專利名稱：一種檢測(cè)石榴枯萎病菌致病蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，具體涉及一種在芋頭葉片上檢測(cè)石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性的方法，屬于植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
石榴枯萎病為最近幾年在中國(guó)云南和四川省石榴種植發(fā)生的新病害，已經(jīng)造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，這種病害為甘薯長(zhǎng)_殼菌(Ceratocystis fimbriata)引起(Huang等， 2003)。2004年在云南省蒙自縣石榴枯萎病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1500萬(wàn)元以上，其中部分重病區(qū)病株率高達(dá)29. 2%，特別是掛果石榴樹的大面積死亡，造成石榴產(chǎn)業(yè)的毀滅性損失(鄧吉等，2005)。在石榴枯萎病菌致病性的研究中，通常用石榴枯萎病菌的孢子在石榴植株莖干上進(jìn)行傷口接種并觀察產(chǎn)生癥狀的方法來(lái)確定其致病性，接種后產(chǎn)生的病斑大小為鑒定不同石榴枯萎病菌菌株致病力差異檢測(cè)的主要手段。已有報(bào)道表明來(lái)自中國(guó)石榴枯萎病菌和芋頭黑腐病菌的C. fimbriata對(duì)中國(guó)石榴寄主植物和芋頭寄主植物具有一樣的強(qiáng)致病性，這表明它們之間可以互相侵染對(duì)方的寄主植物，沒有表現(xiàn)出寄主?；?Huang等， 2008;余磊，2010)。并且它們?cè)诜謩e接種芋頭植株后，生理生化水平上的反應(yīng)也具有一致性(余磊等，2011; 2011)。近年來(lái)的研究表明，病原菌產(chǎn)生的蛋白與寄主抗性基因蛋白產(chǎn)物的分子互作是病原菌與寄主互作機(jī)制的核心。與孢子接種的目的類似，這些蛋白的功能也要通過在寄主植物上接種后觀察致病的癥狀來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)中石榴枯萎病菌致病分泌蛋白主要來(lái)源于其菌絲體產(chǎn)生的蛋白，且對(duì)石榴枯萎病菌進(jìn)行液體培養(yǎng)是獲得致病分泌蛋白的主要方法。還未見到專門用于石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性檢測(cè)方法的文獻(xiàn)和專利報(bào)道。因石榴為木本植物，對(duì)其莖干進(jìn)行傷口接種存在致病性反應(yīng)周期較長(zhǎng)、癥狀不易觀察等局限。這導(dǎo)致了無(wú)法像石榴枯萎病孢子接種那樣通過測(cè)量病斑長(zhǎng)度，來(lái)對(duì)石榴枯萎病菌產(chǎn)生的不同致病性分泌蛋白的致病力差異進(jìn)行定量分析 ，限制了對(duì)石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病機(jī)制的研究。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報(bào)道。
參考文獻(xiàn)
Huang Q, Zhu Y Y, Chen H R, Wang Y Y, Liu YL, Lu W J, Ruan X Y. 2003.First Report of Pomegranate Wilt Caused by Ceratocystis fimbriata in Yunnan, China[J]. Plant Disease, 87，1150.
Huang Q，Wang Y Y，Zhao Y Y，Jiao Y X，Li X F，Chen H R，and Zhu Y Y. 2008. First report of taro black rot caused by Ceratocystis fimbriata in China[J]. Plant Pathology, 57: 780.
鄧吉，陸進(jìn)，李健強(qiáng)，潘俊，朱春雨，吳新平.2005.石榴枯萎病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，38(12): 2440-2445.
余磊.2010.云南農(nóng)業(yè)大學(xué).三種寄主的甘薯長(zhǎng)喙殼病菌研究[博士論文].
余磊，高玲玲，郭建偉，陳小龍，李秀芬，劉芬，黃瓊，陳海如.2011.甘薯長(zhǎng)喙殼侵染對(duì)甘薯塊根抗氧化酶活性影響.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).19(1): 141-145.
余磊，陳小龍，郭建偉，高玲玲，李秀芬，劉芬，黃瓊，陳海如.2011.不同寄主甘薯長(zhǎng)_殼菌侵染對(duì)芋頭抗氧化酶活性影響.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).30(1):61-65.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在芋頭葉片上檢測(cè)石榴枯萎病菌致病蛋白的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
(I)芋頭生長(zhǎng)至第3片時(shí)，選擇完全展開的健康葉片進(jìn)行接種；
(2)選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設(shè)備分別等距形成直徑2 mm的壓傷斑3個(gè)，在致傷處接種致病分泌蛋白，該致病分泌蛋白是石榴枯萎病菌在配方為蔗糖20g/L，酵母提取物5g/L，pH 6. 3的蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)后獲得，蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I ;
(3)接種后96小時(shí)在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形或圓形，測(cè)量向葉尖和葉基方向延伸的最長(zhǎng)值作為病斑的長(zhǎng)度值；
(4)將石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性大小按病斑長(zhǎng)度值劃分的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行致病性弱、中等和強(qiáng)的分類；其分類標(biāo)準(zhǔn)為病斑長(zhǎng)度為3. 5mm至4mm之間為弱致病性；病斑長(zhǎng)度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長(zhǎng)度大于5.1mm為強(qiáng)致病性。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于解決了石榴枯萎病菌分泌蛋白致病性檢測(cè)的問題。能夠在芋頭葉片上形成規(guī)則的接種點(diǎn)而對(duì)其組織沒有明顯的傷害，接種石榴枯萎病菌的致病分泌蛋白后形成的病斑與孢子接種的癥狀一致，沿葉脈方向延伸的病斑長(zhǎng)度即作為不同致病分泌蛋白致病力大小比較的依據(jù)。具體實(shí)施方案
實(shí)施例一
芋頭生長(zhǎng)至第3片葉完全展開時(shí)接種。選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設(shè)備分別在葉片主脈兩邊近葉緣4cm處和葉尖3cm處形成直徑2mm的壓傷斑 3個(gè)，將培養(yǎng)后的石榴枯萎病菌轉(zhuǎn)入到蔗糖液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)后得到弱致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分別在芋頭植株的葉片致傷處接種，用滅菌去離子水接種作為對(duì)照。蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I。接種后96小時(shí)在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形， 測(cè)量向葉尖和葉基方向延伸的最長(zhǎng)值作為病斑的長(zhǎng)度值。按照病斑長(zhǎng)度為2. 5_至 4mm之間為弱致病性；病斑長(zhǎng)度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長(zhǎng)度大于5.1mm為強(qiáng)致病性的分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該分泌蛋白的致病性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表I。
實(shí)施例二
芋頭生長(zhǎng)至第3片葉完全展開時(shí)接種。選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設(shè)備分別在葉片主脈兩邊近葉緣4cm處和葉尖3cm處形成直徑2mm的壓傷斑 3個(gè)，將培養(yǎng)后的石榴枯萎病菌轉(zhuǎn)入到蔗糖液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)后得到中等致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分別在芋頭植株的葉片致傷處接種，用滅菌去離子水接種作為對(duì)照。蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I。接種后96小時(shí)在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形，測(cè)量向葉尖和葉基方向延伸的最長(zhǎng)值作為病斑的長(zhǎng)度值。按照病斑長(zhǎng)度為2. 5mm至4mm之間為弱致病性；病斑長(zhǎng)度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長(zhǎng)度大于5.1mm 為強(qiáng)致病性的分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該分泌蛋白的致病性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表I。
實(shí)施例三
芋頭生長(zhǎng)至第3片葉完全展開時(shí)接種。選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設(shè)備分別在葉片主脈兩邊近葉緣4cm處和葉尖3cm處形成直徑2mm的壓傷斑 3個(gè)，將培養(yǎng)后的石榴枯萎病菌轉(zhuǎn)入到蔗糖液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)后得到強(qiáng)致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分別在芋頭植株的葉片致傷處接種，用滅菌去離子水接種作為對(duì)照。蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I。接種后96小時(shí)在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形，測(cè)量向葉尖和葉基方向延伸的最長(zhǎng)值作為病斑的長(zhǎng)度值。按照病斑長(zhǎng)度為2. 5_至 4mm之間為弱致病性；病斑長(zhǎng)度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長(zhǎng)度大于5.1mm為強(qiáng)致病性的分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該分泌蛋白的致病性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表I。
表I石榴枯萎病菌致病分泌蛋白在芋頭(香芋)接種后病斑的長(zhǎng)度
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下a.芋頭生長(zhǎng)至第3片時(shí)，選擇完全展開的健康葉片進(jìn)行接種；b.選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設(shè)備分別形成直徑2mm的壓傷斑3個(gè)，在致傷處接種致病分泌蛋白，該致病分泌蛋白是石榴枯萎病菌在配方為蔗糖 20g/L，酵母提取物5g/L，pH 6. 3的蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)后獲得，蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I ;c.接種后96小時(shí)在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形或圓形，測(cè)量向葉尖和葉基方向延伸的最長(zhǎng)值作為病斑的長(zhǎng)度值；d.將石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性大小按病斑長(zhǎng)度值劃分的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行致病性弱、 中等和強(qiáng)的分類；其分類標(biāo)準(zhǔn)為病斑長(zhǎng)度為3. 5mm至4mm之間為弱致病性；病斑長(zhǎng)度在4.1mm至5_之間為中等致病性；病斑長(zhǎng)度大于5.1mm為強(qiáng)致病性。
全文摘要
一種檢測(cè)石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，屬于植物保護(hù)領(lǐng)域。方法為芋頭生長(zhǎng)至第3片時(shí)，選擇完全展開的健康葉片接種。在接種芋頭葉片的邊緣近中間部分，致傷直徑2 mm的壓傷斑3個(gè)，將石榴枯萎病菌液體培養(yǎng)后得到的分泌蛋白在致傷處接種，蛋白的接種濃度為50μg·ml-1，接種體積為5μl。接種后96小時(shí)在芋頭葉片上形成橢圓形或圓形的病斑，測(cè)量向葉尖和葉基方向延伸的最長(zhǎng)值作為病斑的長(zhǎng)度值，該值是比較不同蛋白致病力大小的依據(jù)。其分類標(biāo)準(zhǔn)為病斑長(zhǎng)度為3.5mm至4mm為弱致病性；病斑長(zhǎng)度在4.1mm至5mm為中等致病性；病斑長(zhǎng)度大于5.1mm為強(qiáng)致病性。該方法解決了石榴枯萎病菌分泌蛋白致病性檢測(cè)的問題，對(duì)于研究石榴枯萎病菌致病相關(guān)分泌蛋白的功能具有重要意義。
文檔編號(hào)A01G7/06GK103026910SQ201210580190
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者余磊, 趙建榮, 徐勝光, 吳旭, 蘇源, 劉佳妮, 陳澤斌 申請(qǐng)人:昆明學(xué)院