ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l-1000ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l-1000ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l); l-1000ng/ml的生長因子；以及 1-100 ii g/ml的地塞米松。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含 有： 10. ii M的RH0激酶抑制劑Y-27632 ; 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); lOng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); lOug/ml的巖藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亞苯基二（亞甲基）]-二 _1，4,8，11); 10iiM 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 U M的氨羥二磷酸二鈉； 所述培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有： 10. ii M的RH0激酶抑制劑Y-27632 ; 10. M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇； 10U g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EP0); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; l-1000ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10. M的煙酰胺； l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l);以及 10. ii g/ml的地塞米松； 所述培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; l〇ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH); lOng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY); 10U g/ml的高泳動家族性別決定基因9(SOX9); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); lOng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的煙醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生長因子（EGF); l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生長因子；以及 lOii g/ml的地塞米松。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述培養(yǎng)液A是RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含 有： 10. ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); l〇yg/ml的巖藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亞苯基二（亞甲基）]-二 _1，4,8，11); 10iiM 的 M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 的氨羥二磷酸二鈉。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述培養(yǎng)液B是DMEM培養(yǎng)液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; 10. M的1-磷酸-神經(jīng)鞘氨醇； 10U g/ml的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生長分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); lOng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 1-lOOOng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10. M的煙酰胺； l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l);以及 lOii g/ml的地塞米松。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述培養(yǎng)液C是M16培養(yǎng)液，其中含有： 10 ii M的RHO激酶抑制劑Y-27632 ; l〇ng/ml的支持細胞特異蛋白（AMH); lOng/ml的支持細胞特異蛋白（I型類固醇原生生長因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色體性別決定基因（SRY); 10U g/ml的高泳動家族性別決定基因9(S0X9); 100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子； l〇ng/ml的酸性成纖維細胞生長因子； 3000IU/ml的促紅細胞生成素（EPO); 20ng/ml的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF); 10ng/ml的干細胞因子； 10ng/ml的白細胞介素3 ; 10ng/ml的白細胞介素6 ; l〇ng/ml的白細胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的煙醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生長因子（EGF); l〇ng/ml的神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT4); l〇ng/ml的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF); l〇ng/ml的角質(zhì)化細胞生長因子（KGF); l〇ng/ml的神經(jīng)生長因子（NGF); l〇ng/ml的類胰島素生長因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生長因子；以及 10li g/ml的地塞米松。
14. 權(quán)利要求9-13所述的試劑盒在制備自體生殖干細胞以用于治療涉及器官再生再 造和修復的疾病的藥物中的應用。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的應用，其中，所述疾病包括睪丸衰老。
16. 權(quán)利要求9-13所述的試劑盒在建立雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞 庫的應用。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法制備的自體生殖干細胞。
18. 權(quán)利要求1-6的方法制備的所述自體生殖干細胞在用于治療涉及器官再生再造和 修復的疾病的藥物中的應用。
19. 權(quán)利要求1-6的方法制備的所述自體生殖干細胞在建立雄性非睪丸源性蛋白誘導 性自體生殖干細胞庫的應用。
【文檔編號】A01N1/02GK104419658SQ201310362164
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】林雄斌, 林柳吟 申請人:林雄斌