專利名稱：一種牙鲆用復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牙鲆用復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑。
背景技術(shù)：
牙鲆是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值豐富。隨著牙鲆工廠化養(yǎng)殖規(guī)模和密度的加大，疾病發(fā)生率也不斷增大，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖者不得不使用抗生素來預(yù)防和治療疾病。但抗生素長期使用，極易產(chǎn)生抗藥性，致使水產(chǎn)養(yǎng)殖動物本身的免疫力下降，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的質(zhì)量，尤其是導(dǎo)致整個水體的環(huán)境污染。因此綠色無公害免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和使用成為一種趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種牙鲆用復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑，即將各種單一核苷酸按比例進(jìn)行合理搭配，提供一種牙鲆用的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑，以減少疾病對牙鲆養(yǎng)殖造成的危害，保障牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本發(fā)明的牙鲆用復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑，由如下的重量百分比的物質(zhì)組成胞嘧啶核苷酸55 65%、尿嘧啶核苷酸5 15%、胸腺嘧啶核苷酸5 15%、次黃嘌呤核苷酸I 5%、生物活性肽10 20%。本發(fā)明的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑的制備方法如下先按照重量百分比分別稱取胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、次黃嘌呤核苷酸和生物活性肽，進(jìn)行粉碎成粉狀后過篩，篩網(wǎng)細(xì)度為80-120目，再將粉末進(jìn)行干燥完成制備。本發(fā)明的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑用作牙鲆的飼料添加劑。本發(fā)明的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑能夠明顯提高牙鲆的攝食和生長，顯著提高牙鲆的細(xì)胞免疫、體液免疫、免疫基因表達(dá)量和疾病抵抗力等。而且，還可以直接添加到牙鲆飼料中，口服投喂；具有無毒副殘留性、無抗藥性，不污染環(huán)境的優(yōu)點。
具體實施例方式核苷酸是生物體內(nèi)重要的低分子化合物，近年來也被認(rèn)為是半必需營養(yǎng)素。它參與到動物體內(nèi)的生理、生化過程中起重要調(diào)節(jié)作用，同時能刺激動物的特異性、非特異性免疫反應(yīng)，影響與免疫有關(guān)細(xì)胞的發(fā)生與分化以及巨噬細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞的活性與數(shù)量及其分泌的白細(xì)胞介素2、3 (IL-2、3)，最后影響細(xì)胞免疫。其中嘌呤堿或嘧啶堿參與到魚類的一些生理生化反應(yīng)過程中，包括基因信息的編碼與解碼，能量代謝和細(xì)胞信號的調(diào)停。同時也是構(gòu)成輔酶，變構(gòu)效應(yīng)因子及細(xì)胞興奮劑的成分。生物活性肽是一類分子量小于6000道爾頓、結(jié)構(gòu)較松散且具有多種生物學(xué)功能的小肽。它存在于機(jī)體中的各種組織中，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。申請人:在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，將核苷酸與生物活性肽進(jìn)行復(fù)配制成免疫增強(qiáng)劑，能夠更有效的發(fā)揮核苷酸的免疫效果，從而促成了本發(fā)明。
為了更清楚的理解本發(fā)明以及本免疫增強(qiáng)劑的療效，以下通過具體實施例和相關(guān)試驗對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實施例1按重量百分比分別稱取購自山東雙鳳股份有限公司的胞嘧啶核苷酸60g、尿嘧啶核苷酸8g、胸腺卩密唳核苷酸10g、次黃嘌呤核苷酸(hypoxanthine nucleotide ;IMP)2g和購自北京桑普生物技術(shù)有限公司的生物活性肽20g，將混合物進(jìn)行研磨粉碎后用篩子過篩，其中篩孔的細(xì)度要求為80-120目。將過濾后的粉劑進(jìn)行通過干燥，至粉劑重量比干燥前減少10% ;從而制成所需的免疫增強(qiáng)劑。實施例2按重量百分比分別稱取購自山東雙鳳股份有限公司的胞嘧啶核苷酸55g、尿嘧啶 核苷酸log、胸腺嘧啶核苷酸15g、次黃嘌呤核苷酸5g和購自北京桑普生物技術(shù)有限公司的生物活性肽15g。細(xì)度要求為80-120目，干燥失重< 10.0%。得所需的免疫增強(qiáng)劑。實施例3按重量百分比分別稱取購自山東雙鳳股份有限公司的胞嘧啶核苷酸65g、尿嘧啶核苷酸5g、胸腺嘧啶核苷酸15g、次黃嘌呤核苷酸3g和購自北京桑普生物技術(shù)有限公司的生物活性肽12g。細(xì)度要求為80-120目，干燥失重< 10.0%。得所需的免疫增強(qiáng)劑。上述免疫增強(qiáng)劑的使用方法與用量為將免疫增強(qiáng)劑按每公斤牙鲆飼料中添加免疫增強(qiáng)劑O. 2-0. 5克，制成顆粒飼料進(jìn)行投喂。以下結(jié)合復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑飼喂試驗得出的非特異性免疫指標(biāo)和疾病抵抗力對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例4養(yǎng)殖試驗依據(jù)發(fā)明中實施例1中核苷酸和生物活性肽的濃度配比復(fù)合核苷酸，設(shè)置不同濃度梯度，對初始體重IOg左右的牙鲆進(jìn)行養(yǎng)殖。實驗共分5個處理。每個處理3個重復(fù)。每天飽食投喂兩次。試驗過程中，水溫18±1°C、溶氧7. 9-8. 2mg/L、鹽度平均32±1%。。養(yǎng)殖試驗開始后的第1、2、3、4周分別取樣。取樣之前魚禁食24h，從每個處理中隨機(jī)選4尾魚。重?fù)趑~頭部使其昏迷，用I毫升注射器從尾靜脈抽血。收集于離心管中，室溫下靜置24h后離心(3000Xg，10min，4°C )，分離血清，于-70°C下保存?zhèn)溆?。頭腎巨噬細(xì)胞的分離采用Ortufi0的方法并稍作修改。取下頭腎，研磨，過100目篩絹制成細(xì)胞懸液，percoll梯度離心，分離細(xì)胞并調(diào)整至IO7細(xì)胞/ml，培養(yǎng)于96孔板中備用，測定免疫相關(guān)指標(biāo)。頭腎巨噬細(xì)胞免疫指標(biāo)主要測定了氧呼吸爆發(fā)活性、吞噬活性及巨噬細(xì)胞增殖活性；體液免疫指標(biāo)主要測定了血清溶菌酶活力及血清替代途徑補(bǔ)體活力。另外分別在實驗開始后的第二周和第四周進(jìn)行攻毒試驗，攻毒試驗所用的菌為鰻弧菌，分別從每個處理隨即選取12條魚進(jìn)行攻毒試驗，每尾魚注射鰻弧菌Iml (約IO8Cfu),記錄攻毒后14天的死亡率并計算累計死亡率和相對存活率。研究結(jié)果顯示攝食復(fù)合核苷酸后，牙鲆頭腎巨噬細(xì)胞免疫活力與對照組相比均有不同程度的提高，在實驗梯度范圍內(nèi)，復(fù)合核苷酸添加量為0. 03%實驗組的免疫力影響最明顯。牙鲆血清補(bǔ)體活力與對照組相比也均有不同程度的提高，其中復(fù)合核苷酸添加量為0. 03%實驗組影響最大，且在試驗后第三周影響達(dá)到最大。血清溶菌酶活力的變化與補(bǔ)體活力變化基本一致。攻毒試驗結(jié)果顯示兩次攻毒實驗中，復(fù)合核苷酸添加量為O. 02%實驗組死亡率最低，且隨著濃度的增加，死亡率增加。在兩次攻毒實驗中，同一注射濃度下在第二周的死亡率比第四周低。攻毒試驗結(jié)果與免疫指標(biāo)測定結(jié)果一致。按照實施例1制備的免疫增強(qiáng)劑去掉生物活性肽的配方來配制僅有核苷酸的增強(qiáng)劑，按照上述的條件進(jìn)行養(yǎng)殖實驗，結(jié)果表明去掉生物活性肽的增強(qiáng)劑的免疫效果差于添加組，死亡率高出O. 5-0. 7%。從而證明生物活性肽能夠有效的提高核苷酸的免疫活性。實施例5、實際養(yǎng)殖應(yīng)用實驗地點為山東省鰲山衛(wèi)養(yǎng)殖廠，試驗中將健康牙鲆分為兩組，在魚飼料中使用按照實施例2制備的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑，每公斤飼料中添加O. 3克。投喂3個月后，實驗組10個池中牙鲆平均體重為43±3g，空白對照組牙鲆平均體重為34. 7±4g，試驗組的死亡率比空白組低5. 8%。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑，由如下的重量百分比的物質(zhì)組成胞嘧啶核苷酸55 ·65%、尿嘧啶核苷酸5 15%、胸腺嘧啶核苷酸5 15%、次黃嘌呤核苷酸I 5%，生物活性肽·10 20%o
2.權(quán)利要求1所述的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑的制備方法，首先分別稱取胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、次黃嘌呤核苷酸、生物活性肽，進(jìn)行粉碎成粉狀后過篩,篩網(wǎng)細(xì)度為80-120目，再將粉末進(jìn)行干燥完成制備。
3.權(quán)利要求1所述的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑在制備牙鲆的飼料添加劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的免疫增強(qiáng)劑的使用方法，是將免疫增強(qiáng)劑按每公斤飼料中添加·0.2-0. 5克的劑量來添加到飼料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牙鲆用復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑，由如下的重量百分比的物質(zhì)組成胞嘧啶核苷酸55～65%、尿嘧啶核苷酸5～15%、胸腺嘧啶核苷酸5～15%、次黃嘌呤核苷酸1～5%、生物活性肽10～20%。本發(fā)明的復(fù)合核苷酸免疫增強(qiáng)劑能夠明顯提高牙鲆的攝食和生長，顯著提高牙鲆的細(xì)胞免疫、體液免疫、免疫基因表達(dá)量和疾病抵抗力等。而且，還可以直接添加到牙鲆飼料中，口服投喂；具有無毒副殘留性、無抗藥性，不污染環(huán)境的優(yōu)點。
文檔編號A23K1/16GK103005164SQ20121059422
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者王正麗, 楊寧 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)