專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微生物溶菌酶微膠囊及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物制劑和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，具體為一種微生物溶菌酶微膠囊及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)今，水產(chǎn)類(lèi)食品遭受藥物污染與危及人類(lèi)健康的現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，許多國(guó)家已明令禁止或限制抗生素等在飼料中的應(yīng)用，因此，尋找天然安全的抗生素替代物是各國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迫切需要解決的問(wèn)題。微生物溶菌酶是由微生物分泌產(chǎn)生的一種能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶，因其比卵清溶菌酶具有更高的生產(chǎn)率和更廣泛的抑菌譜，近年來(lái)其在食品、醫(yī)學(xué)、酶工程和飼料工業(yè)上倍受關(guān)注，因而將其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素替代物的思路是極具意義的，然而因其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)易受胃腸道環(huán)境的降解而在口服制劑的運(yùn)用中依然受到限制。微膠囊技術(shù)是采用半透囊膜將物質(zhì)包裹在囊內(nèi)形成微膠囊，對(duì)芯材物質(zhì)起保護(hù)及選擇性釋放的作用。其壁材有很多，海藻酸鈉是從褐藻中提取的聚陰離子天然雜多糖，其溶液可與多價(jià)陽(yáng)離子(如Ca2+)交聯(lián)形成“蛋格”結(jié)構(gòu)而瞬時(shí)凝膠化，此反應(yīng)條件溫和，成膜能力強(qiáng)且可降解性較好，因而海藻酸鈉常被用作包埋藥物、蛋白質(zhì)或細(xì)胞的壁材。然而單獨(dú)的海藻酸鈉壁材結(jié)構(gòu)稀疏，因此加入輔助壁材可增加包埋物穩(wěn)定性，提高藥物生物利用率，并且改變藥物釋放速率。殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，能溶于酸性溶液形成陽(yáng)離子基團(tuán)，易與帶負(fù)電荷的海藻酸鈉發(fā)生靜電絡(luò)合，使壁材膜更為致密堅(jiān)固。此兩者均資源豐富，價(jià)廉易得，相容性好，可生物降解，并均有報(bào)道具有免疫促進(jìn)作用而適宜用于飼料添加劑。截止目前，尚未有利用海藻酸鈉/殼聚糖為壁材法制備微生物溶菌酶微膠囊的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種溶菌酶微膠囊。本發(fā)明還提供了上述溶菌酶微膠囊的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的溶菌酶微膠囊制備方法包括如下步驟(I)將海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液滴加到含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，并攪拌；滴加攪拌時(shí)間為10 90分鐘，優(yōu)選為20 50分鐘；優(yōu)選的，所述海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液中，海藻酸鈉含量為O. 01 O. 03g/mL，溶菌酶的活性為5000 10000U/mL ；所述含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，殼聚糖含量為O. 001 O. 006g/mL,氯化鈣含量為O. 01 O. 04g/mL，醋酸的含量為I 5ml/L ;所述殼聚糖的脫乙酰度為75% 95% ;所述的海藻酸鈉與殼聚糖的用量比為1:1 1:10 ;(2)滴加完畢后固化O. 5 4小時(shí)，取固體洗滌，得到溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠；優(yōu)選的，固化時(shí)間為50 70分鐘；(3)溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥；所述預(yù)冷凍溫度為-15 -25 0C，預(yù)凍時(shí)間為6 24h ;冷凍干燥的溫度為-20 -28V，壓力為50 lOOPa，時(shí)間為18 36h。通過(guò)上述方法所制備的溶菌酶微膠囊，以海藻酸鈉/殼聚糖為壁材，其中溶菌酶含量為 20000 30000U/g。上述溶菌酶微膠囊可用于制備魚(yú)飼料，尤其是制備異育銀鯽的飼料，用于異育銀鯽的養(yǎng)殖。在異育銀鯽的飼料中，以溶菌酶計(jì)，溶菌酶的含量為50000 250000U/kg。微生物溶菌酶在經(jīng)過(guò)飼料加工中的高溫?cái)D壓和長(zhǎng)期保存過(guò)程，以及喂食后被魚(yú)體腸道消化環(huán)境的降解破壞而使得酶活損失率大，而達(dá)不到促進(jìn)免疫、防病治病效果，本發(fā)明解決了上述技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)制備一種以海藻酸鈉/殼聚糖為復(fù)合壁材的微生物溶菌酶微膠囊,添加于異育銀鯽飼料，其優(yōu)勢(shì)在于經(jīng)過(guò)飼料加工過(guò)程的高溫?cái)D壓后，依然較高地保留微生物溶菌酶的活性；在常溫保存的過(guò)程中，微生物溶菌酶的穩(wěn)定性可保持半年以上；飼喂養(yǎng)殖中，能經(jīng)受水產(chǎn)動(dòng)物胃中強(qiáng)酸和消化環(huán)境，在腸道中釋放并發(fā)揮有效的促生長(zhǎng)保健效果，長(zhǎng)期服用可以代替或部分代替抗生素對(duì)一些致病菌引起的疾病進(jìn)行防治，解決抗生素使用帶來(lái)的抗藥性和藥物殘留問(wèn)題，也有望運(yùn)用于食品防腐添加劑、醫(yī)療等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面以具體例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例1取100ml 40g/L的海藻酸鈉溶液與100ml 2mg/mL溶菌酶溶液(溶菌酶的活性為5000U/mg)混合均勻，將上述混合溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵滴入到200ml含20g/L氯化鈣和50g/L殼聚糖(脫乙酰度為90%)及5mL/L醋酸的水溶液中，并以180rpm的速度攪拌，蠕動(dòng)泵滴加速度為100滴/min (約4 6mL/min)。約40分鐘后滴加完畢，停止攪拌，固化I小時(shí)后，取固體用蒸餾水洗滌兩次，用紗布浙干。-20°C下預(yù)冷凍12小時(shí)，-25°C、80pa下冷凍干燥24小時(shí)。2%氯化鈣與O. 5%殼聚糖(脫乙酰度為90%)的O. 5% (v/v)醋酸水溶液中并不斷進(jìn)行攪拌，10~6U/4所得到的溶菌酶微膠囊以海藻酸鈉/殼聚糖為壁材，其中溶菌酶含量為23000 27000U/g。在常溫保存的過(guò)程中，微膠囊中溶菌酶的穩(wěn)定性可保持半年以上。實(shí)施例2將上述制得的溶菌酶微膠囊進(jìn)行異育銀鯽養(yǎng)殖試驗(yàn)I材料與方法1.1試驗(yàn)用魚(yú)與飼料制備試驗(yàn)于2011年7月-9月在上海海洋大學(xué)特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。選用當(dāng)年異育銀鯽，放于試驗(yàn)池中用基礎(chǔ)飼料養(yǎng)殖40d，使其適應(yīng)試驗(yàn)條件，并消除試驗(yàn)魚(yú)因營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境造成的差異。試驗(yàn)分為11個(gè)組每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾(初重28. 11±2. 14g)。根據(jù)異育銀鯽的營(yíng)養(yǎng)需求制定飼料配方，制作基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加溶菌酶制品和其包被品，其中溶菌酶制品即酶活為5000U/mg的微生物溶菌酶晶體粉末；包被品是將微生物溶菌酶微膠囊用高速粉碎機(jī)粉碎成40目的粉末(溶菌酶含量為25000U/g)。溶菌酶組設(shè)置 5 個(gè)梯度10mg/kg,20mg/kg,30mg/kg,40mg/kg 和 50mg/kg (酶制劑 1-5);溶菌酶包被品組根據(jù)與溶菌酶組初始酶活相等的原則，將添加量分別設(shè)置為2g/kg,4g/kg,6g/kg,8g/kg和lOg/kg (包被組1-5)。以包被品lOg/kg組為對(duì)比，不足部分用纖維素補(bǔ)充。飼料原料與溶菌酶或者溶菌酶微膠囊逐級(jí)混合后制成直徑O. 5cm顆粒，常溫密閉保存。1. 2飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)水源為經(jīng)過(guò)120目篩絹過(guò)濾后的天然河水，室外養(yǎng)殖(溫度21_34°C)，每組網(wǎng)箱2m*0. 75m*1. 0m,間斷性充氣，使溶解氧控制在6_12mg/L，氨氮〈O. 5mg/L。每周換水1/2左右。試驗(yàn)過(guò)程中每天按照魚(yú)體總重的3%左右投喂，參照前一天的攝食情況，酌情增加或減少投餌量。每天投喂三次(7:00，11:00，17:00)，每次分2輪投喂，每次投喂時(shí)間控制在30分鐘左右。投喂完I小時(shí)檢查攝食情況，以無(wú)殘餌為宜。1. 3實(shí)驗(yàn)儀器與藥品1. 3.1主要儀器冰箱(_20°C );冷凍干燥機(jī)；雙螺桿制粒機(jī)；固體樣品粉碎機(jī)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；高速臺(tái)式離心機(jī)；電子天平；熱恒溫水浴鍋；生化培養(yǎng)箱；高壓滅菌鍋；722分光光度計(jì)；移液器；玻璃勻漿管。1. 3. 2 藥品溶菌酶試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、淀粉酶試劑盒、蛋白酶試劑盒購(gòu)于南京建成生物過(guò)程研究所。1. 4測(cè)定指標(biāo)1. 4.1生產(chǎn)性能養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)組采樣10尾分別稱(chēng)重測(cè)量體長(zhǎng)，并稱(chēng)取每個(gè)重復(fù)組總重。計(jì)算餌料系數(shù)、相對(duì)增重率。增重率(％ )=(末體重-初始體重)/初始體重X 100飼料系數(shù)(FCR) =投喂飼料總重/(終末總重-初始總重)1. 4. 2內(nèi)源酶指標(biāo)養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，采取試驗(yàn)魚(yú)的腸道和肝胰臟測(cè)定其淀粉酶和蛋白酶的活力，采全血制備血清后測(cè)定其溶菌酶、S0D，采集脾臟測(cè)定其溶菌酶和SOD活力。1. 4. 3攻毒試驗(yàn)養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每組選取體質(zhì)健壯，規(guī)格均勻的試驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行嗜水氣單胞菌的抗感染試驗(yàn)。每組選取32尾，其中30尾隨機(jī)分成3組，每組10尾。試驗(yàn)魚(yú)個(gè)體間體重?zé)o顯著差異。嗜水氣單胞菌取自上海海洋大學(xué)水生動(dòng)物病原庫(kù)，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)48h后，用生理鹽水沖洗稀釋至109cfu/mL備用。每尾注射O. 5mL菌液，采用腹腔注射。另選取剩下2尾，注射O. 5mL生理鹽水，作為空白對(duì)照。試驗(yàn)魚(yú)在80X50X45cm的周轉(zhuǎn)箱內(nèi)暫養(yǎng)48h后，開(kāi)始試驗(yàn)，試驗(yàn)期間水溫18-23°C，觀察120h內(nèi)各組死亡情況(120h后試驗(yàn)魚(yú)的死亡趨于穩(wěn)定)并記錄。試驗(yàn)期間全部投喂基礎(chǔ)組飼料。1. 5數(shù)據(jù)處理用SPSS 17. O軟件進(jìn)行單因素方差分析，影響顯著者采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。2 結(jié)果
2.1溶菌酶對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能的影響表I顯示，包被品組相對(duì)增長(zhǎng)率除I組和4組相對(duì)基礎(chǔ)組有顯著提高，其他組無(wú)顯著差異；溶菌酶組相對(duì)增重率5組與基礎(chǔ)組有顯著的降低而溶菌酶I組相對(duì)增重率相對(duì)基礎(chǔ)組有顯著提高，其他組和基礎(chǔ)組無(wú)顯著差異。包被品組餌料系數(shù)1、2組和3組相對(duì)基礎(chǔ)組有顯著降低，5組相對(duì)基礎(chǔ)組有顯著的升高；溶菌酶組除5組相對(duì)基礎(chǔ)組有顯著的提高，其他組相對(duì)基礎(chǔ)組無(wú)顯著差異。在相同的酶活條件下，溶菌酶包被品對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)性能的影響對(duì)比相同酶活溶菌酶組有明顯的優(yōu)勢(shì)，在一定劑量范圍內(nèi)可有效降低餌料系數(shù)。表I溶菌酶及其包被品對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能的影響
權(quán)利要求
1.一種制備溶菌酶微膠囊的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液滴加到含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，并攪拌； (2)滴加完畢后固化0.5 4小時(shí)，取固體洗滌，得到溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠； (3)溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。
2.權(quán)利要求1所述制備溶菌酶微膠囊的方法，其特征在于，步驟(I)中所述海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液中，海藻酸鈉含量為0. 01 0. 03g/mL，溶菌酶的活性為5000 10000U/mLo
3.權(quán)利要求1所述制備溶菌酶微膠囊的方法，其特征在于，步驟(I)中所述含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，殼聚糖含量為0. 001 0. 006g/mL，氯化鈣含量為0. 01 0. 04g/mL,醋酸的含量為I 5ml/L ;所述殼聚糖的脫乙酰度為75% 95% ;所述的海藻酸鈉與殼聚糖的用量比為1:1 1:10。
4.權(quán)利要求1所述制備溶菌酶微膠囊的方法，其特征在于，步驟(I)中的滴加攪拌時(shí)間為10 90分鐘。
5.權(quán)利要求1所述制備溶菌酶微膠囊的方法，其特征在于，步驟(2)所述的固化時(shí)間為50 70分鐘。
6.權(quán)利要求1所述制備溶菌酶微膠囊的方法，其特征在于，步驟(3)所述預(yù)冷凍溫度為-15 _25°C，預(yù)凍時(shí)間為6 24h ;冷凍干燥的溫度為-20 _28°C，壓力為50 lOOPa，時(shí)間為18 36h。
7.一種溶菌酶微膠囊，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求1 任一項(xiàng)所述的方法制備，以海藻酸鈉/殼聚糖為壁材，其中溶菌酶含量為20000 30000U/g。
8.權(quán)利要求7所述溶菌酶微膠囊在制備魚(yú)飼料方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述溶菌酶微膠囊在制備異育銀鯽的飼料方面的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述溶菌酶微膠囊在制備異育銀鯽飼料方面的應(yīng)用，其特征在于，所述異育銀鯽的飼料中，以溶菌酶計(jì)，溶菌酶的含量為50000 250000U/kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物制劑和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，公開(kāi)了一種溶菌酶微膠囊，通過(guò)以下方法制備(1)將海藻酸鈉與溶菌酶的混合溶液滴加到含有殼聚糖和氯化鈣的醋酸溶液中，并攪拌；(2)滴加完畢后固化0.5～4小時(shí)，取固體洗滌，得到溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠；(3)溶菌酶/海藻酸鈉/殼聚糖凝珠預(yù)冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。這種微膠囊用于制備魚(yú)飼料，在經(jīng)過(guò)飼料加工過(guò)程的高溫?cái)D壓后，依然較高地保留微生物溶菌酶的活性；在常溫保存的過(guò)程中，微生物溶菌酶的穩(wěn)定性可保持半年以上；飼喂養(yǎng)殖中，能經(jīng)受水產(chǎn)動(dòng)物胃中強(qiáng)酸和消化環(huán)境，在腸道中釋放并發(fā)揮有效的促生長(zhǎng)保健效果。
文檔編號(hào)A23K1/18GK103005168SQ20121058028
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者李曉暉, 費(fèi)國(guó)琴, 華雪銘, 邢思華, 寧喜斌 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)