用木聚糖酶補(bǔ)充的飼料組分的制作方法【專利摘要】一種用超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶補(bǔ)充的動(dòng)物飼料?！緦＠f明】用木聚糖酶補(bǔ)充的飼料組分【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及用超熱穩(wěn)定和超嗜熱木聚糖酶補(bǔ)充的動(dòng)物飼料。【
背景技術(shù)：
】[0002]木聚糖酶已用作飼料添加劑多年。事實(shí)上一些但不是全部木聚糖酶已顯示出提高動(dòng)物絕對(duì)體重增加(BWG)和供給飼料的飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)中的一者或二者。[0003]飼料中使用的木聚糖酶可例如允許營養(yǎng)學(xué)家降低飲食中的能量需求而不影響動(dòng)物的畜牧學(xué)表現(xiàn)。[0004]木聚糖酶增加生料(rawingredient)的可代謝或凈能量,從而增加飲食的總可代謝或凈能量含量。畜牧學(xué)表現(xiàn)可因此在不是很貴的飲食中保持有較少的原能量(rawenergy)(較低脂肪/油脂；較多纖維)。[0005]關(guān)系到木聚糖酶的使用的可能好處是更好地釋放飼料細(xì)胞壁內(nèi)捕集的(微)養(yǎng)分。此類捕集是由于對(duì)動(dòng)物消化有抵抗的非淀粉多糖的存在。[0006]為了起作用，用作飼料添加劑的木聚糖酶應(yīng)在接近于動(dòng)物胃腸道發(fā)現(xiàn)的條件的pH和溫度下是穩(wěn)定的和活性的。[0007]W095/29997描述了熱穩(wěn)定木聚糖酶并提及它們包含在動(dòng)物飼料中。熱穩(wěn)定性被定義為在95°C有一分鐘抵抗力，結(jié)合隨后在40°C下水解小麥阿拉伯木聚糖(阿糖基木聚糖)溶液的能力。然而，五分鐘的加熱處理之后，公開的木聚糖酶明顯失去其活性。[0008]許多種類和菌種的棲熱袍菌(Thermotoga)已被描述來生產(chǎn)一種或更多超嗜熱和熱穩(wěn)定的木聚糖內(nèi)切酶。喜溫海洋桿菌(Thermotogamaritima)產(chǎn)生兩種熱穩(wěn)定木聚糖內(nèi)切酶，命名為XynA和XynB。XynA和XynB存在為具有約120和40kDa表觀分子量的蛋白質(zhì)。最適pH(XynA和XynB分別為ρΗ6.2和ρΗ5.4)下最大活性對(duì)于XynA在約92°C且對(duì)于XynB在約105°C測(cè)得(WinterhalterandLiebl,1995,App1.Env.Microbiol.,61,1810-1815)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0009]本發(fā)明第一方面是用包含超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的組分(composition)補(bǔ)充的動(dòng)物飼料。[0010]優(yōu)選地,在所述組分中存在的木聚糖降解(xylanolytic)活性的最適(optimum)溫度高于80°C，更優(yōu)選高于85°C，還更優(yōu)選高于90°C。[0011]優(yōu)選地，存在于這種組分中的木聚糖降解活性在最適溫度與在40°C下的活性比率(活性比值，ratioofactivity)高于10,更優(yōu)選高于20。[0012]有利的是，存在于這種組分中的超過70%的木聚糖降解活性對(duì)90°C下加熱30分鐘有抵抗力。[0013]更優(yōu)選地，超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶與選自由以下組成的組的木聚糖酶具有超過80%的同一性和/或超過90%的相似性:SEQ.1D.NO:KSEQ.1D.NO:2,SEQ.1D.NO:3,SEQ.1D.NO:4、SEQ.1D.NO:5，SEQ.1D.NO:1、SEQ.1D.NO:2、SEQ.1D.NO:3、SEQ.1D.NO:4和SEQ.ID.NO:5的氨基酸21-332且可能地該動(dòng)物飼料包括0.08至40mg/kg之間的所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定(純)木聚糖酶。[0014]可能地該動(dòng)物飼料為液體且優(yōu)選并包括0.08至40mg/l之間的超嗜熱和超熱穩(wěn)定(純)木聚糖酶。[0015]可替換地，該動(dòng)物飼料選自由青忙(青忙飼料，silage)、顆粒飼料和粉狀飼料(mashfeed)組成的組。[0016]優(yōu)選地，動(dòng)物飼料包括至少50%(干重)植物材料，其更優(yōu)選選自由谷物、豆類(豆類植物，legumes)、甜菜糖蜜(beetmolasse)、馬鈴薯禮:(potatopulps)和花生餅粉(peanutmeal)組成的組。[0017]優(yōu)選地，動(dòng)物飼料包括至少5%(干重)蛋白質(zhì)和/或至少2%(干重)脂肪。[0018]相關(guān)方面是動(dòng)物飼料，其包括0.08至40mg/kg(干重)之間的多肽，該多肽與選自由以下組成的組的多肽具有超過80%的同一性和/或超過90%的相似性:SEQ.1D.NO:1、SEQ.1D.NO:2,SEQ.1D.NO:3,SEQ.1D.NO:4,SEQ.1D.NO:5，SEQ.1D.NO:USEQ.1D.NO:2,SEQ.1D.NO:3,SEQ.1D.NO:4和SEQ.1D.NO:5的氨基酸21-332。[0019]另一相關(guān)方面是動(dòng)物飼料用于在動(dòng)物中提高體重增加(bodyweightgain)和/或飼料轉(zhuǎn)化率(feedconversionratio)的(非治療)應(yīng)用，優(yōu)選非反芻脊椎動(dòng)物或甲殼類動(dòng)物(crustacean)且更優(yōu)選魚、豬或家禽。[0020]另一個(gè)相關(guān)方面是動(dòng)物飼料的生產(chǎn)方法，其包括以下步驟:[0021]a)選擇包含半纖維素的飼料:[0022]b)添加包含超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的組分。[0023]優(yōu)選地，存在于該方法步驟b)所添加的組分中的超過70%的木聚糖降解活性對(duì)在90°C加熱所述組分30分鐘有抵抗力和/或存在于這種組分中的木聚糖降解活性的最適溫度高于80°C(優(yōu)選高于85°C，更優(yōu)選高于90°C)。【具體實(shí)施方式】[0024]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)將超嗜熱(和超熱穩(wěn)定)木聚糖酶添加到飼料中，結(jié)果提高了動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率。[0025]雖然超嗜熱木聚糖(內(nèi)切)酶的最適工作溫度比動(dòng)物的腸道溫度高得多，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這些酶提高體重增加和/或飼料轉(zhuǎn)化率，甚至與通常使用的飼料木聚糖(內(nèi)切)酶相比也是如此。更具體地，發(fā)明人甚至已發(fā)現(xiàn)超嗜熱(和超熱穩(wěn)定)的木聚糖酶比嗜熱(和熱穩(wěn)定)的木聚糖酶顯示更好的結(jié)果。[0026]在動(dòng)物用補(bǔ)充超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的粉狀飼料喂養(yǎng)的情況中，對(duì)比用非補(bǔ)充粉狀飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物和用已補(bǔ)充主要在37-50°C具有活性的木聚糖酶的粉狀飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物，動(dòng)物絕對(duì)體重增加(BWG)和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)均被提高。[0027]FCR是指動(dòng)物消耗的飼料量相對(duì)于其重量增加之間的比率。較低的FCR率表示較高的飼料利用效率。[0028]在使用超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的情況下這些結(jié)果與在37°C測(cè)量的極低的木聚糖降解活性形成對(duì)比。[0029]本發(fā)明第一方面是用(和/或包括)包含超嗜熱(即，(總)木聚糖降解活性的最適溫度高于80°C，優(yōu)選高于90°C或95°C和/或在最適溫度和40°C時(shí)的活性比率高于10或甚至高于15或20)和超熱穩(wěn)定木聚糖酶(即，該組分的(總)木聚糖降解活性對(duì)熱失活(變性)非常有抵抗力，如超過70%的活性抵抗在90°C加熱30分鐘在油浴中含有木聚糖酶的添加劑)補(bǔ)充的飼料(動(dòng)物飼料)。[0030]飼料可包括0.08mg/kg飼料和40mg/kg飼料之間的超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶，更優(yōu)選在0.2mg/kg飼料和20mg/kg飼料之間，還更優(yōu)選在0.4mg/kg飼料和16mg/kg飼料之間的(純)酶。[0031]優(yōu)選地，飼料包括10DXU/kg飼料和5000DXU/kg飼料之間的超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶，更優(yōu)選在25DXU/kg飼料和2500DXU/kg飼料之間，還更優(yōu)選在50DXU/kg飼料和2000DXU/kg飼料之間。[0032]在本發(fā)明上下文中，除非明確提及其他值，一個(gè)單位的木聚糖酶(DXU)被定義為每分鐘從PH6且70°C的3%樺木木糖溶液釋放I微摩爾還原糖(表示為木聚糖)需要的酶量。[0033]相關(guān)方面是包含超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的飼料添加劑(動(dòng)物飼料添加劑)。[0034]在本發(fā)明上下文中，“超熱穩(wěn)定木聚糖酶”是指一種木聚糖酶，其中超過70%的(總)木聚糖降解活性(存在于該組分中)對(duì)90°C加熱(該組分)30分鐘有抵抗力(能夠抵抗和/或能夠在以后保持)。術(shù)語“總木聚糖降解活性”是指添加到動(dòng)物飼料的超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的木聚糖降解活性，且還指不太優(yōu)選存在于組分中的其他(污染物)木聚糖酶的活性，如在本發(fā)明中所公開的。[0035]優(yōu)選地，至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99或甚至直到100%的存在于該詞料中和/或在該詞料添加劑中的(總)木聚糖降解活性能夠在30分鐘(或45分鐘或I小時(shí))90°C(或95°C)加熱(該飼料和/或該飼料添加劑)后得到保持。[0036]優(yōu)選地，存在于添加到本發(fā)明飼料的組分中的(總)木聚糖降解活性的最適溫度(溫度最適條件)高于80°C，更優(yōu)選高于85°C、90°C，或甚至高于95°C。[0037]優(yōu)選地，存在于添加到本發(fā)明飼料(包括超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶)的組分中的(總)木聚糖降解活性在最適溫度(如，801:、851:、901:、951:、或甚至約100°C)和在40°C(或37°C)下的活性比率高于10，更優(yōu)選高于20。[0038]在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“具有木聚糖降解活性的酶”、“木聚糖內(nèi)切酶”、或“木聚糖酶”是指能夠水解含木糖的多糖中連接木糖殘基的內(nèi)部糖基鍵的酶(例如重組的、至少部分純化的木聚糖酶或，次優(yōu)選地，酶的混合物)。此類糖基鍵可為例如此類多糖的β-D-吡喃木糖基-1，4-β-D吡喃木糖基單元中的β-1,4-糖基鍵。[0039]具有木聚糖降解活性的優(yōu)選的酶為木聚糖內(nèi)切酶(EC.3.2.1.8.)。[0040]具有木聚糖降解活性的優(yōu)選的酶是來自糖苷水解酶家族10的木聚糖內(nèi)切酶。[0041]具有木聚糖降解活性(超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶)的最優(yōu)選的酶有喜溫海洋桿菌菌種衍生的酶,且還更優(yōu)選XynB(SEQ.1D.NO:1)或其接近的變體(closevariant)(如SEQ.1D.NO:2-5)，或包括相同序列(SEQ.1D.NO:1-5)最保守區(qū)域，優(yōu)選其中該最保守區(qū)域包含糖苷水解酶家族10木聚糖酶基序(糖苷水解酶家族10木聚糖酶基序的保守部分跨越SEQ.1D.NO:1-5的21-332區(qū)域，或從這些SEQ.1D.NO:1-5的氨基酸21到末尾氨基酸344、346或347)或與這些SEQ.1D.NO:1-5或這些SEQ.1D.NO:1-5的21-332區(qū)域(或21到末尾氨基酸344、346或347)共享顯著的同一性(或相似性)。添加的具有木聚糖降解活性(超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶)的酶還可為包含SEQ.1D.NO:1-5的融合蛋白或包含與這些SEQ.1D.NO:1-5或與這些SEQ.1D.NO:1-5的21-332區(qū)域共享顯著同一性(或相似性)肽的融合蛋白。[0042]“顯著同一性”在本發(fā)明上下文中是指至少75%同一性，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至至少99%。優(yōu)選地，同一性越過(列舉)序列(或片段)的全長測(cè)量，如越過SEQ.1D.NO:1-5的全長或越過由SEQ.1D.NO:1-5的氨基酸21-332(或氨基酸21到末尾氨基酸)組成的肽的全長?！帮@著相似性”在本發(fā)明上下文中是指至少85%相似性，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至至少99%。優(yōu)選地，相似性越過(列舉)序列(或片段)的全長測(cè)量，如越過SEQ.1D.NO:1-5的全長或越過由SEQ.1D.NO:1-5的氨基酸21-332(或氨基酸21到末尾氨基酸)組成的肽的全長。[0043]兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)系用參數(shù)“同一性”或“相似性”描述。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間的相似(或同一)度如W02010/0142697中使用如在EMBOSS程序包的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法確定,優(yōu)選版本3.0.0或更新的。使用的可選參數(shù)為10的空格罰分(gapopenpenalty),0.5的擴(kuò)展罰分(gapextensionpenalty)，和EBL0SUM62(EBL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記“最長同一性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的Needle輸出被用作百分比同一性且如下計(jì)算:(相同殘基X100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中缺口總數(shù))。標(biāo)記“最長相似性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的Needle輸出被用作百分比相似性且如下計(jì)算:(相似殘基X100)/(比對(duì)長度-比對(duì)中缺口總數(shù))。[0044]在制備飼料過程中木聚糖酶(和/或包含超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶的組分)被有利地作為固體制劑如粉狀或顆粒或作為液體添加。[0045]?；幚硗ǔ０ㄔ诟邷叵碌牟襟E，如蒸汽噴射。[0046]相反，可不使用加熱步驟(如，超過50°C)生產(chǎn)動(dòng)物飼料，例如對(duì)于不?；娘暳?。[0047]本發(fā)明的相關(guān)方面是(動(dòng)物)飼料(和/或(飼料)預(yù)混合料)，其包括每kg0.08mg至400mg之間(優(yōu)選在0.2mg/kg至40mg/kg之間，更優(yōu)選在0.4mg/kg至20mg/kg之間)的多肽,該多肽與選自由SEQ.1D.NO:KSEQ.1D.NO:2,SEQ.1D.NO:3,SEQ.1D.N0:4、SEQ.1D.NO:5,SEQ.1D.NO:USEQ.1D.NO:2,SEQ.1D.NO:3,SEQ.1D.NO:4和SEQ.1D.NO:5的氨基酸21-332(或從氨基酸21到末尾氨基酸344、346或347)組成的組的多肽具有超過75%(優(yōu)選超過80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%)的同一性(或相似性)，所述多肽優(yōu)選為超熱穩(wěn)定的并優(yōu)選具有超嗜熱木聚糖酶活性。[0048]優(yōu)選地，本發(fā)明的(動(dòng)物)飼料包括至少50%(干重)的植物材料，最優(yōu)選至少55%或甚至至少60%。[0049]優(yōu)選地，該植物材料選自由谷物、豆類植物、甜菜糖蜜、馬鈴薯渣和花生餅粉組成的組，且還可包括如谷物和豆類植物的混合物。[0050]優(yōu)選地(或此外)，本發(fā)明的飼料(包括至少50%植物材料)包括至少5%(干重)蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少10%、至少15%或甚至至少20%蛋白質(zhì)。[0051]優(yōu)選地(或此外)，本發(fā)明的飼料(包括至少50%植物材料和/或至少5%蛋白質(zhì))包括至少2%(干重)脂肪，更優(yōu)選至少5%或甚至至少8%脂肪。[0052]優(yōu)選地，本發(fā)明的飼料選自由青貯、顆粒飼料和粉狀飼料組成的組。[0053]本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)方面是用超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶(和/或使用本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑，和/或使用本發(fā)明的超嗜熱和超熱穩(wěn)定木聚糖酶)補(bǔ)充的飼料(和/或使用(飼料)預(yù)混合料和/或使用飼料添加劑)用于提高體重增加和/或(生長的)動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率(且最優(yōu)選不用于生產(chǎn)過度病態(tài)的重量增加)的(非治療)應(yīng)用。[0054]用于(非治療)提高體重給增加(BWG)和/或(生長的)動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的優(yōu)選的(超嗜熱和超熱穩(wěn)定)木聚糖酶具有超過70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至高過99%的(總)木聚糖降解活性，該活性對(duì)90°C(或95°C)加熱I小時(shí)有抵抗力。[0055]可替換地，或此外，用于(非治療)提高體重給增加(BWG)和/或(生長的)動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的優(yōu)選的(超嗜熱和超熱穩(wěn)定)木聚糖酶來自糖苷水解酶家族10(glycosidehydrolasesFamilylO)。[0056]用于(非治療)提高體重增加(BWG)和/或(生長的)動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)的最優(yōu)選的木聚糖酶來自棲熱袍菌(Thermotoga),且仍優(yōu)選與SEQ.1D.NO:1-5或與SEQ.1D.NO:1-5的21-332片段共享顯著同源性(相似性)，或包含與SEQ.1D.NO:1-5的21-332片段共享顯著同源性(相似性)的多肽(如融合蛋白)。[0057]在本發(fā)明上下文中，“動(dòng)物”優(yōu)選是指非人類動(dòng)物和/或不具有(明顯)病理(病狀)和/或不具有與重量不足(weightdeficit)相關(guān)的病理的動(dòng)物。[0058]本發(fā)明的動(dòng)物優(yōu)選為非反芻動(dòng)物和/或?yàn)閱挝竸?dòng)物(mono-gastricanimal)。[0059]更優(yōu)選地，動(dòng)物選自由豬、家禽、魚和甲殼類動(dòng)物組成的組，還更優(yōu)選的是豬和/或家禽。[0060]酶的來源和制各[0061]棲熱袍菌的許多物種和菌株已被描述用來生產(chǎn)一種或更多超嗜熱和熱穩(wěn)定木聚糖內(nèi)切酶。喜溫海洋桿菌產(chǎn)生兩種熱穩(wěn)定木聚糖內(nèi)切酶，命名為XynA和XynB。XynA和XynB存在為具有約120和40kDa表觀分子量的蛋白質(zhì)。最適pH(XynA和XynB分別為pH6.2和pH5.4)下最大活性對(duì)于XynA在約92°C且對(duì)于XynB在約105°C測(cè)得(WinterhalterandLiebl,1995，App1.Env.Microbiol.，61，1810-1815)。冊(cè)93/1917描述了從喜溫海洋桿菌、新阿波羅棲熱袍菌和溫泉棲熱袍菌(T.thermarum)獲得木聚糖酶的過程。[0062]已公開來自棲熱袍菌木聚糖酶的許多菌株和物種的木聚糖內(nèi)切酶的DNA和蛋白質(zhì)序列。這些木聚糖酶可通過與喜溫海洋桿菌XynA和XynB的序列同源性分為兩種類型。[0063]沒有任何文獻(xiàn)描述了使用分離的棲熱袍菌木聚糖酶如XynB作為飼料添加劑，至少?zèng)]有任何文獻(xiàn)公開非常高的溫度最適條件和在40°C幾乎無活性。[0064]木聚糖酶可從不同來源獲得。木聚糖酶在適合的培養(yǎng)基中已生長選擇的棲熱袍菌菌株后可被分離/純化。[0065]木聚糖酶可通過培養(yǎng)表達(dá)編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)(如，XynB)的基因的重組菌株獲得。[0066]合適的基因可在編碼來自棲熱袍菌RQ2(GenBank:ACB09229.1)的內(nèi)切-1,4_β-木聚糖酶、來自ThermotoganaphthophilaRKU-10(GenBank:ADA66795.1)的內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶、來自那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoganeapolitana)(GenBank:CAA90235.1)的木聚糖酶、來自棲熱袍菌FjSS2_B.1(GenBank:AAA90913.1)的內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶、或來自喜溫海洋桿菌MSB8(GenBank:AAD35164.1-圖1-SEQIDN01)的內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶B的基因中選擇。[0067]此外，顯示活性(熱活性)和熱穩(wěn)定性在上述范圍內(nèi)的最適溫度的這些酶的變體可通過修改這些基因的編碼序列獲得。[0068]序列修改可包括但不限于氨基酸取代(替換)、缺失和/或插入。優(yōu)選的序列修改是保守的取代(如，BLASTp分析后標(biāo)記為陽性)。[0069]優(yōu)選變體酶(variantenzyme)與喜溫海洋桿菌MSB8XynB具有至少80%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，或與喜溫海洋桿菌MSB8XynB具有至少90%氨基酸序列相似性，更優(yōu)選至少93%、94%、95%，甚至更優(yōu)選至少98%。[0070]重組木聚糖酶可在任何合適的宿主生物體中表達(dá)。特別適合的宿主是細(xì)菌、酵母和真菌。優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌和桿菌(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、…)或鏈霉菌(天藍(lán)色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、…)的菌株。[0071]優(yōu)選的酵母宿主是釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)或解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)的菌株。優(yōu)選的真菌宿主是曲霉(構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、…)、青霉和木霉的囷株。[0072]木聚糖酶可進(jìn)一步以表達(dá)相應(yīng)酶的轉(zhuǎn)基因植物和/或種子的形式或從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得。[0073]木聚糖酶可通過在用于木聚糖酶的生長和表達(dá)的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)棲熱袍菌或重組微生物菌種制備。優(yōu)選菌種在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。[0074]培養(yǎng)后，木聚糖酶可作為培養(yǎng)上清液或細(xì)胞提取物回收。上清液或細(xì)胞提取物優(yōu)選被進(jìn)一步純化以獲得半純化或純化制劑。合適的純化方法包括但不限于離心、微孔過濾、超過濾、沉淀、色譜法、…。[0075]木聚糖酶可以液體或干燥(粉末)制劑提供。液體制劑優(yōu)選通過添加合適的組分如鹽(NaCl)或甘油穩(wěn)定。粉末制劑可例如通過噴霧干燥或冷凍干燥獲得。木聚糖酶可被涂覆(coat)。[0076]酶活性確定[0077]許多方法可用來確定液體制劑中木聚糖內(nèi)切酶的酶活性。特別合適的是使用木聚糖內(nèi)切酶水解作為底物的木聚糖的方法。水解反應(yīng)釋放還原性糖，通過與二硝基水楊酸(DNS)反應(yīng)導(dǎo)致典型顏色顯現(xiàn)。色彩強(qiáng)度在570nm處直接與樣品中的木聚糖酶活性成比例，條件是底物濃度保持充足(即，降解不超過10%和/或在測(cè)試中保持底物的飽和濃度)。[0078]木聚糖酶的一個(gè)DXU被定義為每分鐘從3%(ff:V)樺木木聚糖溶液且在pH670°C的IOOmM檸檬酸磷酸緩沖液中釋放I微摩爾還原性糖(如木糖等價(jià)物)的酶量。反應(yīng)在0.8ml(0.7ml底物+0.1ml稀釋的木聚糖酶)體積中進(jìn)行15分鐘。溫育后，反應(yīng)通過加入ImlDNS試劑(組分:Na0H400mM，3，5-二硝基水楊酸40mM，酒石酸鉀鈉1M)終止?；旌衔镫S后在95°C保持15分鐘，接著冷卻到25°C5分鐘。最后，在570nm相對(duì)于對(duì)照測(cè)定吸光度。[0079]為了根據(jù)還原性糖的生成評(píng)定木聚糖酶活性(DXU/ml)，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用代替酶稀釋制劑的木糖制備。所有底物溫育和隨后的測(cè)量一式三份地進(jìn)行。[0080]木聚糖內(nèi)切酶最適活性溫度&熱穩(wěn)定性確定[0081]木聚糖酶活性的溫度依賴性使用上述二硝基水楊酸(DNS)還原性糖方法的變型進(jìn)行分析。DNS法在酶/底物混合物上在20至100°C溫度范圍內(nèi)的油浴中溫育進(jìn)行。該方法的所有其他參數(shù)保持不變。[0082]溫度穩(wěn)定性通過在50至100°C溫度范圍的浴中通過預(yù)溫育酶制劑來監(jiān)控。樣品在0、10、30、60(和90)分鐘后取得并在冰浴中冷卻10分鐘。殘留活性用上述方法一式三份地測(cè)定。[0083]飼料鉬分[0084]動(dòng)物飼料(包括青貯飼料)可包括谷物，如小麥、大麥、黑麥(裸麥，rye)、玉米、稻米、高粱、斯佩耳特小麥(spelt)、黑小麥或燕麥，或谷物副產(chǎn)品如麥麩、大麥稿桿、玉米穗軸、燕麥粉(oatmilling)、粗小麥粉(wheatmiddling)、小麥麩質(zhì)飼料(wheatglutenfeed)、稻米胚芽、或玉米糠，或其他植物材料如大豆或其他豆類、油菜籽、羽扇豆、豌豆、木薯粉、甜菜糖蜜、馬鈴薯渣、花生餅粉。優(yōu)選的谷物是小麥、大麥和黑麥。[0085]優(yōu)選地，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組分包含至少一種植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源。植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源的實(shí)例為大豆，和谷物，如大麥、玉米、燕麥、稻米、黑麥、高粱和小麥。[0086]本發(fā)明的動(dòng)物飼料組分有利地包含0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40%大豆粉；和/或0-10%魚粉；和/或0-20%乳清。[0087]本發(fā)明的動(dòng)物飼料組分(組合物)有利地包含額外的飼料成分或添加劑如酶、益生元(prebiotics)、有益菌種(probiotics)、礦物質(zhì)和微量元素、維生素和維生素原、植物(vegetable，蔬菜)、微生物或動(dòng)物蛋白、氨基酸、它們的鹽和類似物、淀粉、纖維、碳水化合物和糖或甜味劑、油和油柏粉、植物或動(dòng)物脂肪、染料或其他著色劑、乳化和穩(wěn)定劑、增稠和膠凝劑、粘結(jié)劑、防結(jié)塊劑和凝結(jié)劑、防腐劑、酸度調(diào)節(jié)劑、類胡蘿卜素和葉黃素、脲及其衍生物、消化性增強(qiáng)劑、腸道菌群穩(wěn)定劑、球蟲抑制劑和其他藥物。[0088]優(yōu)選的額外的酶選自由肌醇六磷酸酶(phytase)、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果膠酶、半纖維素酶和(不太優(yōu)選的)(其他)木聚糖酶組成的組。[0089]優(yōu)選的礦物質(zhì)選自由鹽(氯化物、硫酸鹽、氟化物、碳酸鹽、氧化物、…)、鈣、磷、鎂、鉀、鈉、猛、鋅、鎳、鑰、銅、鐵、硒、鈷和碘組成的組。[0090]優(yōu)選的維生素選自由維生素A、胡蘿卜素、抗壞血酸、維生素D、D3、E、K、B1硫胺(維生素bl)、B6吡哆醇(維生素b6)、生物素、膽堿、葉酸、煙酸、泛酸、B2核黃酸(維生素b2)、氰鈷維生素(氰鈷胺)、…組成的組。[0091]合適的蛋白質(zhì)選自植物、微生物或動(dòng)物蛋白組成的組。[0092]合適的氨基酸選自由蛋氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、苯基丙氨酸、絡(luò)氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸組成的組。[0093]合適的微生物屬于但不限于曲霉屬、桿菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、酵母屬、鏈球菌屬。[0094]其他可能添加劑可被使用，且可例如在依照條例(EC)N。1831/2003附錄3a&4_附件:添加劑目錄，和其更新材料的歐盟飼料添加劑注冊(cè)表(CommunityRegisterofFeedAdditives)中發(fā)現(xiàn)。[0095]飼料加工(牛產(chǎn))[0096]動(dòng)物飲食可被加工為粉狀飼料(非顆粒)或顆粒飼料。通常，混合碾碎的飼料原料(feed-stuff)并根據(jù)考慮動(dòng)物種類的說明書添加足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。[0097]本發(fā)明的組分可以固體或液體酶配方(制劑，formulation)的形式,或以飼料添加劑的形式，如預(yù)混合料(premix)添加。[0098]固體組分通常在混合步驟前或混合步驟過程中加入；且液體組分通常在?；襟E后加入。[0099]然而，超熱穩(wěn)定和超熱活性液體酶組分還可在?；襟E前加入。[0100]飼料中本發(fā)明木聚糖酶的劑量可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的試差法優(yōu)化。不同木聚糖酶可具有不同的最適劑量范圍?！緦＠綀D】【附圖說明】[0101]圖1示出來自喜溫海洋桿菌MSB8的木聚糖酶XynB的氨基酸序列。信號(hào)肽有下劃線。[0102]圖2示出連續(xù)純化步驟后回收的考馬斯藍(lán)染色的木聚糖內(nèi)切酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠。圖2a=XynAANC;圖2b=XynB0[0103]圖3示出溫度對(duì)木聚糖內(nèi)切酶XynAΔNC和XynB活性的影響。最大活性已被設(shè)定為100%。[0104]圖4示出預(yù)溫育后在不同溫度木聚糖內(nèi)切酶的殘留活性。[0105]實(shí)施例_6]實(shí)施例1:棲熱袍菌木聚糖內(nèi)切酶的制備[0107]來自喜溫海洋桿菌的木聚糖酶XynA和XynB的催化區(qū)(催化域)的克隆[0108]根據(jù)公開的棲熱袍菌xynA(GenBank/GenPept?編號(hào)Z46264)和xynB(GenBank/GenPept?編號(hào)AAD35164)的基因序列，全部xynB基因和對(duì)應(yīng)于xynA基因(xynAANC)的催化區(qū)的DNA片段按照經(jīng)典程序從喜溫海洋桿菌MSB8(DSM3109/ATCC43589)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[0109]PCR產(chǎn)品使用供應(yīng)商推薦的程序被克隆至pGEM-T載體系統(tǒng)I(Promega)中，并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a?超感受態(tài)細(xì)胞。藍(lán)白篩選允許選擇攜帶PCR片段的白色菌落。純化的質(zhì)粒制劑(Nucleospin質(zhì)粒，Macherey-Nagel)在ALFDNA測(cè)序器(PharmaciaBiotech)上測(cè)序。插入片段的測(cè)序使用通用引物T7和RP以及對(duì)應(yīng)于內(nèi)部DNA序列的引物進(jìn)行。獲得的序列與公開的序列(xynAGenBank/GenP印t?編號(hào)為Z46264且xynB編號(hào)為AAD35164)相同。[0110]對(duì)應(yīng)于組件型(modular)XynA(XynAANC)衍生的催化區(qū)的DNA片段和完整xynB基因被亞克隆到pET22b(+)克隆載體(Novagen)中。得到的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Stratagene)。重組菌株的溫育和來自喜溫海洋桿菌的木聚糖酶XynAΛNC和XynB的生產(chǎn)[0111]15ml攜帶木聚糖酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞的5小時(shí)預(yù)培養(yǎng)物(37°C)在IOOOOg離心I分鐘且顆粒再懸浮在含有200μg/ml氨節(jié)青霉素的900mlTerrific肉湯(12g/L胰化蛋白胨(Difco)，24g/L酵母提取物(Difco)，4ml/l甘油，12.54g/lK2HPO4,2.31g/lKH2PO4)的3升搖瓶中。在37°C和250rpm溫育培養(yǎng)物直到550nm處吸光度達(dá)到3&4之間，之后用ImM異丙基-1-硫代-β-吡喃半乳糖苷來誘導(dǎo)酶的表達(dá)。[0112]在37°C溫育15小時(shí)后通過以下方式收獲細(xì)胞:在4°C18000g離心30分鐘，再懸浮在含有IOmMNaCl的50mMBICINE中，在預(yù)冷細(xì)胞破碎儀((ConstantSystemsLtd.,Warwick，英國)中在28Kpsi破碎并在40，OOOg離心30分鐘。從粗制細(xì)胞裂解液中通過用0.2%硫酸魚精蛋白(Calbiochem)處理并在40，OOOg離心30分鐘除去染色體DNA。接著將25個(gè)單位的核酸酶(benzonase)(Merck,Darmstadt,德國)加入到溶液中。[0113]重組木聚糖酶XynAΔNC和XynB的回收[0114]在大腸桿菌中表達(dá)的來自喜溫海洋桿菌的XynAΛNC和XynB的粗制酶制劑已通過在Proflux系統(tǒng)(Millipore)UF聚醚砜Biomax膜(截止點(diǎn)=5kDa)上再循環(huán)液體制劑通過超過濾加以濃縮。濃縮的酶溶液在無菌過濾系統(tǒng)上過濾，包括具有不同截止點(diǎn)的許多步驟和最后的絕對(duì)過濾器(截止點(diǎn)=0.22μΜ)(Millipore)。[0115]濃縮的液體酶使用在此處其被噴在載體(小麥粉)上的流體床干燥Procell實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)(Glatt)干燥，提供低塵顆粒酶制劑。[0116]重組木聚糖酶XynAΔNC和XynB的純化[0117]XynAΔNC使用三步驟過程純化。粗制提取物用色譜緩沖液(Tris-HC120mMpH8.0)透析2500X并裝載到QHPXK16/20(GEHealthcare)上，該QHPXK16/20為強(qiáng)陰離子交換柱，并用線性梯度(O-1MNaCl)洗提。接著半純化的制劑用色譜緩沖液(Tris-HC120mMpH8.0)透析2500X并裝載至IjSephacrylS_100HR120mlXK16/70(GEHealthcare)，該SephacrylS-100HR120mlXK16/70為尺寸排阻色譜柱。匯集活性流分，用色譜緩沖液(Tris-HC120mMpH8.0)透析2500X并裝載到Mono-QGL5/50(GEHealthcare)上，該Mono-QGL5/50為強(qiáng)陰離子交換柱，并用線性梯度(O-1MNaCl)洗提。匯集純化的流分且其純度已在SDS-PAGE(圖2a)上檢查。[0118]XynB使用兩步驟過程純化。大部分宿主蛋白通過熱處理酶制劑(30分鐘75°C)并隨后離心(12000Xg4°C)而除去。上清液用色譜緩沖液(BiS-TriS20mMpH6.2)透析2500X,裝載在Q-SepharoseFF(GEHealthcare)離子交換柱上并用線性梯度(0-1MNaCl)洗提。重組木聚糖酶的純度已在SDS-PAGE(圖2b)上檢查。[0119]重組酶的表征[0120]XynAΔNC和XynB的木聚糖酶活性在不同溫度使用上述測(cè)試條件確定。最大活性分別為70°C和90-95°C(圖3)。[0121]重組酶的穩(wěn)定性使用上述程序評(píng)估。結(jié)果(圖4)顯示XynAANC在60°C溫育60分鐘后保持其活性的30%。XynB在90°C溫育60分鐘后保持其活性的100%。[0122]實(shí)施例2:動(dòng)物飼料中喜溫海洋桿菌木聚糖酶(XynAΛNC和XynB)的使用[0123]試驗(yàn)使用雄性或雌性肉雞(broiler)(Belgabroed)進(jìn)行。年齡從I到42天,它們關(guān)在地面雞圈中并提供補(bǔ)充或沒有補(bǔ)充外源木聚糖酶的市售的肉雞飼料。年齡I天時(shí)，動(dòng)物(768只禽類-384只雄性/384只雌性)隨機(jī)分散在24個(gè)32只禽類/雞圈，0.8m3/雞圈的雞圈(4種治療X2種性別X3次重復(fù))。年齡14天時(shí)，動(dòng)物分配到48個(gè)16只禽類的雞圈(4種治療X2種性別X6次重復(fù))。每個(gè)雞圈提供有2個(gè)飲水噴頭和I個(gè)飼料盤。溫度開始時(shí)是35°C，接著每天降低0.5°C;22天時(shí)，溫度保持在22°C。光照方案為第一周期23小時(shí)30分鐘光照和30分鐘黑暗，且第二周期18小時(shí)光照和6小時(shí)黑暗。禽類在第I天接種雞新城疫病(Newcastledisease)疫苗(在孵化室)并在第14天接種甘保羅(Gumboro)+雞新城疫病疫苗(通過飲用水)。[0124]本試驗(yàn)包括四種治療。對(duì)基于小麥的飲食(表1)，不加入酶(對(duì)照)，或以推薦劑量10UI/kg飼料(陽性對(duì)照)補(bǔ)充的等于500DXU的喜溫海洋桿菌XynAANC/kg飼料的量或等于400DXU的喜溫海洋桿菌XynB/kg飼料的量或枯草芽孢桿菌木聚糖酶(從Beldem-Puratos的一個(gè)部門，Groot-Bijgaarden,比利時(shí)購買的Belfeed?Bl100MP(E1606)內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶)。[0125]發(fā)明人比較了不同水平的陽性對(duì)照(市售木聚糖酶Belfeed),如50UI/kg飼料,并發(fā)現(xiàn)在10UI/kg飼料處兩個(gè)參數(shù)(BWG和FCR)達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)(plateau)。因此發(fā)明人將這個(gè)量用于陽性控制。[0126]酶作為液體(XynAΔNC和XynB)或粉末(Belfeed)在將其混合進(jìn)飲食之前并入預(yù)混合料中從而添加到飼料中。飲食以粉狀的形式隨意地提供給動(dòng)物。水也是自由飲用。[0127]體重在第I天、14天、42天記錄。記錄飼料供給并在稱重2和3后立刻測(cè)量盤中剩余的飼料。[0128]體重增加(BWG)和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)對(duì)于年齡1_14天、14-42天和1_42天的周期進(jìn)行確定。[0129]表1[0130]飼料組分和主要營養(yǎng)物質(zhì)的含量[0131]【權(quán)利要求】1.一種動(dòng)物飼料,選自由青忙、顆粒飼料和粉狀飼料組成的組，所述動(dòng)物飼料用包含木聚糖酶的組分補(bǔ)充，其中所述木聚糖酶是超嗜熱和超熱穩(wěn)定的，其中存在于所述組分中的木聚糖降解活性的最適溫度高于80°c，其中存在于所述組分中的超過70%的所述木聚糖降解活性對(duì)90°C下加熱30分鐘有抵抗力，且其中存在于所述組分中的所述木聚糖降解活性在最適溫度下與在40°C下的活性比率高于10。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物飼料，其中存在于所述組分中的所述木聚糖降解活性的所述最適溫度為高于85°C，優(yōu)選高于90°C。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)物飼料，其中存在于所述組分中的所述木聚糖降解活性在最適溫度下與在40°C下的活性比率高于20。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，其中存在于所述組分中的所述木聚糖酶活性使用3%(w:v)木聚糖，優(yōu)選使用3%(w:v)樺木木聚糖作為底物測(cè)量。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，其中存在于所述組分中的所述木聚糖酶活性在15分鐘反應(yīng)后測(cè)量。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，其中所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶與選自由以下組成的組的木聚糖酶具有超過80%的同一性和/或90%的相似性:SEQ.1D.NO:1、SEQ.1D.NO:2、SEQ.1D.NO:3、SEQ.1D.NO:4,SEQ.1D.NO:5、SEQ.1D.NO:1的氨基酸21-332、SEQ.1D.NO:2的氨基酸21-332、SEQ.1D.NO:3的氨基酸21-332、SEQ.1D.NO:4的氨基酸21-332和SEQ.1D.NO:5的氨基酸21-332。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，其中所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶與選自由以下組成的組的木聚糖酶具有超過99%的同一性:SEQ.1D.NO:1、SEQ.1D.NO:2、SEQ.1D.NO:3、SEQ.1D.NO:4、SEQ.1D.NO:5、SEQ.1D.NO:1的氨基酸21-332、SEQ.1D.NO:2的氨基酸21-332、SEQ.1D.NO:3的氨基酸21-332、SEQ.1D.NO:4的氨基酸21-332和SEQ.1D.NO:5的氨基酸21-332。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，包括在0.08至40mg/kg之間的所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，包括至少50%(干重)的植物材料。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的動(dòng)物飼料，其中所述植物材料選自由谷物、豆類、甜菜糖蜜、馬鈴薯渣和花生餅粉組成的組。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料，包括至少5%(干重)的蛋白質(zhì)和/或至少2%(干重)的脂肪。12.一種超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶的用途，其用于在動(dòng)物中提高體重增加和/或飼料轉(zhuǎn)化率，其中所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶具有高于80°C的最適溫度，其中超過70%的所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶的木聚糖降解活性對(duì)90°C下加熱30分鐘有抵抗力，且其中所述超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶在最適溫度下與在40°C下的活性比率高于10。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述木聚糖酶活性使用3%(w:v)木聚糖，優(yōu)選使用3%(w:v)樺木木聚糖作為底物測(cè)量。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的用途，其中所述木聚糖酶活性在15分鐘反應(yīng)后測(cè)量。15.根據(jù)前述權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料用于在動(dòng)物中提高體重增加和/或飼料轉(zhuǎn)化率的用途。16.根據(jù)前述權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述動(dòng)物為非反芻脊椎動(dòng)物、或甲殼類動(dòng)物，且優(yōu)選魚、豬或家禽，更優(yōu)選豬或家禽。17.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料的方法，包括以下步驟:a)選擇包含半纖維素的飼料；b)添加包含超嗜熱和超熱穩(wěn)定的木聚糖酶的組分，其中存在于所述組分中的超過70%的所述木聚糖降解活性對(duì)90°C下加熱所述組分30分鐘有抵抗力，其中存在于所述組分中的所述木聚糖降解活性的最適溫度高于80°C，且其中存在于所述組分中的所述木聚糖降解活性在最適溫度下與在40°C下的活性比率高于10。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中存在于所述組分中的所述木聚糖酶活性使用3%(w:v)木聚糖，優(yōu)選使用3%樺木木聚糖作為底物測(cè)量。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中存在于所述組分中的所述木聚糖酶活性在15分鐘反應(yīng)后測(cè)量?！疚臋n編號(hào)】A23K1/18GK103997902SQ201280055347【公開日】2014年8月20日申請(qǐng)日期:2012年11月9日優(yōu)先權(quán)日:2011年11月9日【發(fā)明者】丹尼斯·布呂耶,雅克·格奧里斯,瓦萊里·多爾若申請(qǐng)人:焙樂道有限責(zé)任公司