專利名稱：一種有機(jī)添加物對金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖關(guān)鍵技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于金線蓮的產(chǎn)業(yè)化快速繁殖培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
金線HShorthairyAntenoron)屬蘭科開唇蘭屬 YAnoectochilusroxburghii (wall.) Lindl]多年生珍稀中草藥植物，中文學(xué)名是花葉開唇蘭,索有“藥王”、“金草”、“神藥”、“烏人參”等美稱。別名金絲線、金耳環(huán)、烏人參、金線虎頭蕉、金線入骨消、金錢草、金線石松、金石蠶、少年紅、小葉金耳環(huán)、麻葉菜。主要分布于中國、日本、斯單蘭卡、印度和尼泊爾等國，生長在深山密林下或溪澗旁潮濕的草叢中或釣一林下，特別是闊葉林下的潮濕地帶，一般呈稀疏、零星分布，很少成片密生，金線蓮是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，因其葉脈呈金黃色的美麗脈紋，觀賞價值極高，也具有開發(fā)為室內(nèi)觀葉小盆栽的廣闊前景，金線蓮含有多種化學(xué)成分，藥理作用顯著，臨床應(yīng)用十分廣泛。分析其成分表明，其含有強(qiáng)心苷類、有機(jī)酸、氨基酸和多糖類、牛磺酸、留醇、生物堿、Sorghumol、黃酮苷及其衍生物、對羥基苯甲醛、阿魏酸、槲皮素、粗脂肪、胡蘿卜有及微量元素如硒、鑰等。具有涼血瀉火、消腫止痛的功效，能調(diào)節(jié)體內(nèi)分泌，抑制分泌過多的油質(zhì)，促進(jìn)皮膚細(xì)胞的新陳代謝，服用后對青春痘、粉刺、各種黑斑、雀斑、老人斑效果奇佳，具有降血糖、抗腎炎、護(hù)肝、利尿、鎮(zhèn)靜、降血壓、抗氧化、改善骨質(zhì)疏松等作用，其中多糖成分對癌細(xì)胞具有較好的殺傷作用，是非常有前景的抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物。金線蓮種子微小，胚發(fā)育不完全，在自然條件下極難出芽'，若以分根或扦插繁殖，則耗時長且繁殖系數(shù)低，金線蓮賴以生存的自然環(huán)境發(fā)生變化，野生資源銳減，現(xiàn)已瀕絕，并且自然環(huán)境生長的金線蓮因人為大量采挖及鳥、鼠等動物啃食己大大降低了自然存量，種質(zhì)資源稀缺，已瀕臨滅絕，不能滿足臨床需要。近年來人工繁殖金線蓮的工作也相應(yīng)廣泛展開，組培快繁金線蓮雖已有報道，金線蓮的組培快繁技術(shù)在各個環(huán)節(jié)上的研究也取得較大進(jìn)展，但目前生產(chǎn)中尚缺完備的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，在規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)上有待進(jìn)一步研究和突破，本發(fā)明涉及一種金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖培養(yǎng)技術(shù)，通過應(yīng)用本發(fā)明可以提供大面積種植的優(yōu)良純化組培苗，以期為金線蓮產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖的組織培養(yǎng)方法，提供大面積種植的優(yōu)良純化組培苗，解決現(xiàn)有技術(shù)中種子微小，胚發(fā)育不完全，在自然條件下極難出芽繁殖系數(shù)低等問題，選擇合適添加有機(jī)添加物的培養(yǎng)基繁殖對金線蓮苗產(chǎn)品品質(zhì)、成品苗品像產(chǎn)生直接影響，應(yīng)用該方法培養(yǎng)增殖時間短、擴(kuò)繁系數(shù)高、一次性成苗、苗健康、莖粗、根系發(fā)達(dá)、葉片顏色深厚有明顯的絨布狀，葉脈金線明晰，成活率高，每株重量達(dá)4.5-5.5克，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，同時應(yīng)用本發(fā)明在實施規(guī)?；a(chǎn)業(yè) 化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)上得到了進(jìn)一步突破，為金線蓮種資源的推廣和發(fā)展以及將其應(yīng)用于植物基因工程和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和完善具有重要意義。
一種有機(jī)添加物對金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖關(guān)鍵技術(shù):
所述方法具體步驟包括:
O 取材:外植體材料為野生金線蓮；在春秋季節(jié)采摘，采摘后將其用濕布包好帶回實驗室備用；
2)培養(yǎng)基的配制:
芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS +BA 0.5-2.0mg.L_1+KT 0.5_2mg.L、NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1+ 活性炭 l-2g.Γ1+ 瓊脂 6.5g.Γ1 ；
叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.Γ1 +NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1 + 香蕉汁 50-150 g.Γ1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.Γ1 + 活性炭 l_2g.L-1 + 瓊脂
6.5g.L 1 ；
芽增殖培養(yǎng)基:1/2MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.L-1+NAA 0.5_2mg.Γ1 + 香蕉汁50- 150 g.L—1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.L-1 + 花寶 I 號 0.5-1.5g.L-1 + 蔗糖 30g.L-1 + 活性炭 0.5-1.5g.Γ1 + 瓊脂 6.5g.Γ1 ；
生根培養(yǎng)基:1/3MS+ IBA 0.5-lmg.!/1 +NAA 0.5-lmg.!/1 + 馬鈴薯漿 50- 150 g *L_1+ 蔗糖 30g.Γ1 + 活性炭 0.5-2g.Γ1+ 瓊脂 6.5g.Γ1 ；
所述香蕉汁的制備方法為:將香蕉去皮后粉碎成泥狀；
所述馬鈴薯漿的制備方法為:將馬鈴薯去皮后粉碎成漿狀；
3)材料消毒處理:將采集 的野生金線蓮用自來水沖洗干凈，在距離芽點1-2厘米處剪取莖段，去除多余的葉片，置飽和漂白粉上清液中漂洗15min并用軟毛刷輕輕刷洗，沖洗干凈后，置于流水中沖滴0.5-1小時，再用雙蒸水沖洗2-3次，在超凈工作臺內(nèi)用75%的酒精消毒30s,加入0.lwt%HgCl2處理5-10min ;再用無菌水沖4_6遍后置工作臺備用。4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將消毒后的材料放在滅過菌的培養(yǎng)皿上，用手術(shù)刀切掉與升汞接觸的切口部分0.2-0.4cm，然后將材料切成l-2cm長的莖段分別接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23±2°C,光照時間12h/d,光照強(qiáng)度500-10001x,芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30天；得到叢生芽。5)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟4)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得到的叢生芽切開并剪成長度為1.5-2cm,分別接種在增殖培養(yǎng)基中；接種時將莖段平放在培養(yǎng)基上，經(jīng)過50-70d增殖培養(yǎng)，將增殖后的叢生芽切割為芽數(shù)為5-10個的莖段進(jìn)行為期50-70d的擴(kuò)大增殖培養(yǎng)；整個過程的培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度1500-20001x ；
6)誘導(dǎo)生根:將步驟5)增殖培養(yǎng)出來的幼苗單株切下，帶有2-3片葉子，株高l-2cm，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中；生根培養(yǎng)時間為30天，培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度 1500-20001x ；
7)瓶苗移栽:經(jīng)步驟6)誘導(dǎo)生根后，當(dāng)植株長至IOcm時，將試管苗放在自然光下煉苗3-5天后，再打開瓶蓋煉苗2-3天，然后從培養(yǎng)瓶中取出，洗去附著在根系的培養(yǎng)基，移入質(zhì)量比蛭石和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，溫度控制在15-30°C，濕度應(yīng)保持在70% -85%之間，避免陽光直射，透光率50%-60%。所述金線蓮為采集自福建省漳州南靖縣樹海森林的野生金線蓮。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是:采用本發(fā)明方法進(jìn)行，莖段經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)15 20天可萌發(fā)出帶白色絨毛生長鍵壯的新芽；選擇合適的培養(yǎng)基再經(jīng)過50-70天的增殖壯苗培養(yǎng)，擴(kuò)繁系數(shù)高；將高約3 -4cm健壯的無根苗分成單株，接種在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，I個月后即可生長成完整植株，有2-5cm的根長出，氣生根明顯，生根率可達(dá)99%，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程適時調(diào)整添加有機(jī)添加物，有機(jī)添加物用量50-150 g.Γ1，添加有機(jī)添加物的培養(yǎng)基對金線蓮苗產(chǎn)品品質(zhì)、成品苗品像產(chǎn)生直接影響，該方法培養(yǎng)增殖時間短、擴(kuò)繁系數(shù)高、一次性成苗、苗健康、金線蓮莖干植株粗大，根系發(fā)達(dá)，成活率高，葉片顏色深厚有明顯的絨布狀，葉脈金線明晰，每株重量達(dá)4.5-5.5克，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，可以提供大面積種植的優(yōu)良純化組培苗，解決現(xiàn)有技術(shù)中種子微小，胚發(fā)育不完全，在自然條件下極難出芽繁殖系數(shù)低等問題，應(yīng)用本發(fā)明在實施規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)上得到了進(jìn)一步突破，為金線蓮種資源的推廣和發(fā)展以及將其應(yīng)用于植物基因工程和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和完善具有重要意義。


圖1:芽誘導(dǎo)培養(yǎng)-莖段接種 圖2，叢生芽的生長
圖3，增殖培養(yǎng) 圖4，誘導(dǎo)生根 圖5，移栽金線蓮
具體實施例方式實施例1
1)取材:外植體材料采集自福建省漳州南靖縣樹海森林的野生金線蓮，
2)培養(yǎng)基的配制:
芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS +BA 2.0mg.L:+KT 0.5.mg.L:+NAA 0.5.mg.L 1 + 鹿糖 30g.L:+活性炭Ig.L—1+瓊脂6.5g.Γ1 ；
叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+BA 0.5mg.L 1 +KT 0.5mg.L 1 +NAA 0.5mg.L 1 + 鹿糖30g.Γ1 + 香蕉汁 100 g.L—1 + 蛋白胨 2.5g.Γ1 + 活性炭 Ig.Γ1 + 瓊脂 6.5g.Γ1 ；芽增殖培養(yǎng)基:1/2MS+BA 0.5mg.Γ1 +KT 0.5mg.L、NAA 0.5mg.Γ1 + 香蕉汁 100g.L—1 + 蛋白胨 2.5g.Γ1 + 花寶 I 號 1.5g.Γ1 + 蔗糖 30g.Γ1 + 活性炭 1.5g.Γ1 + 瓊脂 6.5g.L-1 ；
生根培養(yǎng)基:1/3MS+ IBA Img.Γ1 +NAA 0.5mg.Γ1 + 馬鈴薯漿 100 g.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1 + 活性炭 2g.Γ1+ 瓊脂 6.5g.Γ1 ；
香蕉汁的制備方法為:將香蕉去皮后粉碎成泥狀；
馬鈴薯漿的制備方法為:將馬鈴薯去皮后粉碎成漿狀；
3)材料消毒處理:將采集的野生金線蓮用自來水沖洗干凈并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男藜?，在距離芽點1-2厘米處剪取莖段，去除多余的葉片，置飽和漂白粉上清液中漂洗15min并用軟毛刷輕輕刷洗，沖洗干凈后，置于流水中沖滴I小時；雙蒸水沖洗3次，在超凈工作臺內(nèi)用75%的酒精消毒30s后倒 去酒精，加入0.1%升汞(HgCl2)處理lOmin，將汞液倒入廢汞瓶；用無菌水沖4遍后,置工作臺備用。4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):接種的材料放在滅過菌的培養(yǎng)皿上，用手術(shù)刀切掉與升汞接觸的切口部分0.2-0.4cm，然后將材料切成l-2cm長的莖段分別接種至分別接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；在直徑為10的培養(yǎng)瓶中，加入80-90ML的培養(yǎng)基，接種莖段5-10個；接入培養(yǎng)基10天后部分材料在根莖連接處的潛伏芽萌動膨大，培養(yǎng)15d可觀察乳白色主芽形成；這一階段所用的培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度500-10001X；培育30d后取出進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
6)增殖培養(yǎng):將經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)，所得到的生長良好的叢生芽切開并剪成長1.5-2 cm分別接種在增殖培養(yǎng)基中；接種時要將莖段平放在培養(yǎng)基上經(jīng)過50d增殖培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出大量叢生芽，每叢生芽約有5-10個芽，切割為芽數(shù)相等或相近的芽叢進(jìn)行70d的擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，整個過程的培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度1500-20001x ；
7)誘導(dǎo)生根:將增殖培養(yǎng)出來的幼苗單株切下，每株帶有2-3片葉子，株高l-2cm，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中；培養(yǎng)30d后，靠近培養(yǎng)基的每個節(jié)段上長出1- 2條，呈肉質(zhì)狀的氣生根扎入培養(yǎng)基，其上有細(xì)密、乳白色的根毛，根較短且不分支，有l(wèi)_2cm的根長出，生根率可達(dá)99 %，當(dāng)氣生根較明顯時完成金線蓮的植株再生及快速繁殖試管苗的培養(yǎng)生；這一階段所用的培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度1500-20001x;
8)瓶苗移栽:當(dāng)瓶苗長至3cm，2-3條根，4-5片葉子，葉長約2_3cm，從靠近培養(yǎng)基的每個節(jié)段上長出1- 2條，呈肉 質(zhì)狀的氣生根扎入培養(yǎng)基，其上有細(xì)密、乳白色的根毛，根較短且不分支，培養(yǎng)30d左右，植株長至IOcm時可進(jìn)行室外移栽，將試管苗放在自然光下煉苗3天，打開瓶蓋煉苗2天，然后從培養(yǎng)瓶中取出，洗去附著在根系的培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土(1:2)混合的基質(zhì)中，保濕遮陰，溫度控制在15-30°C，濕度應(yīng)保持在70% -85%之間，避免陽光直射透光率50%-60%。成活率可達(dá)99%以上。
權(quán)利要求
1.一種有機(jī)添加物對金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖關(guān)鍵技術(shù): 所述方法具體步驟包括: 1)取材:外植體材料為野生金線蓮；在春秋季節(jié)采摘，采摘后將其用濕布包好帶回實驗室備用； 2)培養(yǎng)基的配制:芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS +BA 0.5-2.0mg.L_1+KT 0.5_2mg.L、NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1+ 活性炭 l-2g.Γ1+ 瓊脂 6.5g.Γ1 ；叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.Γ1 +NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1 + 香蕉汁 50-150 g.Γ1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.Γ1 + 活性炭 l_2g.L-1 + 瓊脂6.5g.L 1 ；芽增殖培養(yǎng)基:1/2MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.L-1+NAA 0.5_2mg.Γ1 + 香蕉汁50- 150 g.L—1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.L-1 + 花寶 I 號 0.5-1.5g.L-1 + 蔗糖 30g.L-1 + 活性炭 0.5-1.5g.Γ1 + 瓊脂 6.5g.Γ1 ； 生根培養(yǎng)基:1/3MS+ IBA 0.5-lmg.!/1 +NAA 0.5-lmg.!/1 + 馬鈴薯漿 50- 150 g *L_1+ 蔗糖 30g.Γ1 + 活性炭 0.5-2g.Γ1+ 瓊脂 6.5g.Γ1 ； 所述香蕉汁的制備方法為:將香蕉去皮后粉碎成泥狀； 所述馬鈴薯漿的制備方法為:將馬鈴薯去皮后粉碎成漿狀； 3)材料消毒處理:將采集的野生金線蓮用自來水沖洗干凈，在距離芽點1-2厘米處剪取莖段，去除多余的葉片，置飽和漂白粉上清液中漂洗15min并用軟毛刷輕輕刷洗，沖洗干凈后，置于流水中沖滴0.5-1小時，再用雙蒸水沖洗2-3次，在超凈工作臺內(nèi)用75%的酒精消毒30s,加入0.lwt%HgCl2處理5-10min ;再用無菌水沖4_6遍后置工作臺備用； 4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將消毒后的材料放在滅過菌的培養(yǎng)皿上，用手術(shù)刀切掉與升汞接觸的切口部分0.2-0.4cm，然后將材料切成l-2cm長的莖段分別接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度500-10001x，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30天；得到叢生芽； 5)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟4)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得到的叢生芽切開并剪成長度為1.5-2cm，分別接種在增殖培養(yǎng)基中；接種時將莖段平放在培養(yǎng)基上，經(jīng)過50-70d增殖培養(yǎng)，將增殖后的叢生芽切割為芽數(shù)為5-10個的莖段進(jìn)行為期50-70d的擴(kuò)大增殖培養(yǎng)；整個過程的培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度1500-20001x ； 6)誘導(dǎo)生根:將經(jīng)步驟5)增殖培養(yǎng)出來的幼苗單株切下，帶有2-3片葉子，株高l-2cm,轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中；生根培養(yǎng)時間為30天，培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度 1500-20001x ； 7)瓶苗移栽:經(jīng)步驟6)誘導(dǎo)生根后，當(dāng)植株長至IOcm時，將試管苗放在自然光下煉苗3-5天后，再打開瓶蓋煉苗2-3天，然后從培養(yǎng)瓶中取出，洗去附著在根系的培養(yǎng)基，移入質(zhì)量比蛭石和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，溫度控制在15-28°C，濕度保持在70% -85%之間，避免陽光直射，透光率50%-60%。
2.一種有機(jī)添加物對金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖關(guān)鍵技術(shù)，其特征在于，所述金線蓮為采集自福建省漳州南靖縣樹海森林的野生金線蓮。
全文摘要
本發(fā)明提供一種金線蓮有機(jī)添加物對金線蓮產(chǎn)業(yè)化快速繁殖關(guān)鍵技術(shù)，屬于金線蓮的大量繁殖和培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明選取金線蓮頂芽、莖段為材料，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程適時調(diào)整添加有機(jī)添加物，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根后，即可生長成完整植株，生根率可達(dá)99%；再經(jīng)煉苗后，移栽到腐殖土中，成活率可達(dá)99%以上。該方法培養(yǎng)增殖時間短、擴(kuò)繁系數(shù)高、一次性成苗、苗健康、金線蓮莖干全植株粗大莖粗、根系發(fā)達(dá)、葉片顏色深厚有明顯的絨布狀，葉脈金線明晰，成活率高，每株重量達(dá)4.5-5.5克，具顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A01H4/00GK103190343SQ201310083379
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月16日
發(fā)明者何碧珠, 林蔚, 何官榕, 肖春梅 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)