專利名稱：含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于復合微生物肥料領域，具體涉及一種含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料及其制備方法和應用。
背景技術：
在我國生態(tài)環(huán)境保護的十大對策中明確提倡要推廣“生態(tài)農(nóng)業(yè)”，保護生態(tài)環(huán)境和農(nóng)田土壤，推動無公害健康食品的生產(chǎn)，保證有足夠數(shù)量有機質返回土壤，以促進生態(tài)系統(tǒng)中生物循環(huán)，達到保持和增強土壤肥力及生物活性目的。微生物菌劑能起到防止病害并且對人畜無毒無害，是優(yōu)質無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的優(yōu)選生產(chǎn)資料。隨著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，特別是綠色有機農(nóng)業(yè)種植面積不斷擴大，將特定微生物菌融入到肥料中來，生產(chǎn)出對土壤有益并且功能全面的肥料產(chǎn)品成為當今肥料生產(chǎn)企業(yè)研制的重點。目前田間對作物施用過量的有機/無機肥料進入土壤后，其殘留物積累到一定程度時對土壤生態(tài)環(huán)境造成危害，且尚未有產(chǎn)品添加產(chǎn)聚谷氨酸的菌株。復合微生物肥料是一種復合肥為基肥，富含多種功能菌的新型無公害生物肥料。其中的功能菌會調(diào)節(jié)土壤菌群的平衡，具有改良土壤結構、提高土壤肥力與產(chǎn)出水平，改善植物品質等作用。尤其添加了聚谷氨酸的生產(chǎn)菌株，其代謝產(chǎn)物聚谷氨酸使其具有更佳的保水、保肥效果。目前對于復合微生物菌肥的研發(fā)已成為趨勢，近年來關于復合微生物菌肥的專利也屢見不鮮，但尚未出現(xiàn)添加聚谷氨酸高產(chǎn)菌株的微生物菌肥的發(fā)明。本發(fā)明在復合生物菌肥的基礎上添加卓效成分Y -聚谷氨酸的生產(chǎn)菌株——地衣芽孢桿菌，使其菌株本身與產(chǎn)物功能相結合，既能抗真菌病害、增產(chǎn)，又有卓越的節(jié)水、省肥效果。良好的生物降解性使微生物肥料不對環(huán)境造成污染，起到好且綠色的肥效作用。Y-聚谷氨酸是自然 界中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的細胞外陰離子型多聚氨基酸，由D型谷氨酸、L型谷氨酸單體之間通過α氨基和Y-羧基以酰胺鍵形式形成的高分子聚合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料及其制備方法，本發(fā)明提供的復合微生物肥料是以有機-無機復合營養(yǎng)素為基肥，添加各類功能微生物和
Y-聚谷氨酸的高產(chǎn)菌株地衣芽孢桿菌，從而有效提高土壤肥力，改善作物生長環(huán)境。本發(fā)明的另一目的是將本發(fā)明所述含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料應用于土壤施肥中。本發(fā)明的技術方案如下:所述含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料的組成包括微生物發(fā)酵菌液和復合營
養(yǎng)素;所述微生物發(fā)酵菌液:復合營養(yǎng)素的質量比為1:1 ;所述微生物發(fā)酵菌液的組成為:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloquefaciens)>巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)四種菌株的發(fā)酵液以1:1:1:1的質量比混合；本發(fā)明所述Y -聚谷氨酸高產(chǎn)菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),通過從納豆中分離得到，于2009年10月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號:CGMCC3336。所述復合營養(yǎng)素包括氮、磷、鉀元素，微量元素，有機質，復合氨基酸，小麥草粉；所述氮元素為尿素、硫酸銨、氯化銨中的至少一種；所述磷元素為磷酸一銨、磷酸二銨、過磷酸鈣、磷酸二氫鉀中的至少一種；所述鉀元素為硫酸鉀、氯化鉀、碳酸鉀、硝酸鉀中的至少一種；所述微量元素組成為:鈣、鎂、硅、鋅、錳、硼、鐵、銅，均以其可溶性化合物的形式添加；所述有機質為腐植酸或可溶性蛋白或兩者的混合物；所述復合氨基酸的組成為:丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸；所述含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料的制備方法如下:(I)斜面活化將4°C斜面保存的地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌菌株活化，后將其分別劃線接種于LB固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h ；(2)種子液制備 挑取活化的菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，370C、180rpm培養(yǎng)20h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液分別以10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，370C，轉速300rpm，通風比1:1，地衣芽孢桿菌發(fā)酵24h-48h后收集發(fā)酵菌液，蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌菌株活化發(fā)酵20h后收集發(fā)酵菌液；所述蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:以質量百分比計，1%葡萄糖，0.6%磷酸氫二鉀，0.3%磷酸二氫鉀，0.15%尿素，0.5%酵母粉，
0.41%。硫酸鎂，其余為水，pH7.0-7.2 ；所述地衣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:以質量百分比計，2%蔗糖、0.4%牛肉膏、2% 谷氨酸鈉、1.2%MgS04.7Η20、0.06%Κ2ΗΡ04.3Η20，其余為水，ρΗ7.5。(4)硅藻土固定在步驟(3)收集的發(fā)酵菌液中加入質量比10%的硅藻土以固定菌體并促進菌體休眠；(5)添加復合營養(yǎng)素將步驟(4)所述四種菌液以1:1:1:1的質量比混合，將復合營養(yǎng)素按照比例添加到混合菌液中，充分混勻；(6)灌裝將上述混勻液體加入經(jīng)紫外消毒的塑料瓶中，貼產(chǎn)品標簽，即得本發(fā)明所述復合微生物肥料。本發(fā)明所述含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料可稀釋適當倍數(shù)后直接噴涂于種植物葉面或直接用于浸種，也可應用于土壤施肥中。有益效果:Y-聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)上具有促進作物生長從而提高作物產(chǎn)量潛在的功能。在
Y-聚谷氨酸浸種的發(fā)芽試驗中發(fā)現(xiàn)，小白菜、小麥、玉米、棉花等中字的芽長、根長、發(fā)芽系數(shù)、淀粉酶活力和過氧化氫酶活力等均有不同程度的提高，說明Y-聚谷氨酸可以提高種子活力。還證明了 Y-聚谷氨酸能提高小白菜的產(chǎn)量，在肥料較貧乏的時候提高產(chǎn)量的幅度更大，具有顯著的保費增效作用。Y-聚谷氨酸對煙草種子的浸種試驗也表明，Y-聚谷氨酸能夠顯著提高煙草的根長、芽長以及各種酶的活性。Y -PGA作為肥料增效劑，具有促進農(nóng)作物對營養(yǎng)的吸收，節(jié)肥增效，增產(chǎn)提質，增強作物抗病能力等功效，并對肥料具有很好的緩釋作用，可降低過量或施用化肥不當?shù)仍斐傻沫h(huán)境污染。Y-PGA還具有多陰電性，能有效阻止化肥中的SO42' CO廣等離子與Ca2+、Mg2+等微量元 素相結合，避免產(chǎn)生低溶解性鹽類的沉淀效應，使作物能更有效吸收土壤中的營養(yǎng)元素，促進作物根系發(fā)育，增強抗病性。對于Pb2+、Cu2+等重金屬離子，Y-PGA有良好的螯合效果，可作為重金屬吸收劑；此外，對酸、堿具有較好的緩沖能力，可有效平衡土壤的酸堿值，避免因長期使用化學肥料造成的土質酸化及土壤板結化。Y-PGA為純天然的生物制劑，可自然分解，生成氨基酸，不會造成對環(huán)境的二次污染。Y-聚谷氨酸的水浸液在土壤中具有一定的保水力和較理想的釋放效果，有明顯的抗旱促苗效應。Y-聚谷氨酸較強的吸水和保水能力，可明顯提高小麥和黑麥草的發(fā)芽率，并可降低用水成本。地衣芽孢桿菌為Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)菌株，地衣芽孢桿菌對植物的真菌性病害有較好的抑制效果。拮抗性強、抗菌譜廣。地衣芽孢桿菌對小麥全蝕病菌、番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、馬鈴薯于腐病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽病菌、柑桔青霉病菌、棉花枯萎病菌等多種病原菌有明顯的抑制作用。另外，由于地衣芽孢桿菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生玉米素、異戊烯基腺嘌呤、玉米素核苷和細胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)齊U，也可作為玉米增產(chǎn)物質使用。綜上所述，在菌肥常用菌種中加入高產(chǎn)Y-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株地衣芽孢桿菌，可起到菌、肥、聚谷氨酸協(xié)同作用，達到更好的效果。本發(fā)明所述地衣芽孢桿菌，Y-聚谷氨酸產(chǎn)量達到42g/L以上。試驗表明，施用了本發(fā)明所述的復合微生物肥料能夠顯著提高油菜的株高、葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖粗和干重；使用其浸種可提高出苗率；對玉米有增產(chǎn)作用；且由于Y-聚谷氨酸的保水、節(jié)水性，可使灌溉用水量節(jié)省10%，降低了成本。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1將地衣芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，轉速300rpm，通風比1:1，發(fā)酵2Γ48小時得發(fā)酵菌液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:以質量百分比計，2%蔗糖、0.4%牛肉膏、2%谷氨酸鈉、1.2%MgS04.7Η20、0.06°/οΚ2ΗΡ04.3Η20，其余為水，ρΗ7.5 ；將巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌的種子液分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，轉速300rpm，通風比1:1，發(fā)酵20h得發(fā)酵菌液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:以質量百分比計，1%葡萄糖，0.6%磷酸氫二鉀，0.3%磷酸二氫鉀，0.15%尿素，0.5%酵母粉，0.41%硫酸鎂，其余為水，PH7.0-7.2 ；上述四種菌株所得發(fā)酵菌液，加質量比10%的硅藻土固定，而后菌液以質量比1:1:1:1 混合；復合營養(yǎng)素各組份的重量份數(shù)為:尿素8份，磷酸一銨4份，硫酸鉀4份，螯合鈣15份，螯合鎂15份，硅酸鈉3份，螯合鋅8份，螯合錳4份，硼酸8份，螯合鐵8份，螯合銅4份，腐植酸0.5份，可溶性蛋白5份，復合氨基酸3份，小麥草粉5份。所述復合氨基酸中各組分的重量份數(shù)為:丙氨酸5份、精氨酸10份、天冬氨酸5份、胱氨酸3份、谷氨酸2份、甘氨酸2份、組氨酸3份、賴氨酸10份、蛋氨酸3份、苯丙氨酸5份、脯氨酸2份、絲氨酸I份、蘇氨酸10份、色氨酸5份、酪氨酸15份、纈氨酸10份；以菌液:復合營養(yǎng)素的質量比為1:1混勻，即得產(chǎn)品I。所述蘇云金芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌菌種購買于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為:CGMCC 1.792，CGMCC 1.1226，CGMCC1.234，購買時間:2012年7月。地衣芽孢桿菌為CGMCC 3336。實施例2微生物菌液的發(fā)酵制備基本同實施例1 ;復合營養(yǎng)素各組 分的重量份數(shù)為:尿素8份，磷酸一銨4份，硫酸鉀4份，磷酸二氫鉀80份，螯合鈣15份，硫酸鎂10份，硅酸鈉3份，硫酸鋅5份，硫酸錳2份，硼酸8份，硫酸亞鐵5份，硫酸銅2.5份，腐植酸0.5份，大豆蛋白胨8份，復合氨基酸2份，小麥草粉3份。所述復合氨基酸各組分的重量份數(shù)為:丙氨酸5份、精氨酸10份、天冬氨酸5份、胱氨酸3份、谷氨酸2份、甘氨酸2份、組氨酸3份、賴氨酸10份、蛋氨酸3份、苯丙氨酸5份、脯氨酸2份、絲氨酸I份、蘇氨酸10份、色氨酸5份、酪氨酸15份、纈氨酸10份；以菌液:復合營養(yǎng)素的質量比為1:1混勻，即得產(chǎn)品2。實施例3微生物菌液的發(fā)酵制備基本同實施例1 ;復合營養(yǎng)素各組分的重量份數(shù)為:尿素88份，磷酸一銨4份，硫酸鉀4份，螯合鈣10份，硫酸鎂6份，螯合鎂6份，硅酸鈉2份，硫酸鋅3份，螯合鋅3份，硫酸錳2份，螯合錳2份，硼酸5份，螯合鐵5份，螯合銅2.5份，腐植酸0.5份，大豆蛋白胨3份，復合氨基酸3份，小麥草粉5份。所述復合氨基酸各組分的重量份數(shù)為:丙氨酸5份、精氨酸10份、天冬氨酸5份、胱氨酸3份、谷氨酸2份、甘氨酸2份、組氨酸3份、賴氨酸10份、蛋氨酸3份、苯丙氨酸5份、脯氨酸2份、絲氨酸I份、蘇氨酸10份、色氨酸5份、酪氨酸15份、纈氨酸10份；以菌液:復合營養(yǎng)素的質量比為1:1混勻，即得產(chǎn)品3。實施例4將產(chǎn)品I以200g/畝的濃度稀釋后施澆于黃瓜，播種前和出苗后各澆I次，每2天施澆清水一次。在苗齡為35d時取樣進行各項指標的測定。
表I本發(fā)明對黃瓜幼苗生長勢的影響
權利要求
1.含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述含聚谷氨酸的復合微生物肥料的組成包括微生物發(fā)酵菌液和復合營養(yǎng)素；所述微生物發(fā)酵菌液:復合營養(yǎng)素的質量比為1:1; 所述微生物發(fā)酵菌液的組成為:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amylolquefaciens)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)四種菌株的發(fā)酵液以1:1:1:1的質量比混合； 所述復合營養(yǎng)素包括氮、磷、鉀元素，微量元素，有機質，復合氨基酸，小麥草粉。
2.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述聚谷氨酸高產(chǎn)菌為地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) CGMCC 3336。
3.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述氮元素為尿素、硫酸銨、氯化銨中的至少一種。
4.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述磷元素為磷酸一銨、磷酸二銨、過磷酸鈣、磷酸二氫鉀中的至少一種。
5.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述鉀元素為硫酸鉀、氯化鉀、碳酸鉀、硝酸鉀中的至少一種。
6.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述微量元素組成為:鈣、鎂、硅、鋅、錳、硼、鐵、銅，均以其可溶性化合物的形式添加。
7.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述有機質為腐植酸或可溶性蛋白或兩者的混合物。
8.根據(jù)權利要求1所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料，其特征在于，所述復合氨基酸的組成為:丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。
9.根據(jù)權利要求1-8任一所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)斜面活化 將4°C斜面保存的地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌菌株活化，后將其分別劃線接種于LB固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h ； (2)種子液制備 挑取活化的菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，370C、180rpm培養(yǎng)20h ； (3)發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液分別以10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，轉速300rpm，通風比1:1，地衣芽孢桿菌發(fā)酵24h-48h后收集發(fā)酵菌液，蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌菌株活化發(fā)酵20h后收集發(fā)酵菌液； 所述蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:以質量百分比計，1%葡萄糖，0.6%磷酸氫二鉀，0.3%磷酸二氫鉀，0.15%尿素，0.5%酵母粉，0.41%0硫酸鎂，其余為水，PH7.0-7.2 ； 所述地衣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:以質量百分比計，2%蔗糖、0.4%牛肉膏、2%谷氨酸鈉、1.2%MgS04.7Η20、0.06°/οΚ2ΗΡ04.3Η20，其余為水，ρΗ7.5。
(4)娃藻土固定在步驟(3)收集的發(fā)酵菌液中加入10%的硅藻土以固定菌體并促進菌體休眠； (5)添加復合營養(yǎng)素 將步驟(4)所述四種菌液以1:1:1:1的質量比混合，將復合營養(yǎng)素按照比例添加到混合菌液中，充分混勻； (6)灌裝。
10.根據(jù)權利要求1-8任一所述的含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料在土壤施肥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含聚谷氨酸高產(chǎn)菌的復合微生物肥料及其制備方法和應用，屬于復合微生物菌肥領域。本發(fā)明將地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌通過液體發(fā)酵制成菌液，與復配的復合營養(yǎng)素按照1:1的質量比混合制成高效液態(tài)復合微生物肥料。本發(fā)明在巨大芽孢桿菌的良好解磷能力、蘇云金芽孢桿菌良好的抗蟲能力以及解淀粉芽孢桿菌良好的降解有機質能力的基礎上，配合地衣芽孢桿菌高產(chǎn)γ-聚谷氨酸卓越的保水、保肥、環(huán)境無污染性，以達到更優(yōu)的肥效及更少的用水，從而形成科學合理的復合肥搭配。
文檔編號C05G3/00GK103204732SQ20121059239
公開日2013年7月17日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權日2012年12月31日
發(fā)明者喬長晟, 王凡, 李雪, 張苗苗, 蓋麗豐, 李政 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司