專(zhuān)利名稱(chēng)：玉米自交系花粉管通道轉(zhuǎn)基因改良技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程。
玉米是世界上重要的栽培農(nóng)作物之一，利用基因技術(shù)，將外源目的基因轉(zhuǎn)入玉米，對(duì)玉米品種進(jìn)行改良具有重要意義。目前，玉米基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用較廣的方法是以幼胚愈傷組織為受體系統(tǒng)的基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。這兩種轉(zhuǎn)移方法的主要不足是一、II型胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在基因間具有明顯的差異，某些基因的II型胚性愈傷組織誘導(dǎo)率極低，難以建立受體系統(tǒng)；二、在組織培養(yǎng)過(guò)程中容易引發(fā)受體基因型發(fā)生變異；三、轉(zhuǎn)移成本相對(duì)較高。
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的玉米自交系花粉管通道轉(zhuǎn)基因改良技術(shù)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明采用常規(guī)技術(shù)獲得外源目的基因的質(zhì)粒DNA，檢測(cè)質(zhì)粒的濃度、純度和質(zhì)粒大小，然后放入-20℃冰箱內(nèi)保存，本發(fā)明外源目的基因的導(dǎo)入在玉米自交后6～24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，將雌穗上的紙袋摘下，用剪刀將雌穗花絲靠近穗頂部全部剪去，留下平齊的切面，然后用針式微量進(jìn)樣器在切口處滴注射器100～300微升純化好的外源目的基因DNA液，立即重新套上紙袋，做好記載，標(biāo)明導(dǎo)入的時(shí)間和用量；根據(jù)目的基因所攜帶的選擇標(biāo)志抗性基因，配制選擇培養(yǎng)基，將收獲的種子滅菌后置于選擇培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)，選擇生長(zhǎng)發(fā)育正常的幼苗進(jìn)行多酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)，對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性植株，進(jìn)行分子雜交(Southern Blot)分析和目標(biāo)性狀鑒定，再對(duì)轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行自交純化和農(nóng)藝性狀鑒定，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因玉米自交系。
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的玉米自交系轉(zhuǎn)基因改良方法，在玉米授粉后形成花粉管通道的特殊時(shí)間，將外源目的DNA通過(guò)花粉管通道注入到玉米的剛剛形成的胚體上，使外源目的DNA在特定時(shí)間進(jìn)入到玉米胚體的組織內(nèi)。本發(fā)明提供了一種全新概念的基因轉(zhuǎn)化方法，與其他現(xiàn)有技術(shù)相比，手段簡(jiǎn)便，不需要特殊的實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)要求，特別適用于育種研究人員掌握，便于推廣應(yīng)用。本發(fā)明不需要組織培養(yǎng)過(guò)程，避免了受體自交系發(fā)生非目標(biāo)性狀的遺傳變異。本發(fā)明轉(zhuǎn)化成本低，不存在基因型間的特異性，適用于各種基因型的轉(zhuǎn)化，具有轉(zhuǎn)化效率高、改良時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例將慈菇蛋白酶抑制基因(API)轉(zhuǎn)入玉米自交系M017，培育抗蟲(chóng)玉米自交系。
在玉米開(kāi)花期，從種植的M017自交系群體中選擇發(fā)育正常的健壯典型植株20株，進(jìn)行套袋自交。
在玉米自交后8小時(shí)進(jìn)行API基因的導(dǎo)入，將玉米雌穗上的紙袋摘下，用剪刀將雌穗花絲靠近穗頂部全部剪去，留下平齊的切面，然后用針式微量進(jìn)樣器在切口處滴注射器200微升純化好API基因DNA液，立即重新套上紙袋，做好記載，標(biāo)明導(dǎo)入的時(shí)間和用量。
等玉米果穗成熟時(shí)，收獲、曬干、脫粒，得到轉(zhuǎn)化玉米粒。
根據(jù)目的基因所攜帶的選擇標(biāo)志抗性基因，配制卡那霉素選擇培養(yǎng)基，將收獲的種子滅菌后置于培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)，選擇生長(zhǎng)發(fā)育正常的幼苗進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)，對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性植株，進(jìn)行分子雜交(Southern Blot)分析和抗蟲(chóng)性鑒定。
對(duì)表現(xiàn)抗蟲(chóng)性的轉(zhuǎn)化單株進(jìn)行自交純化和農(nóng)藝性狀鑒定，培育成抗玉米螟的轉(zhuǎn)API基因M017自交系。
權(quán)利要求
1.玉米自交系花粉管通道轉(zhuǎn)基因改良技術(shù)，采用常規(guī)技術(shù)獲得外源目的基因的質(zhì)粒DNA，檢測(cè)純度和質(zhì)粒大小，然后放入-20℃冰箱內(nèi)保存，其特征在于外源目的基因的導(dǎo)入在玉米自交后6～24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，將雌穗上的紙袋摘下，用剪刀將雌穗花絲靠近穗頂部全部剪去，留下平齊的切面，然后用針式微量進(jìn)樣器在切口處滴注100～300微升純化好的外源目的基因DNA液，立即重新套上紙袋，做好記載，標(biāo)明導(dǎo)入的時(shí)間和用量；根據(jù)目的基因所攜帶的選擇標(biāo)志抗性基因，配制選擇培養(yǎng)基，將收獲的種子滅菌后置于培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)，選擇生長(zhǎng)發(fā)育正常的幼苗進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)，對(duì)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)呈陽(yáng)性植株，進(jìn)行分子雜交分析和目標(biāo)性狀鑒定，再對(duì)轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行自交純化和農(nóng)藝性狀鑒定，培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因玉米自交系。
全文摘要
玉米自交系花粉管通道轉(zhuǎn)基因改良技術(shù)。外源目的基因的導(dǎo)入在玉米自交后6～8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行,將雌穗花絲全部剪去,在切口處滴注100～300微升外源目的基因DNA液,重新套上紙袋,做好記載。將收獲的種子滅菌后置于培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng),對(duì)幼苗進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)和分子雜交分析,再對(duì)轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行自交純化和農(nóng)藝性狀鑒定,培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因玉米自交系。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的玉米自交系轉(zhuǎn)基因改良方法,適用于各種基因型的轉(zhuǎn)化,具有轉(zhuǎn)化效率高、改良時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1383715SQ0111392
公開(kāi)日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2001年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月29日
發(fā)明者王丕武, 張君, 張曉玲, 祁新 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)