線(xiàn)蟲(chóng)的生物控制的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了使用芽孢桿菌菌株作為殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的方法和相關(guān)組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】線(xiàn)蟲(chóng)的生物控制
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求在35U.S.C.第119節(jié)下保護(hù)下列臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的利益:2011年7月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/511，508、2011年11月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/556，016和2012年6月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/661，763。將上述臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的控制。
[0004]發(fā)明背景
[0005]植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)引起對(duì)多種農(nóng)作物的重大損害，導(dǎo)致?lián)烙?jì)每年變化在5%至12%內(nèi)的全球農(nóng)作物產(chǎn)量損失。線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)根的損害非常普遍，并且導(dǎo)致矮小植物，所述植物具有更小的根系統(tǒng)，在其葉中顯示礦物質(zhì)不足的癥狀并且容易枯萎。線(xiàn)蟲(chóng)造成的損害也使植物易受多種植物致病性真菌和細(xì)菌感染。
[0006]為了抵御和控制線(xiàn)蟲(chóng)，農(nóng)民通常施用化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。這些藥品從氣體和液體熏蒸例如甲基溴化物和氯化苦變化至有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯例如硫磷嗪和草氨酰的應(yīng)用。這些化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的使用已持續(xù)了數(shù)十年。盡管化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑控制目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)的效力較高，但存在對(duì)這些方法的嚴(yán)重限制。一個(gè)限制是化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑不能作用于已穿透根的線(xiàn)蟲(chóng)。另一個(gè)限制是與化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的生產(chǎn)和使用相關(guān)的危險(xiǎn)?；瘜W(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑是高毒性的并且可導(dǎo)致人中毒和死亡。因此，許多國(guó)家已限制，有時(shí)禁用某些殺蟲(chóng)劑。甲基溴化物特別地因其臭氧耗盡效應(yīng)而在大多數(shù)國(guó)家被禁用。
[0007]由于這些限制和禁用，因而缺乏有力的線(xiàn)蟲(chóng)解決方案。本發(fā)明提供了安全有效的方式來(lái)替代或減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用。其在提供抑制線(xiàn)蟲(chóng)穿透進(jìn)入植物根和隨后阻止克服該初始屏障的那些線(xiàn)蟲(chóng)成熟的解決方案中也是獨(dú)特的。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明提供了用于控制植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的方法和組合物。本發(fā)明還提供了用于控制線(xiàn)蟲(chóng)的方法，包括給植物、植物部分和/或植物的種植場(chǎng)所施用有效量的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)QST713、枯草芽孢桿菌QST713的突變體和/或枯草芽孢桿菌QST713的代謝產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，將枯草芽孢桿菌QST713以發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)施用，所述產(chǎn)物包括枯草芽孢桿菌QST713、其代謝產(chǎn)物和任選地殘留發(fā)酵液。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物大體上由枯草芽孢桿菌QST713細(xì)胞或枯草芽孢桿菌QST713的突變體的細(xì)胞組成。
[0010]本發(fā)明的基于枯草芽孢桿菌的組合物減少根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的卵，減少根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的植物穿透，和/或抑制穿透植物的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的成熟。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)(即，被控制的線(xiàn)蟲(chóng))是致病根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)。在某些情況下，線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)自根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)是孢囊線(xiàn)蟲(chóng)。在某些情況下，目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)是來(lái)自異皮線(xiàn)蟲(chóng)屬的種。在其它實(shí)施方案中，目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)是來(lái)自球胞囊屬的種。在其它實(shí)施方案中，目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)自下列物種:針線(xiàn)蟲(chóng)屬(Paratylenchus)、短體屬(Pratylenchus)、擬毛刺線(xiàn)蟲(chóng)屬(Paratrichodorus)、小環(huán)線(xiàn)蟲(chóng)屬(Criconemella)、螺旋線(xiàn)蟲(chóng)屬(Helicotylenchus)、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬(Meloidogyne)和輪線(xiàn)蟲(chóng)屬(Criconemoides)。在具體情況下,線(xiàn)蟲(chóng)是假?gòu)?qiáng)壯螺旋線(xiàn)蟲(chóng)(Helicotylenchus pseudorobustus)(螺旋 HP)或雙角螺旋線(xiàn)蟲(chóng)(Helicotylenchusdigonicus)(螺旋 HD)。
[0011]在一些實(shí)施方案中，將上述組合物與至少一種其它的殺蟲(chóng)劑例如殺真菌劑、殺昆蟲(chóng)劑、殺線(xiàn)蟲(chóng)劑或除草劑混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲(chóng)劑是殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的基于枯草芽孢桿菌的組合物與可商購(gòu)獲得的配制的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑混合在罐中。在其它實(shí)施方案中，將基于枯草芽孢桿菌的組合物與活性成分(即，具有抗真菌、昆蟲(chóng)、線(xiàn)蟲(chóng)或雜草活性的化合物)混合，隨后用惰性物質(zhì)進(jìn)行配制，以便多種活性物形成一個(gè)產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，另一種殺線(xiàn)蟲(chóng)活性成分是氨基甲酸酯或有機(jī)磷酸酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其是生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。
[0012]本發(fā)明提供了包含枯草芽孢桿菌QST713或其突變體和第二線(xiàn)蟲(chóng)控制劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，第二線(xiàn)蟲(chóng)控制劑是氨基甲酸酯或有機(jī)磷酸酯。
[0013]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物的任一種，所述組合物還包含制劑惰性物質(zhì)或其它制劑成分，例如多糖(淀粉、麥芽糊精、甲基纖維素、蛋白質(zhì)，例如乳清蛋白、肽、樹(shù)膠)、糖類(lèi)(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂質(zhì)(卵磷脂、植物油、礦物油)、鹽(氯化鈉、碳酸鈣、檸檬酸鈉)和硅酸鹽(粘土、無(wú)定形硅、煙霧/沉淀的硅酸鹽、硅酸鹽)。在一些實(shí)施方案中，例如其中將組合物用于土壤的那些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含載體，例如水或礦物質(zhì)或有機(jī)材料，例如泥炭，其有利于組合物摻入土壤。在一些實(shí)施方案中，例如其中組合物用于種子處理或用作根部浸潰的那些實(shí)施方案中，載體是有利于組合物粘附至種或根的粘合劑或粘著劑。在其中組合物用作種子處理的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑成分是著色劑。在其它組合物中，制劑成分是防腐劑。
[0014]在一些實(shí)施方案中，將組合物用于植物、植物部分或植物的種植場(chǎng)所，例如土壤，然后種植。在其它實(shí)施方案中，在種植時(shí)使用組合物。在其它實(shí)施方案中，在種植后使用組合物。
[0015]在某些實(shí)施方案中，在應(yīng)用組合物之前，進(jìn)行包括鑒定植物和/或用于生長(zhǎng)的植物種植場(chǎng)所需要處理的步驟。在一些實(shí)施方案中，鑒定包括確定用于植物生長(zhǎng)的場(chǎng)所超過(guò)線(xiàn)蟲(chóng)侵襲的經(jīng)濟(jì)閾值。
[0016]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含枯草芽孢桿菌QST713或其突變體以及其用作殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的說(shuō)明書(shū)的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，這些說(shuō)明書(shū)是產(chǎn)品標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)以約2xl012至約6xl013cfu/英畝的施用率施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。在一些實(shí)施方案中，這些說(shuō)明書(shū)是為將枯草芽孢桿菌用作與化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的用途。在某些情況下，說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)以比當(dāng)用作獨(dú)立處理時(shí)產(chǎn)品標(biāo)簽上推薦的化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的施用率更低的施用率施用化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。在一些其它實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)將枯草芽孢桿菌QST713或其突變體施用至與植物根接觸的土壤，施用至植物基部的土壤，或施用至圍繞植物基部的特定距離內(nèi)(例如，植物基部周?chē)s5cm、約 10cm、約 15cm、約 20cm、約 25cm、約 30cm、約 35cm、約 40cm、約 45cm、約 50cm、約 55cm、約60cm、約 65cm、約 70cm 、約 75cm、約 80cm、約 85cm、約 90cm、約 95cm、約 IOOcm 或更多的距離內(nèi))的土壤。說(shuō)明書(shū)還可指導(dǎo)用戶(hù)以約10至約18天的間隔和/或以約7xl05至約IxlO7Cfu/克土壤/施用的施用率來(lái)進(jìn)行枯草芽孢桿菌QST713或其突變體的多次施用。說(shuō)明書(shū)還可指導(dǎo)用戶(hù)在種植時(shí)施用與化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合的枯草芽孢桿菌QST713或其突變體和在隨后的施用中單獨(dú)施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)以約7xl05至約IxlO7Cfu/克土壤的施用率以單次施用的形式施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)以約IxlO5至約3xl06cfU/克土壤的施用率，多次施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
[0017]附圖概述
[0018]圖1顯示QST713全發(fā)酵液處理對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)感染的根的蟲(chóng)癭(galling)的作用。注意QST713全發(fā)酵液在本圖和其它圖中被稱(chēng)為AQ713。未處理對(duì)照在圖中被稱(chēng)為“UTC”。
[0019]圖2顯示以不同施用率利用SERENADE? ASO產(chǎn)品的處理對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)感染的
幼苗的作用。具體地，結(jié)果顯示根蟲(chóng)癭和穿透的程度以及對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育的影響。每一組3個(gè)對(duì)應(yīng)于每一個(gè)處理(Serenade AS05.0%、2.5%和1.0%和UTC)的第一條柱代表蟲(chóng)瘦，第二條柱代表線(xiàn)蟲(chóng)穿透，第三條柱代表線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育。
[0020]圖3代表相較于未處理的植物(在圖中稱(chēng)為UTC)，每一利用不同批次的AQ713全發(fā)酵液處理的植物的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵。 [0021]圖4代表相較于未處理的植物(在圖中稱(chēng)為UTC)和僅利用INLINE產(chǎn)品處理的植物，每一利用單獨(dú)的或與INLINE產(chǎn)品(具有1，3-二氯丙烯+氯化苦的活性成分)組合的
SERENADE SOIL?產(chǎn)品處理的植物的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵。表2中顯示的不同處理在圖中被稱(chēng)為
T1、T2、T3 和 Τ4。
[0022]圖5代表用AQ713全發(fā)酵液處理的并且以I天、6天、9天和14天的間隔(Τ1、Τ6、T9和Τ14)用線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)攻擊的每植物根的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的穿透(圖5Α)和每植物根的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育(圖5Β)。在圖5Α中，虛線(xiàn)表示未處理對(duì)照(“UTC”)而實(shí)線(xiàn)表示利用AQ713的處理。
[0023]圖6顯示在第O天(TO)用AQ713全發(fā)酵液浸透植物并且在1、2或3周(Τ7、Τ14或Τ21)用線(xiàn)蟲(chóng)攻擊后每植物根由根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生的總卵數(shù)。未處理對(duì)照(UTC)是每一個(gè)接種日期提供每一對(duì)條柱中的第一條柱。每一對(duì)中的第二條柱表示利用AQ713處理的結(jié)果。
[0024]圖7代表通過(guò)SERENADE? ASO產(chǎn)品的單次或多次施用處理的植物的蟲(chóng)癭等級(jí)評(píng)定(圖7A)、每根的總卵數(shù)(圖7B)和新鮮苗重(圖7C)。
[0025]圖8代表通過(guò)以不同的劑量單次施用SERENADE? ASO處理的植物的每克根
的總卵數(shù)。
[0026]發(fā)明詳述
[0027]本文中的所有公開(kāi)案、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)包括本文中的任意附圖和附錄通過(guò)引用并入本文，其引用程度就如同將每一個(gè)別公開(kāi)案或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)囟ㄇ覀€(gè)別地通過(guò)引用并入。
[0028]下列描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。其不是本文中提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)水平或與本發(fā)明相關(guān)或特別地或明確地引用的任何公開(kāi)案是現(xiàn)有技術(shù)水平的承認(rèn)。
[0029]SERENADE產(chǎn)品(EPA登記號(hào)69592-12)包含枯草芽孢桿菌的唯一專(zhuān)利菌株(菌株QST713)和許多不同脂肽，所述脂肽協(xié)同作用以破壞疾病病原體，提供優(yōu)良的抗微生物活性。SERENADE'?產(chǎn)品用于保護(hù)植物例如蔬菜、水果、堅(jiān)果和藤本作物免受疾病例如火燒病、灰霉病、白霉病、銹病、菌核病、白粉病、細(xì)菌性斑腐病和白霉侵害。SERENADE?產(chǎn)品可以以液體或干燥制劑形式獲得，其可用作葉和/
或土壤處理。SERENADE? 產(chǎn)品包括 SERENADE? aso、SERENADE?
MAX和SERENADE SO丨L?的EPA Master標(biāo)簽的拷貝可通過(guò)國(guó)際殺蟲(chóng)劑信息檢索系統(tǒng),(NPIRS?) USEPA/0PP殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品標(biāo)簽系統(tǒng)(PPLS)公開(kāi)獲得。
[0030]SERENADE? ASO (Aqueous Suspension-Organic)包含 1.34% 的干燥 QST7I3作為活性成分和98.66%的其它成分。SERENADE'? ASO被配制為包含最少I(mǎi)xlO9Cfu/g的QST713，而QST713的最大量已被測(cè)定為3.3X101(lCfu/g。SERENADE? ASO的替代商品名稱(chēng)包括 SERENADE BIOFUNGICIDE?> serenade SOIL?和 SERENADE?GARDEN DISEASE。關(guān)于進(jìn)一步信息，參見(jiàn)日期為2010年I月4日的SEREN ADE? ASO的U.S.EPA Master標(biāo)簽和SERENADE SOIL?,將其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文。
[0031]SERENADE? MAX包含14.6%的干燥QST713作為活性成分和85.4%的其它
成分。SERENADE? MAX被配制為包含最少7.3xl09cfu/g的QST713，而QST713的最
大量已被測(cè)定為7.9Xl01Qcfu/g。關(guān)于進(jìn)一步信息，參見(jiàn)SERENADE?: MAX的U.S.EPAMaster標(biāo)簽，將其通過(guò)引用整體并入本文。
[0032]枯草芽孢桿菌QST713、其突變體、其上清液及其脂肽代謝產(chǎn)物以及它們用于控制植物病原體和昆蟲(chóng)的方法全面地描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,060,051;6, 103，228;6, 291, 426;6，417，163和6，638，910中，為`了其教導(dǎo)的每件事，將每一個(gè)所述專(zhuān)利明確且完整地通過(guò)引用并入本文。在這些美國(guó)專(zhuān)利中，菌株被稱(chēng)為AQ713，其與QST713同義。枯草芽孢桿菌QST713于1997年5月7日在國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款下在登錄號(hào)B21661下保藏在NRRL。本說(shuō)明書(shū)中關(guān)于QST713的任何指稱(chēng)都是指存在于
SERENADE?產(chǎn)品中的枯草芽孢桿菌QST713 (aka AQ713)，其以NRRL登錄號(hào)B21661保
藏；或在模擬SERENADE?產(chǎn)品產(chǎn)生的條件下在生物反應(yīng)器或搖瓶中制備。
[0033]上述專(zhuān)利描述了抗線(xiàn)蟲(chóng)漂亮新小桿線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)的N2株的枯草芽孢桿菌QST713全發(fā)酵液的上清液的測(cè)試。這樣的測(cè)試顯示上清液不存在殺線(xiàn)蟲(chóng)活性。
[0034]在于1998年提交美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/074，870 (其對(duì)應(yīng)于上述專(zhuān)利)時(shí)，基于經(jīng)典的、生理學(xué)、生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)方法將QST713菌株命名為枯草芽孢桿菌。自那以后，特別地鑒于遺傳學(xué)和測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，芽孢桿菌屬的分類(lèi)學(xué)一直在演化，從而物種命名主要基于DNA序列而非1998年使用的方法。在比對(duì)來(lái)自解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)FZB42、枯草芽孢桿菌168和QST713的蛋白質(zhì)序列后，約95%的在解淀粉芽孢桿菌FZB42中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)與在QST713中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)具有85%或更大的同一性；然而僅有35%的枯草芽孢桿菌168中的蛋白質(zhì)與QST713中的蛋白質(zhì)具有85%或更多的同一性。然而，即使在遺傳上具有更大的可靠性，但在相關(guān)科學(xué)文獻(xiàn)和監(jiān)管文件中仍然存在分類(lèi)學(xué)模糊性，這反映了在過(guò)去15年中芽孢桿菌分類(lèi)學(xué)的演化理解。例如，基于枯草芽孢桿菌菌株FZB24的殺蟲(chóng)產(chǎn)品(其與QST713的親緣關(guān)系和與FZB42的親緣關(guān)系一樣相近)，在環(huán)境保護(hù)局的文件中被分類(lèi)為解淀粉枯草芽抱桿菌變種(B.subtilis var.amyloliquefaciens)。由于命名法中的這些復(fù)雜性，取決于文獻(xiàn)，該特定的芽孢桿菌種存在各種命名，如枯草芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌和解淀粉枯草孢桿菌變種。因此，我們保留了 QST713的枯草芽孢桿菌命名而非將其改變成解淀粉芽孢桿菌，正如目前僅基于序列比較和推斷的分類(lèi)法所預(yù)期的。
[0035]術(shù)語(yǔ)“突變體”是指源于QST713的遺傳變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變體具有QST713的所有鑒定特征。在特定情況下，突變體對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的控制至少與親本QST713菌株一樣。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變體是具有這樣的基因組序列的遺傳變體，所述基因組序列與QST713菌株具有大于約85%、大于約90%、大于約95%、大于約98%或大于約99%的序列同一性。突變體可通過(guò)用化學(xué)藥品或輻照處理QST713細(xì)胞，或通過(guò)從QST713細(xì)胞的群體選擇自發(fā)突變體(例如抗噬菌體突變體)或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方法獲得。
[0036]本發(fā)明的組合物可通過(guò)按照本領(lǐng)域公知的方法，包括通過(guò)使用美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，060，051中描述的培養(yǎng)基和其它方法，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌QST713或其突變體來(lái)獲得。常規(guī)大規(guī)模微生物培養(yǎng)方法包括深層發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵或液體表面培養(yǎng)。在臨近發(fā)酵結(jié)束時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物被耗盡，枯草芽孢桿菌細(xì)胞開(kāi)始從生長(zhǎng)期過(guò)渡至芽孢形成期，從而發(fā)酵終產(chǎn)物大部分是孢子、代謝產(chǎn)物和殘留發(fā)酵培養(yǎng)基。芽孢形成是枯草芽孢桿菌的自然生命周期的部分，并且通常由細(xì)胞響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)限制而引發(fā)。發(fā)酵被構(gòu)造來(lái)獲得高水平的枯草芽孢桿菌的菌落形成單位并促進(jìn)芽孢形成?？芍苯邮褂糜砂l(fā)酵產(chǎn)生的培養(yǎng)基中的細(xì)菌細(xì)胞、孢子和代謝產(chǎn)物，或通過(guò)常規(guī)工業(yè)方法 例如離心、正切流動(dòng)過(guò)濾、深度過(guò)濾和蒸發(fā)來(lái)濃縮。發(fā)酵液和發(fā)酵液濃縮物在本文中都稱(chēng)為“發(fā)酵產(chǎn)物”。本發(fā)明的組合物包括發(fā)酵產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，例如通過(guò)滲濾法洗滌濃縮的發(fā)酵液以除去殘留發(fā)酵液和代謝產(chǎn)物。
[0037]發(fā)酵液或發(fā)酵液濃縮物可在添加載體或不添加載體的情況下，使用常規(guī)干燥法或方法例如噴霧干燥、冷凍干燥、托盤(pán)干燥(tray drying)、流化床干燥、滾筒干燥或蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行干燥。
[0038]所得的干燥產(chǎn)物可以例如通過(guò)研磨或造粒進(jìn)一步加工，以獲得特定粒度或物理形式。還可在干燥后添加下文中描述的載體。
[0039]本發(fā)明的芽孢桿菌的新型變體和菌株的發(fā)酵液的無(wú)細(xì)胞制劑可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法例如發(fā)酵液的提取、離心和/或過(guò)濾來(lái)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，所謂的無(wú)細(xì)胞制劑可以存在細(xì)胞，但大體上是無(wú)細(xì)胞的或基本上是無(wú)細(xì)胞的，這取決于用于除去細(xì)胞的技術(shù)(例如，離心速度)?？筛稍锼玫臒o(wú)細(xì)胞制劑和/或用幫助其向植物或植物生長(zhǎng)介質(zhì)的施用的組分配制其。上述用于發(fā)酵液的濃縮方法和干燥技術(shù)也適用于無(wú)細(xì)胞制劑。
[0040]可按照美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，060，051中所示的方法獲得枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“代謝產(chǎn)物”可指半純化的和純的或基本上純的代謝產(chǎn)物，或指還未與枯草芽孢桿菌分離的代謝產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，在通過(guò)離心發(fā)酵液制備無(wú)細(xì)胞制劑后，代謝產(chǎn)物可通過(guò)大小排阻過(guò)濾例如S印hadex樹(shù)脂，包括LH-20、G10以及G15和G25來(lái)進(jìn)行純化，所述大小排阻過(guò)濾基于分子量截留值將代謝產(chǎn)物分組為不同的級(jí)分，例如低于約2000道爾頓、低于約1500道爾頓、低于約1000道爾頓等的分子量，因?yàn)橹臑?00道爾頓至1600
道爾頓。
[0041]上文中描述的用于配制發(fā)酵液體的濃縮方法和干燥技術(shù)也可適用于代謝產(chǎn)物。
[0042]本發(fā)明的組合物可包含添加至包含細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制劑或代謝產(chǎn)物的組合物的制劑惰性物質(zhì)以改善效率、穩(wěn)定性和可用性和/或有利于加工、包裝和最終應(yīng)用。這樣的制劑惰性物質(zhì)和成分可包括載體、穩(wěn)定劑、營(yíng)養(yǎng)物或物理性質(zhì)改性劑，可單獨(dú)地或組合地添加。在一些實(shí)施方案中，載體可包括液體材料例如水、油和其它有機(jī)或無(wú)機(jī)溶劑以及固體材料例如礦物質(zhì)、聚合物或聚合物復(fù)合物(生物來(lái)源或通過(guò)化學(xué)合成的)。在一些實(shí)施方案中，載體是有利于組合物粘附至植物部分例如種子或根的粘合劑或粘著劑。參見(jiàn)，例如，Taylor, A.G.,等人，“Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments，，，Annu.Rev.Phytopathol.28:321-339(1990)。穩(wěn)定劑可包括消結(jié)塊劑、抗氧化劑、干燥劑、保護(hù)劑或防腐劑。營(yíng)養(yǎng)物可包括碳、氮和磷源例如糖、多糖、油、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和磷酸鹽。物理性質(zhì)改性劑可包括填充劑、濕潤(rùn)劑、增稠劑、pH調(diào)節(jié)劑、流變學(xué)改性劑、分散劑、佐劑、表面活性劑、防凍劑或著色劑。在一些實(shí)施方案中，可在不使用任何其它配制制劑的情況下，在利用水作為稀釋劑或不利用水作為稀釋劑的情況下直接使用包含通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制劑或代謝產(chǎn)物的組合物。在一些實(shí)施方案中，在濃縮發(fā)酵液后并且在干燥期間和/或之后添加制劑惰性物質(zhì)。
[0043]本發(fā)明的組合物可包括載體，其為添加至組合物中的配制成分，包括含有脂肽的發(fā)酵產(chǎn)物、無(wú)細(xì)胞脂肽制劑或脂肽的純化的、半純化的或粗制提取物，以改善回收、效率或物理性質(zhì)和/或幫助包裝和施用?？蓡为?dú)地或組合地添加這樣的載體。
[0044]可將本發(fā)明的組合物與其它化學(xué)藥品和非化學(xué)添加劑、佐劑和/或處理混合和/或與它們輪流使用，其中這樣的處理包括但不限于化學(xué)和非化學(xué)殺真菌劑、殺蟲(chóng)劑、殺螨藥、殺線(xiàn)蟲(chóng)劑、肥料、營(yíng)養(yǎng)物、礦物質(zhì)、生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)刺激物等。
[0045]可與本發(fā)明的基于枯草芽孢桿菌的組合物混合的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑可以是化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑”不包括薰劑，術(shù)語(yǔ)“薰劑”包括在種植前施用于土壤和通過(guò)土壤(在土壤空氣和/或土壤水中)散播的廣譜殺蟲(chóng)化學(xué)藥品，并且可作為氣體施用，例如甲基溴化物、揮發(fā)性液體例如氯化苦或揮發(fā)性固體例如福美甲酯。
[0046]在一些實(shí)施方案中，化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑是商購(gòu)可得的配制的產(chǎn)品，并且在罐中與本發(fā)明的組合物混合和/或與本發(fā)明的組合物輪流使用。在其它實(shí)施方案中，在配制(與惰性物質(zhì))之前將化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的活性成分(無(wú)惰性物質(zhì))與基于枯草芽孢桿菌QST713的組合物混合，以便組合物形成一種配制產(chǎn)品。
[0047]用于這樣的混合物或輪流程序的化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑是氨基甲酸酯、氨基甲酸肟酯和有機(jī)磷殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。氨基甲酸酯殺線(xiàn)蟲(chóng)劑包括苯菌靈、呋喃丹(FURADAN?)、丁硫克`百威和地蟲(chóng)威。氨基甲酸肟酯包括棉鈴?fù)?、涕滅?TEMIK?或作為來(lái)自Syngenta
的AVICTA? Complete Pak種子處理的部分)、涕滅砜威(STANDAK?)、草氨酰
(VYDATE?)、硫雙威(來(lái)自Bayer CropScience的AERIS?種子施用系統(tǒng)的部分)和環(huán)線(xiàn)威。有機(jī)磷殺線(xiàn)蟲(chóng)劑包括豐索磷(DANSAN1T?)、滅克磷、(MOCAP?)、除線(xiàn)
特、苯線(xiàn)磷、丁硫環(huán)磷、磷胺、硫線(xiàn)磷、毒死蝶、除線(xiàn)磷、樂(lè)果、噻唑磷、速殺硫磷、isamidofos、氯唑磷、甲拌磷、磷蟲(chóng)威、特丁磷、硫磷嗪、三唑磷、imicyafos和基滅姆磷。每一種化合物后的附加說(shuō)明的名稱(chēng)是上述化學(xué)藥品的每一種的代表性商業(yè)制劑。用于這樣的混合物其它化
學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑包括螺蟲(chóng)乙酯(MOVE.NTO?)、M0N37400殺線(xiàn)蟲(chóng)劑和氟蟲(chóng)腈。
[0048]這樣的混合物或輪流程序中使用的生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑包括殼多糖和尿素混合物、慪肥浸潰液和茶劑(充氣的和非充氣的)；包含真菌疣孢漆斑菌和/或來(lái)自其的代謝產(chǎn)物的
組合物(商購(gòu)可獲得為DITERA?)、包含真菌淡紫色擬青霉的組合物(商購(gòu)可獲得為例如MELOCON?或B10ACT);包含細(xì)菌Pasteuria、包括P.USgae的組合物(商購(gòu)可
獲得為例如ECONEM? );包含來(lái)自芽孢桿菌屬的細(xì)菌、包括堅(jiān)硬芽胞桿菌(Bacillus
firmus)的組合物(包括 1995年5月 29 日以CNMC 1-1582保藏在Collection Nationale deCultures de Microorganismesj Institute Pasteur，F(xiàn)rance 的菌株，并且商購(gòu)可得為例如
VOTIVO?:)、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽胞桿菌、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)(包
括1999年I月14日以B-30087保藏在NRRL的菌株及其突變體)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus);和包含殺線(xiàn)蟲(chóng)鏈霉菌的種(Streptomycete sp.)例如利迪鏈霉菌(Streptomyces
lydicus)的組合物(商購(gòu)可得為ACTINOVATE? )。生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑還包括基于植物
的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑例如基于印度楝植物的產(chǎn)品(包括來(lái)自植物的種子或油)或印楝素、印度楝種
子的次級(jí)代謝產(chǎn)物、基于芝麻油的產(chǎn)品(例如DRAGONFIRE?)，香芹酚和基于植物
提取物的產(chǎn)品(例如NEMA-Q?,獲自智利的皂樹(shù)屬的樹(shù))。生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑還包括由細(xì)
菌產(chǎn)生的分離的化合物例如mectins,其是由阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis)產(chǎn)生的，包括阿巴克丁(由阿巴克丁 Bla和Blb的組合組成)和阿佛菌素B2a，和harpin蛋白，最初在解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)中鑒定的,包括harpinEA和harpina e。
[0049]本發(fā)明的組合物用于控制植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)例如根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、腐線(xiàn)蟲(chóng)和環(huán)線(xiàn)蟲(chóng),包括根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、異皮線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、Globodera的種、短體屬的種和小環(huán)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種。組合物還用于控制杉木半穿刺線(xiàn)蟲(chóng)病(Tylenchulus semipenetrans)、毛刺屬的種、長(zhǎng)針線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、腎形線(xiàn)蟲(chóng)的種、劍線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、刺線(xiàn)蟲(chóng)的種(例如刺線(xiàn)蟲(chóng))、擬環(huán)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種(Criconemoides spp.)、矮化線(xiàn)蟲(chóng)的種(Tylenchorhynchus spp.)、紐帶線(xiàn)蟲(chóng)的種(Hoplolaimus spp.)、盤(pán)旋線(xiàn)蟲(chóng)的種(Rotylenchus spp.)、螺旋線(xiàn)蟲(chóng)的種(Helicotylenchus spp.)(例如偽強(qiáng)壯螺旋線(xiàn)蟲(chóng)(Spiral HP)和雙角螺旋線(xiàn)蟲(chóng)(Helicotylenchus digonicus) (Spiral HD))、穿孔線(xiàn)蟲(chóng)的種(Radopholus spp.)(例如穿孔線(xiàn)蟲(chóng)(R.citrophilis)和類(lèi)似穿孔線(xiàn)蟲(chóng)(R.similis))、鱗球莖莖線(xiàn)蟲(chóng)的種(Ditylenchusspp.)、擬毛刺線(xiàn)蟲(chóng)(Paratrichodorus spp.)和其它植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)是孢囊線(xiàn)蟲(chóng)例如大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heterodera glycines)(大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng))、甜菜胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊線(xiàn)蟲(chóng))、小麥禾谷孢囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heteroderaavenae)(小麥禾谷孢囊線(xiàn)蟲(chóng))、南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidigyne incognita)(棉花(或南方)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng))、馬鈴薯金線(xiàn)蟲(chóng)(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線(xiàn)蟲(chóng)(Globodera pallida)(馬鈴薯胞囊線(xiàn)蟲(chóng))。在其它實(shí)施方案中，目標(biāo)是根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)例如南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M.1ncognita)(棉花根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng))、爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M.javanica)(爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng))、北方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M.hap I a)(北方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng))和花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(M.arenaria)(花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng))。
[0050]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“控制”意指殺死、數(shù)量的減少和/或減少生長(zhǎng)、攝食或正常生理發(fā)育，包括:對(duì)于根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，穿透根和在根內(nèi)發(fā)育的能力。有效量是指這樣的量:能夠顯著地減少線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)、攝食、根穿透、在根中成熟和/或一般正常線(xiàn)蟲(chóng)的生理發(fā)育和/或由線(xiàn)蟲(chóng)感染引起的植物宿主癥狀例如蟲(chóng)癭或減少的根和/或植物生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，癥狀和/或線(xiàn)蟲(chóng)減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。
[0051]本發(fā)明的組合物用于處理多種農(nóng)業(yè)和/或園藝作物，包括生長(zhǎng)為了種子、生產(chǎn)和園林美化的那些植物?？墒褂帽景l(fā)明的組合物處理的代表性植物包括但不限于下列植物:球莖蔬菜；谷粒；柑橘屬(例如葡萄柚、檸檬和柑橘)；棉花和其它纖維農(nóng)作物；葫蘆；果菜類(lèi)；葉用蔬菜(例如芹菜、結(jié)球萵苣和散葉萵苣以及菠菜)；豆莢科；油料種子作物；花生；仁果(例如蘋(píng)果和梨)；核果(例如杏仁、核桃和胡桃)；根菜類(lèi)；塊莖菜類(lèi)；球莖菜類(lèi)；煙草、草莓和其它漿果；油菜作物(例如綠花椰菜和包菜)；葡萄；菠蘿；和有花植物、花壇植物和觀賞植物(例如蕨類(lèi)植物和玉簪屬)。本發(fā)明的組合物還用于處理多年生植物，包括栽植作物例如香蕉和咖啡以及存在于森林、公園或園林美化中的那些植物。
[0052]將本文中描述的組合物施用至植物、植物部分例如種子、根、根莖、球根、球莖或塊莖，和/或植物或植物部分在其上生長(zhǎng)的場(chǎng)所例如土壤，以控制植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)。可將本發(fā)明的組合物作為葉噴霧劑 ，作為種子/根/塊莖/根莖/球莖/球根處理和/或作為土壤處理來(lái)施用?？稍诜N植之前、種植期或種植之后處理種子/根/塊莖/根莖/球莖/球根。
[0053]本文中描述的組合物也可施用于植物、植物部分例如種子、根、根莖、球根、球莖或塊莖，和/或植物或植物部分在其上生長(zhǎng)的場(chǎng)所例如土壤，以控制植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)，從而增加農(nóng)作物產(chǎn)量。在一些實(shí)施方案中，農(nóng)作物產(chǎn)量增加至少約5%，在其它實(shí)施方案中增加至少約10%，在其它實(shí)施方案中增加至少約15%，在其它實(shí)施方案中增加至少約20%。
[0054]當(dāng)用作種子處理時(shí),取決于種子的尺寸，以約IxlO2至約IxlO9Cfu/種子的施用率施用本發(fā)明的組合物。在一些實(shí)施方案中，施用率為約IxlO3至約IxlO8Cfu/種子或約IxlO4至約IxlO7Cfu/種子。
[0055]本發(fā)明的組合物還可以以約IxlO3至約IxlO8Cfu/植物根系統(tǒng)的施用率用作根部浸潰。
[0056]當(dāng)用作土壤處理時(shí),可通過(guò)土壤表面燒灌、柄中(shanked-1n)、注射和/或溝灌施用，或通過(guò)與灌溉水混合來(lái)施用本發(fā)明的組合物?？稍诜N植時(shí)、播種期間或之后，或在移栽后以及在植物生長(zhǎng)的任何階段施用的以澆灌土壤處理的施用率是約4xl07至約SxlO14Cfu/英畝或約4xl09至約8xl013cfu/英畝或約4χ10η至約8xl012cfu/英畝或約2xl012至約6xl013cfu/英畝或約2xl012至約3xl013cfu/英畝。在一些實(shí)施方案中，施用率為約IxlO12至約6xl012cfu/英畝或約IxlO13至約6xl013cfu/英畝。種植時(shí)施用的用于溝灌處理的施用率為約2.5xl01Q至約5xl0ncfu/1000排英尺(row feet)。在一些實(shí)施方案中，施用率是約6xl010至約3xl012cfu/1000排英尺或約6xl01Q至約4xl0ncfu/1000排英尺或約6χ10η至約3xl012cfu/1000排英尺或約6χ10η至約4xl012cfu/1000排英尺。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何調(diào)整用于播灑處理和其它不太常見(jiàn)的土壤處理的施用率。
[0057]可在種植之前或開(kāi)始萌發(fā)種子之前將本發(fā)明的組合物引入土壤。還可將本發(fā)明的組合物引入與植物根接觸的土壤，引入至植物基部的土壤，或引入至植物基部周?chē)耐寥?例如，在植物基部周?chē)蛳路郊s5cm、約10cm、約15cm、約20cm、約25cm、約30cm、約35cm、約 40cm、約 45cm、約 50cm、約 55cm、約 60cm、約 65cm、約 70cm、約 75cm、約 80cm、約 85cm、約 90cm、約95cm、約IOOcm或更長(zhǎng)的距離內(nèi))。可通過(guò)利用多種技術(shù)包括但不限于滴灌、噴灑、土壤注射或土壤澆灌來(lái)施用組合物。還可將組合物施用至穴盤(pán)中的土壤和/或植物，或在移栽至不同的植物種植場(chǎng)所之前施用至幼苗。當(dāng)施用至與植物根接觸的土壤，施用至植物基部，或施用至植物基部周?chē)囟ň嚯x內(nèi)的土壤(包括土壤澆灌處理)時(shí)，可以以單次施用或多次施用的形式施用組合物?？梢砸陨衔闹袑?duì)于澆灌處理所示的施用率，或以約IxlO5至約 IxlO8Cfu/ 克土壤、IxlO5 至約 IxlO7Cfu/ 克土壤、IxlO5 至約 IxlO6Cfu/ 克土壤、7xl05 至約IxlO7Cfu/克土壤、IxlO6至約5xl06cfu/克土壤或IxlO5至約3xl06cfu/克土壤的施用率施用組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約7xl05至約IxlO7Cfu/克土壤的施用率單次施用本發(fā)明的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以約IxlO6至約5xl06cfU/克土壤的施用率單次施用本發(fā)明的組合物。在其它實(shí)施方案中，以約IxlO5至約3xl06cfU/克土壤的施用率多次施用本發(fā)明的組合物。
[0058]當(dāng)多次施用本發(fā)明的組合物時(shí)，這些應(yīng)用可以以約I至約28天、約I至約21天、約I至約14天、約7至約28天、約7至約21天、約7至約14天或約10至約18天的間隔進(jìn)行。
[0059]可單獨(dú)地或與一種或多種其它殺線(xiàn)蟲(chóng)劑例如化學(xué)和生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合地施用本發(fā)明的基于枯草芽孢桿菌的組合物。在一些實(shí)施方案中，將枯草芽孢桿菌QST713與至少一種其它殺線(xiàn)蟲(chóng)劑一起配制，隨后將共配制的產(chǎn)物應(yīng)用于植物或植物種植場(chǎng)所。在一些其它實(shí)施方案中，將基于枯草芽孢桿菌的組合物與化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的商購(gòu)可得制劑在罐中混合，并應(yīng)用于植物和植物種植場(chǎng)所。在其它實(shí)施方案中，在即將施用化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的商購(gòu)可得的制劑之前或在施用之后立即將本發(fā)明的基于枯草芽孢桿菌的組合物施用至植物和/或植物種植場(chǎng)所。在其它實(shí)施方案中，將本發(fā)明的基于枯草芽孢桿菌的組合物與化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的商購(gòu)可得制劑輪流施用至植物和/或植物種植場(chǎng)所。在牽涉殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的數(shù)次施用的輪流程序中，可將本發(fā)明的組合物單獨(dú)地或與其它殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合地施用。在一個(gè)情況下，將基于枯草芽孢桿菌的組合物用于種子處理或用于溝灌或澆灌，如下文中更詳細(xì)論述的。
[0060]雖然本 申請(qǐng)人:不希望束縛在任何特定理論上，但認(rèn)為枯草芽孢桿菌QST713通過(guò)處理的植物中的誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性(ISR)控制線(xiàn)蟲(chóng)。關(guān)于ISR的解釋?zhuān)瑓⒁?jiàn)Bakker, P.A.H.M., “Induced Systemic Resistance by Fluorescent Pseudomonas spp.，’Phytophathology97 (2):239-243(2007)。ISR可能只有在用枯草芽孢桿菌QST713進(jìn)行處理的時(shí)間與隨后線(xiàn)蟲(chóng)攻擊植物的時(shí)間之間的一定延遲期后才起作用。在一些實(shí)施方案中，在種植時(shí)將基于枯草芽孢桿菌的組合物與第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合施用，在隨后的施用中，將基于枯草芽孢桿菌的組合物單獨(dú)地或與另一種殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合地施用。利用第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的初步處理可在延遲期中保護(hù)植物直至基于枯草芽孢桿菌的組合物促發(fā)ISR。在一些上述實(shí)施方案的情況下，可將第二化學(xué)或生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的商購(gòu)可得的制劑以低于標(biāo)簽推薦的施用率施用以用作獨(dú)立殺線(xiàn)蟲(chóng)劑處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，在種植時(shí)將枯草芽孢桿菌QST713與草氨酰
(VYDATE?)—起施用，并且在隨后的施用中單獨(dú)施用枯草芽孢桿菌QST713。
[0061]在其它實(shí)施方案中，在施用熏劑后將本發(fā)明的基于芽孢桿菌的組合物施用于植物和/或植物種植場(chǎng)所。熏劑可通過(guò)柄注射(shank injection)(通常最小在土壤表面以下8英寸)來(lái)施用。還可通過(guò)表面滴注化學(xué)灌溉來(lái)施用熏劑的液體制劑以將熏劑移至土壤表面以下8英寸或更深的深度。用塑料布覆蓋處理的土壤床以將熏劑保留在土壤中數(shù)天。這在種植之前進(jìn)行，并允許在種植之前排氣?？稍诜N植之前、種植時(shí)或種植后，在該排氣期之后施用本文中描述的基于芽孢桿菌的組合物。在一些情況下，以低于產(chǎn)品標(biāo)簽上推薦的施用率施用熏劑。
[0062]化學(xué)和生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑在上文中進(jìn)行了描述。熏劑殺線(xiàn)蟲(chóng)劑包括鹵代烴例如氯化苦(CHL0R-0-PIC);甲基溴化物(METH-O-GAS)及其組合(例如BROM-O-GAS和TERR-0-GAS) ; I, 3- 二氯丙烯(TEL0NE I1、TELONE EC、CURFEW)及 1，3- 二氯丙烯與氯化苦的組合(TELONE C-17、TELONE C-35和INLINE);碘代甲烷(MIDAS);異氰酸甲酯釋放劑例如甲基二硫氨基甲酸鈉(VAPAM、SOILPREP、METAM-S0DIUM) ; I, 3 二氯丙烯與異硫氰酸甲酯(VORLEX)的組合；和二硫化碳釋放劑例如硫代碳酸鈉(ENZONE);和二甲基二硫化物或DMDS(PALADINO)。上述熏劑的每一種的示例性商業(yè)制劑提供于化學(xué)名稱(chēng)后的括號(hào)內(nèi)。
[0063]還可將本發(fā)明的組合物作為病蟲(chóng)害綜合治理(“IPM”)項(xiàng)目的部分進(jìn)行施用。這樣的項(xiàng)目描述于各種出版物中，尤其是通過(guò)大學(xué)合作推廣。這樣的項(xiàng)目包括與不能容許目標(biāo)線(xiàn)蟲(chóng)宿寄生的農(nóng)作物進(jìn)行的農(nóng)作物輪作、栽培和耕地措施以及移栽的使用。例如可在用芥茉或其它線(xiàn)蟲(chóng)抑制農(nóng)作物生長(zhǎng)一季后施用基于芽孢桿菌的組合物。
[0064]在一些實(shí)施方案中，在將本發(fā)明的組合物施用至植物、植物部分或植物種植場(chǎng)所之前，鑒定需要處理的種植場(chǎng)所。這樣的鑒定可通過(guò)通常結(jié)合線(xiàn)蟲(chóng)問(wèn)題的歷史知識(shí)目測(cè)鑒定外觀萎黃、矮化、壞死或枯萎(即`，表現(xiàn)出養(yǎng)分缺乏)的植物；植物采樣；和/或土壤采樣來(lái)進(jìn)行。植物采樣可在生長(zhǎng)季節(jié)期間或在最終的收獲后立即進(jìn)行。將植物從土壤取出，檢查它們的根以測(cè)定土地中線(xiàn)蟲(chóng)問(wèn)題的性質(zhì)和程度。對(duì)于根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，根蟲(chóng)癭的嚴(yán)重性通過(guò)測(cè)量長(zhǎng)了蟲(chóng)癭的根系統(tǒng)的比例來(lái)測(cè)定。由根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)引起的蟲(chóng)癭可與固氮土壤細(xì)菌的根瘤相區(qū)另IJ，因?yàn)椴蝗菀讓⑾x(chóng)癭與根分離。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)土壤群體的水平隨根蟲(chóng)癭的嚴(yán)重性增加而升高。在一些情況下，根蟲(chóng)癭的任何水平的檢測(cè)表明對(duì)于種植任何易感農(nóng)作物(尤其在取樣區(qū)域或其附近)存在根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)問(wèn)題。孢囊線(xiàn)蟲(chóng)還可通過(guò)植物取樣和根部孢囊的細(xì)察來(lái)鑒定。
[0065]土壤采樣提供了測(cè)定侵染一定體積的土壤或根的線(xiàn)蟲(chóng)和/或線(xiàn)蟲(chóng)卵的數(shù)目的方法。當(dāng)在最終收獲時(shí)或在種植新的農(nóng)作物之前任何時(shí)間，包括在先前的農(nóng)作物的作物毀減之前，首先懷疑有問(wèn)題時(shí)，可進(jìn)行土壤采樣。大學(xué)合作推廣項(xiàng)目提供土壤采樣服務(wù)，包括佛羅里達(dá)大學(xué)、俄勒R州立大學(xué)和內(nèi)布拉斯加林肯大學(xué)。此外，這樣的項(xiàng)目提供如何收集樣品的指導(dǎo)。例如，在收獲后預(yù)測(cè)性取樣的一個(gè)方法中，以有規(guī)則的曲折圖案從超過(guò)5或10英畝(取決于農(nóng)作物的價(jià)值，農(nóng)作物的價(jià)值越高取樣的英畝越少)的10至20塊田間位置在6至10英寸的土壤深度收集樣品。在測(cè)定已確定的植物的方法中，在6至10英寸的土壤深度從表現(xiàn)出癥狀但未死亡或?yàn)l死即腐爛的懷疑植物取出根和土壤樣品。
[0066]在一些實(shí)施方案中，鑒定包括確定線(xiàn)蟲(chóng)侵染的經(jīng)濟(jì)閾值是否已達(dá)到；8卩，在不處理的情況下預(yù)期的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)處理成本時(shí)的點(diǎn)。取決于農(nóng)作物、地理、氣候、種植時(shí)間、土壤類(lèi)型和/或土壤溫度，經(jīng)濟(jì)閾值可變化。已發(fā)表了許多關(guān)于該主題的論文，并且可從不同地區(qū)的大學(xué)合作推廣項(xiàng)目獲得指導(dǎo)。參見(jiàn)，例如，Robb, J.G.，等人，“Factors Affecting theEconomic Threshold for Heterodera schachtii Control in Sugar Beet,，，Economicsof Nematode Control January-Junel992;Hafez, Saad L., “Management of Sugar BeetNematode,，，University of Idaho Current Information Series(CIS) 1071 (1998);和 UC IPM Pest Management Guidelines:Tomato UC ANR Publication3470NematodeA.Ploeg, Nematology, UC Riverside (January2008)。在一年的特定時(shí)間測(cè)定特定農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)閾值完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)能力內(nèi)。
[0067]在一些實(shí)施方案中，土壤取樣顯示線(xiàn)蟲(chóng)侵染將導(dǎo)致為未侵染土壤的正常產(chǎn)量的約80%、約90%或約95%的產(chǎn)量。
[0068]在一些實(shí)施方案中，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)/千克土壤樣品的經(jīng)濟(jì)閾值為至少約250、至少約300、至少約500、至少約750、至少約1000、至少約2000、至少約3000、至少約4000、至少約5000或至少約6000。
[0069]在一些實(shí)施方案中，孢囊線(xiàn)蟲(chóng)卵和幼蟲(chóng)/Icm3 土壤的經(jīng)濟(jì)閾值為至少約0.5、至少約1、至少約2、至少約3、至少約4。根據(jù)上文的Hafez (1998)，孢囊可估計(jì)為500個(gè)有活力的卵和幼蟲(chóng)。
[0070]下列實(shí)施例被提供來(lái)僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的目的并且不限定本發(fā)明。
實(shí)施例`
[0071]實(shí)施例1
[0072]枯草芽孢桿菌QST713抗爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的活性
[0073]利用黃瓜種子蘇丹變種進(jìn)行研究以測(cè)定QST713抗爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的活性。用不同施用率的QST713的全發(fā)酵液或商購(gòu)可得的SERENADE? Aso產(chǎn)品處理裝有20g沙土
和一顆未發(fā)芽種子的50ml離心管。全發(fā)酵液U SERENADE? ASO產(chǎn)品相異在于所述產(chǎn)
品在菌落形成單位(Cfu)和代謝產(chǎn)物方面濃度大得多，所述產(chǎn)品具有為全發(fā)酵液至少I(mǎi)log的cfu。此外，除其它方面以外，利用防腐劑配制產(chǎn)品，使得所述產(chǎn)品酸性比全發(fā)酵液更強(qiáng)。為了獲得QST713的全發(fā)酵液培養(yǎng)物，用QST713接種包含Luria Broth(LB)的種子瓶，在30°C生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，將來(lái)自每一個(gè)種子瓶的等份在IL的搖瓶中接種200ml的基于大豆的培養(yǎng)基，生長(zhǎng)直至芽孢形成。簡(jiǎn)而言之，將搖瓶培養(yǎng)物維持在30°C至32°C的溫度和200至220rpm的搖床設(shè)置。在約3天的接種后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生停止時(shí)，收獲液體培養(yǎng)物。使處理的種子萌發(fā)并且生長(zhǎng)在溫室中。處理后4至5天(DAT)，用100只根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)接種每一只管。10DAT后，以0-4的等級(jí)對(duì)幼苗的百分比根蟲(chóng)癭產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)分，這描述于表1中。
[0074]隨后用酸性品紅對(duì)根進(jìn)行染色以觀察線(xiàn)蟲(chóng)穿透和發(fā)育，在Leica解剖顯微鏡下進(jìn)行觀察。對(duì)于線(xiàn)蟲(chóng)穿透，計(jì)數(shù)每一條根內(nèi)總的線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)。對(duì)于線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育，計(jì)數(shù)總的肥胖幼蟲(chóng)，包括晚期二齡幼蟲(chóng)(J2’ s)和三齡幼蟲(chóng)(J3’ S)。如表1中所述對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)至根的穿透和穿透后線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育進(jìn)行評(píng)分。關(guān)于使用的技術(shù)的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)C.0.0mwega，等人，“ANondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance toMeloidogyne incognita，，，Plant Disease (1988) 72 (11):970_972o
[0075]表1.細(xì)菌全發(fā)酵液的線(xiàn)蟲(chóng)拮抗活性的評(píng)級(jí)方案。蟲(chóng)癭產(chǎn)生指數(shù)是基于根蟲(chóng)癭的百分比。穿透等級(jí)計(jì)算為相對(duì)于未處理對(duì)照(UTC)的線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)數(shù)目的線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)的平均總數(shù)。發(fā)育等級(jí)反映根內(nèi)肥胖線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)(晚J2期/J3期)的總數(shù)。
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種用于控制線(xiàn)蟲(chóng)的方法，包括給植物和/或植物生長(zhǎng)的場(chǎng)所施用有效量的枯草芽孢桿菌QST713或枯草芽孢桿菌QST713的突變體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在施用之前鑒定植物和/或植物生長(zhǎng)的場(chǎng)所需要處理。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述鑒定包括測(cè)定植物生長(zhǎng)的場(chǎng)所超過(guò)線(xiàn)蟲(chóng)侵染的經(jīng)濟(jì)閾值。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述場(chǎng)所是土壤。
5.權(quán)利要求4的方法，其中在種植前施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
6.權(quán)利要求4的方法，其中在種植時(shí)施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)溝灌施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
8.權(quán)利要求4的方法，其中在種植后施用所述枯草芽孢桿菌QS713或其突變體。
9.權(quán)利要求4的方法，其中對(duì)于土壤澆灌處理以約2xl012至約6xl013cfu/英畝的施用率或?qū)τ跍瞎嗵幚硪约s61101°至約4X1012cfu/1000排英尺的施用率施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述施用率為約IxlO13至約6xl013cfu/英畝或約7.5χ10η至約4xl012cfu/1000排英尺。
11.權(quán)利要求4的方法，其中將所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體施用至與植物根接觸的土壤或植物基部的土壤。
12.權(quán)利要求11的方法,其中以約7xl05至約IxlO7Cfu/克土壤的施用率單次施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中以約IxlO6至約5xl06cfu/克土壤的施用率單次施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
14.權(quán)利要求9的方法，其中對(duì)于土壤澆灌處理/施用，以約2xl012至約6xl013cfu/英畝的施用率，多次施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
15.權(quán)利要求11的方法,其中以約IxlO5至約3xl06cfu/克土壤/施用的施用率，多次施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中多次施用以約10至約18天的間隔進(jìn)行。
17.權(quán)利要求11的方法，其中通過(guò)滴灌、噴灑、土壤注射或土壤澆灌施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
18.權(quán)利要求1的方法，其中將所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體施用至種子。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體是發(fā)酵產(chǎn)物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物包含枯草芽孢桿菌QST713細(xì)胞或枯草芽孢桿菌QST713的突變體的細(xì)胞、代謝產(chǎn)物和殘留發(fā)酵液。
21.權(quán)利要求1的方法，還包括施用第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑是選自氨基甲酸酯、有機(jī)磷酸酯和生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。
23.權(quán)利要求21的方法，其中將 所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑與枯草芽孢桿菌QST713或其突變體組合施用。
24.權(quán)利要求21的方法，其中將所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑與枯草芽孢桿菌QST713或其突變體輪流施用。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑是配制的商購(gòu)可得的產(chǎn)品。
26.權(quán)利要求23的方法，其中以低于產(chǎn)品標(biāo)簽上推薦的當(dāng)作為獨(dú)立處理施用第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑時(shí)第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的施用率的施用率施用所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。
27.權(quán)利要求23的方法，其中在種植時(shí)將所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體與第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合施用，并且在隨后的施用中單獨(dú)施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述隨后施用以約10至約18天的間隔進(jìn)行。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑是草氨酰。
30.權(quán)利要求21的方法，其中將所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體施用至與植物根接觸的土壤的位置或植物基部的土壤位置。
31.權(quán)利要求30的方法，其中以約IxlO5至3xl06cfu/克土壤的施用率施用所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
32.權(quán)利要求1-31的任一項(xiàng)的方法，其中所述線(xiàn)蟲(chóng)選自線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、擬毛刺線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、小環(huán)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、螺旋線(xiàn)蟲(chóng)屬的種、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種和輪線(xiàn)蟲(chóng)屬的種。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述線(xiàn)蟲(chóng)是根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬的種。
34.一種包含枯草芽孢桿菌QST713或其突變體和第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的組合物。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述第二殺線(xiàn)蟲(chóng)劑選自氨基甲酸酯、有機(jī)磷酸酯和生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。
36.一種試劑盒，其包`括枯草芽孢桿菌QST713或其突變體和其用作殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的說(shuō)明書(shū)。
37.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)對(duì)于土壤澆灌處理以約2xl012至約6xl013cfu/英畝的施用率或?qū)τ跍瞎嗵幚硪约s6xl0lcl至約4xl012cfu/1000排英尺的施用率使用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述施用率為約IxlO13至約6xl013cfU/英畝或約7.5χ10η 至約 4xl012cfu/1000 排英尺。
39.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)將所述枯草芽孢桿菌QST713或其突變體施用至與植物根接觸的土壤或在植物基部的土壤。
40.權(quán)利要求39的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)以約7xl05至約IxlO7Cfu/克土壤的施用率，單次施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
41.權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)以約IxlO5至約3xl06cfU/克土壤的施用率，多次施用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
42.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)用戶(hù)將枯草芽孢桿菌QST713或其突變體與化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合使用，以及進(jìn)一步指導(dǎo)用戶(hù)以低于產(chǎn)品標(biāo)簽上推薦的化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑的施用率的施用率使用所述化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑。
43.權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述說(shuō)明書(shū)還指導(dǎo)用戶(hù)在種植時(shí)將枯草芽孢桿菌QST713或其突變體與化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑組合使用并且在隨后施用中單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。
44.權(quán)利要求43的試劑盒，其中所述隨后施用以約10至約18天的間隔進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】A01P5/00GK103796516SQ201280042883
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月25日
【發(fā)明者】R·N·羅亞爾蒂, V·托馬斯, R·惠特森 申請(qǐng)人:拜爾作物科學(xué)有限合伙公司