專利名稱：一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培
養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
為了滿足不斷增加的人口對食物的需求，促使人們大規(guī)模種植遺傳背景較為單一的小麥優(yōu)良品種，這使得栽培小麥的遺傳基礎(chǔ)變窄，遺傳變異減少，對病蟲害的抗性及環(huán)境適應(yīng)能力減弱。為解決這一突出問題，育種家們開始把目光轉(zhuǎn)向有著豐富基因資源的小麥近緣物種，希望通過遠緣雜交能夠向栽培品種中導(dǎo)入不同種屬植物的有利基因，提高和改進栽培品種的經(jīng)濟性狀，尤其是提高抗生物脅迫和非生物脅迫能力，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲和耐逆的作物品種。自從Barelle在1806年進行第一次小麥遠緣雜交以來，在小麥遠緣雜交方面的研究己經(jīng)有了長足的發(fā)展(李軍輝，2002).其中，鵝觀草(Roegneria kamojiOhwi) (2n=6x=42)屬于小麥族中最大的屬一鵝觀草屬，是一種六倍體多年生禾草，蘊藏著豐富的遺傳多樣性，具有多花多粒、耐濕、抗寒、耐旱、耐堿及高抗赤霉病等特性，是牧草育種和作物改良的天然基因庫，也是一種具有較高經(jīng)濟價值的多年生優(yōu)質(zhì)牧草，吸引了眾多研究者的關(guān)注。鶴觀草屬Roegneria是C.Koch于1848年以高加索鶴觀草R.caucasica C.Koch為模式種建立的。現(xiàn)知全世界130余種，主要分布在北半球的溫寒地帶。我國約70余個種，主要分布于西北、西南和華北地區(qū)。國外學(xué)者從18世紀(jì)就對該屬植物的分類進行了研究，隨后國內(nèi)外 對該屬的工作主要集中于利用小麥、大麥等作物與鵝觀草遠緣雜交進行抗赤霉病育種研究(汪杏芬，1994;吳麗芳，1997);利用形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)、同功酶、RAH)和SSR等手段研究鵝觀草及其近緣種的遺傳變異、種的劃分、親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化的研究上(肖海峻，小麥族鵝觀草屬植物研究進展，草業(yè)科學(xué)，2007，24 (4):)。但針對其穗軸脆，易倒伏，高感白粉病等不良性狀，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，特別是基因工程技術(shù)進行研究則少見報道，因此加強從現(xiàn)代生物技術(shù)角度對該屬植物的研究，探討如何有效地利用這一豐富的野生牧草資源，具有很高的生態(tài)及育種價值。而且利用現(xiàn)代生物技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)對植物進行遺傳改良具有高效、快捷等特點，在許多植物育種中已成功應(yīng)用，為鵝觀草利用現(xiàn)代生物技術(shù)育種提供了重要的借鑒。建立鵝觀草高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進行遺傳改良重要前提，但目前報道的鵝觀草組織培養(yǎng)及植株再生體系均不完善，再生率偏低，不能滿足轉(zhuǎn)基因的需要。鵝觀草種子非常小，且種皮結(jié)構(gòu)致密，難以徹底消毒滅菌，特別是鵝觀草未成熟種子攜帶大量內(nèi)生真菌，主要是在那些植物體內(nèi)完成其全部或部分生活史，但又不引起任何病癥的微生物(Bacon&Siegel，1988)。對于鵝觀草組織培養(yǎng)來說內(nèi)生菌作為污染源，必須通過消毒滅菌和在培養(yǎng)基中加入殺菌劑加以抑制，否則無法獲得離體培養(yǎng)的成功?；仡欀参矬w細胞培養(yǎng)研究的歷史，人們都是從選擇合適的外植體、篩選與此相應(yīng)的培養(yǎng)條件，特別是培養(yǎng)基成分、激素的配比等著手，同樣重要的是找到理想的外植體及其適宜的時期。小麥的體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的突破，最重要的是選擇到了授粉后15d左右的未成熟胚和相應(yīng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。未成熟胚有其簡易、方便、能大量取材、再生能力強等明顯的優(yōu)點，成為目前小麥基因轉(zhuǎn)化的主導(dǎo)受體。因此，與小麥類似，本研究將從鵝觀草未成熟胚的取材時期、種子消毒、誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基的成分及激素配比等方面入手，建立一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，以鵝觀草未成熟種子剝?nèi)〉挠着邽橥庵搀w，依次進行(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；(2)愈傷組織誘導(dǎo)芽的分化和伸長；(3)生根壯苗獲得再生植株三個階段的培養(yǎng)。階段(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)條件為黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為250C ±1°C，培養(yǎng)時間為28天。階段(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織使用的培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加終濃度為5mg/L的2，4-D (2, 4- 二氯苯氧乙酸),或6mg/L的Dicamber (麥草畏)中的任意一種。階段(2)和階段(3) 1500-2000勒克斯的光培養(yǎng)，光照時間為12h/d，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為25°C ± 1°C，每培養(yǎng)28天換新鮮培養(yǎng)基。階段(2)愈傷組織誘導(dǎo)芽的分化和伸長使用的培養(yǎng)基為以大量元素減半的MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加終濃度為2mg/l的激動素(KT)以及l(fā)mg/L的萘乙酸(NAA)，或者添加終濃度為lmg/1的激動素(K T)以及l(fā)mg/L的萘乙酸(NAA)。階段(I)中誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于階段(2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天芽分化后用相同培養(yǎng)基進行一次繼代培養(yǎng)。階段(3)生根壯苗獲得再生植株使用的培養(yǎng)基是大量元素減半的MS培養(yǎng)基添加終濃度為lmg/L的NAA，500mg/L的活性炭以及500mg/L的多效唑。本發(fā)明將鵝觀草(Roegneria kamoji Ohwi)未成熟種子從幼穗上剝離,70%的酒精浸泡30s,,再用0.1%的升萊浸泡并振蕩15min,以無菌水沖洗3_5次。無菌條件下在解剖鏡下剝離幼胚接種至第(I)階段的培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)28天后在形成白色致密的愈傷組織。在上述第(I)階段的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)28天，愈傷組織誘導(dǎo)率達到75%以上，選取其中結(jié)構(gòu)較致密的白色或淡黃愈傷組織，轉(zhuǎn)入第(2)階段的培養(yǎng)基培養(yǎng)28天，芽分化后用相同培養(yǎng)基進行一次繼代培養(yǎng)，芽誘導(dǎo)率達75%以上，將帶芽的愈傷塊轉(zhuǎn)入第(3)階段的培養(yǎng)基，在光強為1500-2000勒克斯的光照條件下培養(yǎng)28天，植株再生率達85%以上。將再生植株在溫度為25°C、濕度75%左右的光照培養(yǎng)箱中揭開封口膜煉苗4-7d。之后取出再生植株，洗凈根部附著培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)(珍珠巖:草碳:大田土 =1:1:1)中用塑料膜覆蓋保濕。7d后，揭開塑料膜，成活率達95%。有益效果:本發(fā)明從鵝觀草未成熟種子的幼胚高效誘導(dǎo)出愈傷組織，嚴格抑制住內(nèi)生菌污染并且不影響其分化出大量的穩(wěn)定、均一的再生植株，因此此體系可用于基因工程或細胞工程育種。


:圖1鵝觀草未成熟種子圖2不同大小的鵝觀草未成熟胚圖3誘導(dǎo)出的愈傷組織圖4愈傷組織的分化圖5再生植株誘導(dǎo)圖6移栽成活苗
具體實施方式
:在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍:實施例1:鵝觀草幼胚誘導(dǎo)愈傷組織過程中內(nèi)生真菌的抑制將鵝觀草開花后12-15天的未成熟種 子從幼穗上剝離(圖1)，70%的酒精浸泡30s,，再用0.1%的升汞浸泡并振蕩15min，以無菌水沖洗3_5次。無菌條件下在解剖鏡下剝離幼胚分別接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSD2和添加15mg/L苯萊特(Benlate)的MSD2中，黑暗培養(yǎng)10天后，統(tǒng)計內(nèi)生真菌污染數(shù)的胚數(shù)，結(jié)果表明在MSD2培養(yǎng)基中，污染率高達66.7%，而在添加15mg/L苯萊特(Benlate)的MSD2培養(yǎng)基中，污染率降至3.3% (表I)。因此在培養(yǎng)基中加入15mg/L苯萊特(Benlate)可有效抑制內(nèi)生真菌的生長。MSD2培養(yǎng)基的制備是將激素2，4_D (2，4_ 二氯苯氧乙酸)2mg/L直接添加MS培養(yǎng)基的其他成分中，然后高壓滅菌而制得的，苯萊特(Benlate)用少量酒精溶解后加水配成15mg/ml母液，待MSD2培養(yǎng)基冷卻至60°C左右時加入。所用儀器設(shè)備是植物組織培養(yǎng)所公知的超凈工作機、自動高壓滅菌鍋等設(shè)備。在整個再生體系培養(yǎng)體過程中，培養(yǎng)基PH值均為5.8，溫度均為25±1°C。表I鵝觀草幼胚誘導(dǎo)愈傷組織過程中內(nèi)生真菌的抑制
權(quán)利要求
1.一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于以鵝觀草未成熟種子剝?nèi)〉拈L度100-200um的幼胚為外植體，依次進行(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；(2)愈傷組織誘導(dǎo)芽的分化和伸長；(3)生根壯苗獲得再生植株三個階段的培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)條件為黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C ± 1°C，培養(yǎng)時間為28天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織使用的培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加終濃度為2-5mg/L的2，4-D,3_6mg/L的麥草畏,0-0.5mg/L的6-BA中的任意一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(I)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織使用的培養(yǎng)基為添加終濃度為5mg/L的2，4-D，或終濃度為6mg/L的麥草畏中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(2)和階段(3) 1500-2000勒克斯的光培養(yǎng)，光照時間為12h/d，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為25°C ±1°C，每培養(yǎng)28天換新鮮培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(2)愈傷組織誘導(dǎo)芽的分化和伸長使用的培養(yǎng)基為以大量元素減半的MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加終濃度為2mg/l的激動素以及l(fā)mg/L的NAA，或者添加終濃度為lmg/1的激動素以及l(fā)mg/L的萘乙酸NAA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(I)中誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于階段(2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天芽分化后用相同培養(yǎng)基進行一次繼代培 養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法，其特征在于階段(3)生根壯苗獲得再生植株使用的培養(yǎng)基是大量元素減半的MS培養(yǎng)基添加終濃度為lmg/L的NAA,500mg/L的活性炭以及500mg/L的多效唑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高頻的鵝觀草幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和再生的培養(yǎng)方法。該方法主要步驟包括以鵝觀草未成熟種子為材料，消毒滅菌后剝離幼胚置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得愈傷組織，在芽分化培養(yǎng)基中高頻誘導(dǎo)芽叢及在生根壯苗培養(yǎng)基獲得再生植株。在整個培養(yǎng)階段通過添加苯萊特能有效抑制內(nèi)生真菌的生長。在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)通過添加一定配比的2,4-D、Dicamba、6-BA可有效將愈傷組織的誘導(dǎo)率提高到75%以上。在分化培養(yǎng)到再生培養(yǎng)過程，通過改變植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比，芽誘導(dǎo)率達90%以上，植株再生率達85%以上。
文檔編號A01H4/00GK103210843SQ20131012250
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者邢莉萍, 錢晨, 王蘇玲, 曹愛忠, 陳佩度 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)