專利名稱：一種抗菌蛋白has1編碼基因的克隆、表達(dá)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)生的對(duì)植物病原菌存在抑菌活性的新抗菌蛋白，更具體地說，涉及一種來源于微生物的新抗菌蛋白的鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明是建立在生防菌株HAS對(duì)甘蔗黑穗病菌具有很好抑制作用的基礎(chǔ)之上。
背景技術(shù)：
甘鹿黑穗病是由scitaminea Sydow.引起的一種真菌病害,屬擔(dān)子菌綱黑粉菌屬。該病害最早是在1877年南非納塔爾發(fā)現(xiàn)，隨后在東半球的亞洲和非洲的大部分國家均有報(bào)道。1940年在美洲阿根廷發(fā)生，隨后西半球也發(fā)生該病害。20世紀(jì)70-90年代，夏威夷、弗羅里達(dá)、摩洛哥、澳大利亞等國家、地區(qū)也相繼有該病害發(fā)生的報(bào)道。中國于1932年在廣州發(fā)現(xiàn)該病害，之后各地也都出現(xiàn)該病。特別是近年來，隨著蔗種無性繁殖栽培技術(shù)的推廣，蔗種頻繁引進(jìn)調(diào)運(yùn)，蔗田長期連作同一品種以及宿根蔗年限的逐漸延長，造成甘蔗黑穗病在我國廣西、云南、廣東、福建、海南等省蔗區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，造成的損失多達(dá)10-30%,嚴(yán)重的宿根蔗幾乎絕收。甘蔗黑穗病危害嚴(yán)重，但對(duì)其的防治效果不理想。生物防治因?qū)Νh(huán)境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地發(fā)揮作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滯不前。國內(nèi)外也有利用微生物對(duì)甘蔗黑穗病菌孢子進(jìn)行作用的報(bào)道。國外，Sinha和Singh報(bào)道四種真菌應(yīng) moniliforme [Gibberella fujikuroi] var. subglutinans,Aspergillus ni ger, A. flavus and Penici 11 iums^·)對(duì)甘鹿黑穗病的黑鞭的產(chǎn)生和對(duì)冬孢子萌發(fā)的抑制作用。國內(nèi)，廣西大學(xué)廖詠梅等采集甘蔗苗期、生長期的甘蔗土壤、健株及病株的種蔗、葉、莖、芽、根和土壤中分離篩選到一些對(duì)黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，探討得到相關(guān)抑制因子的基因。但未見用生物防治措施有效控制黑穗病的系統(tǒng)報(bào)道。迄今為止，尚未見到利用微生物及其生防制劑成功用于防治甘蔗黑穗病的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列及其在防治甘蔗黑穗病方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具體如
下
長度750bp
類型核酸 鏈型雙鏈 形態(tài)線性
分子類型基因組DNA序列描述
ATGGCGAAACCACTATCAAAGGGGGGAATTTTGATGAAAAAAGTATTGATTGCAGGTGCAGTAGGAACAGCA
GTTCTTTTCGGAACCCTTTCATCAGGTATACCAGGCTTACCAGCGGCAGACGCTCAAGTCGCAAAAGCAGCATCCCA
GCTGCCTAACGGAATCGGCGGCCGTGCCTACCTGAACAGTACGGGCGCCGTTTTTACAGCTAAAATCACGCTTCCTG
AAACTGTCAAAAATAACGACTCGGTCTCTACTCCCTATATTTATTCAGGCTTTAGGGCATCAAGCGGAACTGAAGCC
GATATCGGGCTTCAGTACAGCAAACAATACAACGTCTGGAAGCCCCTCATGAAGGTTGGGTCCAAAAATGAAGAAAC
GTACATCGAAGGAAAAGATAAATTCACATACAATAAAGGCTTCCGCCCTGGAAGCACAGTCCAAATGACAATCTATA
AAAATTTAAGCGGCAATACGCGCATGACCCTTTGGGGAACGAACAATGACGGCTACACCGGAAGGATTATCACAGAA
ATTCAAGGAACCAACATCGGCACGATTTCAAAATGGAAAACCCTTGCTACCGCGGCTGTTTCGTATGAAAGCCAGCG
TGATGCGATCAAAGCAACCTTTTCGACATCTTTTAACAACATCACAATCGACAATAAAGCCGTCACTCCTGTGGTAG
ATACACAGGATTTCGCAAAGGTTTCAGTTGCAGGAAATAACGTTACGATCTCTGTTAATAAAo所述的抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具體如下
長度250 類型氨基酸 鏈型單鏈 形態(tài)線性 分子類型蛋白 序列描述
MAKPLSKGGILMKKVLIAGAVGTAVLFGTLSSGIPGLPAADAQVAKAASQLPNGIGGRAYLNSTGAVFTAKITLPETVKNNDSVSTPYIYSGFRASSGTEADIGLQYSKQYNVWKPLMKVGSKNEETYIEGKDKFTYNKGFRPGSTVQMTIYKNLSGNTRMTLWGTNNDGYTGRIITEIQGTNIGTISKWKTLATAAVSYESQRDAIKATFSTSFNNITIDNKAVTPVVDTQDFAKVSVAGNNVTISVNK。一種原核表達(dá)載體，它含有上述抗菌蛋白編碼基因HASl的基因序列。所述抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的應(yīng)用，及在轉(zhuǎn)基因作物育種中的應(yīng)用。本發(fā)明在研究微生物對(duì)甘蔗黑穗病進(jìn)行生物防治時(shí)，成功分離到一株對(duì)甘蔗黑穗病菌有較好抑制作用和防治效果的生防菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Mcillus sub tills )HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)；保藏編號(hào)=CGMCC NO. 6590。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌HAS菌株，分離自我國海南省蔗區(qū)的甘蔗根際土壤，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化和16S rDNA序列鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌心subti I is)的一個(gè)新菌株，命名為枯草芽孢桿菌UaciJAz1Ssubtilis)WkS0本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5· subtilis)WkS的基本生物學(xué)特性為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9X1. 8 2. 4 Mm之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運(yùn)動(dòng)性。在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。本發(fā)明通過對(duì)生防菌株HAS抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，成功分離到一種抗菌蛋白，并通過其氨基酸測(cè)序結(jié)果推到出其核苷酸序列，進(jìn)行特異性表達(dá)引物的設(shè)計(jì)，獲得了其全長基因編碼序列。通過原核表達(dá)證明該編碼基因表達(dá)的蛋白存在生物活性，通過網(wǎng)上比對(duì)，該編碼基因序列同枯草芽孢桿菌基因組序列同源性達(dá)99%，是一個(gè)沒有注釋功能的編碼基因序列，因此暫把該編碼基因命名為HASl，新的抗菌蛋白命名為抗菌蛋白HASl。對(duì)于甘蔗黑穗病的防治，到目前為止還沒有一種有效的防治措施，抗病育種被認(rèn)為是一種最為有效的方法，但由于抗原材料的缺乏，進(jìn)展緩慢。本發(fā)明的技術(shù)方案一是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的抗菌蛋白，二是可以為今后的抗病育種提供一個(gè)新的抗原材料。
圖1為抗菌蛋白HASl編碼基因HASl的PCR擴(kuò)增，圖中M為Marker，1、2、3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2為原核表達(dá)載體pET32a-HASl結(jié)構(gòu) 圖3為編碼序列的網(wǎng)上比對(duì)結(jié)果，其結(jié)果表明該序列為枯草芽孢桿菌基因組序列的一部分，但沒有注釋功能，即是一個(gè)未知功能的序列；
圖4為抗菌蛋白HASl編碼基因HASl的原核表達(dá)，泳道I和2為空白載體；泳道3為Marker ;泳道4、5、6、7、8、9、10分別為加入IPTG誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7、8h后的表達(dá)結(jié)果；
圖5為表達(dá)產(chǎn)物對(duì)甘蔗黑穗病菌的抑制活性，左為原始表達(dá)載體表達(dá)后的產(chǎn)物(用作對(duì)照)，右為構(gòu)建有HASl基因序列的表達(dá)載體表達(dá)廣物；由圖可看出在右側(cè)的表達(dá)廣物周圍有一明顯抑制甘蔗黑穗病菌的抑菌圈，而左側(cè)的對(duì)照組沒有，這充分說明該表達(dá)產(chǎn)物具有抑制甘蔗黑穗病菌的能力，具有生物抑菌活性；
圖6為HASl蛋白的網(wǎng)上同已知毒蛋白的比對(duì)結(jié)果，其結(jié)果表明，HASl蛋白與已知的毒蛋白沒有相似性，可以不經(jīng)改造直接使用的蛋白；
圖7為HASl蛋白同網(wǎng)上有致敏性蛋白的比對(duì)結(jié)果，結(jié)果表明該蛋白同致敏性蛋白的相似性為0，該蛋白沒有致敏性；
圖8為HASl蛋白同網(wǎng)上有抗?fàn)I養(yǎng)因子的蛋白的比對(duì)結(jié)果，結(jié)果表明該蛋白沒有抗?fàn)I養(yǎng)因子的特性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例11、植物病原真菌拮抗菌的篩選及其鑒定
菌株篩選稱取5克根際土壤(我國海南省臨高縣甘蔗黑穗病發(fā)生嚴(yán)重的地塊中甘蔗植株的根際土壤)，放入有IOOml無菌水的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后，靜置15min。取Iml稀釋至10_4、10_5、10_6濃度梯度，從各濃度梯度懸浮液中取O. 1ml，用無菌涂棒涂于LB培養(yǎng)基(配方為每升含有蛋白胨10g， 酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉12g，pH7.0 7. 2)平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天，挑取菌落形態(tài)不同的菌株再次劃線純化保存?zhèn)溆谩Ｔ诘购玫腜DA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超凈工作臺(tái)內(nèi)晾干后，用無菌牙簽點(diǎn)接篩選純化后的菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，篩選抑菌作用最強(qiáng)(抑菌活性最強(qiáng))的菌株，結(jié)果得到一株對(duì)甘蔗黑穗病菌有很強(qiáng)拮抗作用的菌株，將該菌株命名為枯草芽孢桿菌(feci77心HAS，其已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)=CGMCCNo. 6590。菌株HAS的基本生物學(xué)特性革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9 X1. 8 2.4 Mffl之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運(yùn)動(dòng)性。在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。菌株16S rDNA保守序列的測(cè)定將篩選得到的菌株(枯草芽孢桿菌UaciJAz1S仰辦HAS)的基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA序列通用引物P0、P6作為引物，PCR擴(kuò)增出約1. 5kb左右的產(chǎn)物片段，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增出的序列長度為1518個(gè)堿基；將該序列通過互聯(lián)網(wǎng)比對(duì)(http: / /www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/B last, cgi),擴(kuò)增的片段序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA部分序列的同源性達(dá)98%以上，確定該菌株歸屬為枯草芽抱桿菌(也<^77心subtilis、。2、菌株HAS抑菌功能蛋白的分離
將菌株HAS在LB培養(yǎng)基平板上活化，然后接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中170rpm下培養(yǎng)36h，除菌體，在上清液中加入硫酸銨至硫酸銨飽和度80%，4°C冰箱內(nèi)靜置過夜后離心收集蛋白，用O. OlM PBS (磷酸緩沖液，pH7. O)溶解蛋白后將蛋白液分為兩份，一份直接用來做抑菌試驗(yàn)，另一份100°C水浴30分鐘后離心除去變性蛋白，做抑菌實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行PAGE電泳，結(jié)果經(jīng)100°C水浴30分鐘后的那份蛋白液同不經(jīng)處理的蛋白液具有基本相同的抑菌作用，PAGE電泳后得到單一條帶的蛋白帶，將該蛋白帶切下來后送去測(cè)序，得到一個(gè)同源性為58%的氨基酸序列，同時(shí)推導(dǎo)出其核苷酸序列。
3、抗菌蛋白HASl編碼基因的克隆 通過網(wǎng)上比對(duì)，設(shè)計(jì)引物如下
HASF 5’ -TAAGGATCCATGGCGAAACCACTATCAAAG-3’
HASR: 5’ -GGAGAGCTCTTATTTATTAACAGAGATCG-3’
以菌株HAS基因組DNA為模板，擴(kuò)增菌株HAS的抗菌蛋白HASl編碼基因片段。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為750bp左右。PCR反應(yīng)體系25 μ L，內(nèi)含IOXbuffer (含1. 5 mmol/L Mg2+) 2. 5μ L, dNTPs(2. 5 mmol/L each) 2 μ L、HASF (10 μ mol/L) I μ L、HASR (10 μ mol/L)lyL、Taq 酶(5 U/μ L) 0· 15 μ L、模板 DNA IyUddH2O 17. 35 μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C3min，94°C lmin,53°C 50s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C下延伸 lOmin。所得到的 PCR產(chǎn)物在1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)，將得到的純化PCR產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci，挑陽性克隆并送上海生工生物有限公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果序列進(jìn)行分析，得到了抗菌蛋白HASl編碼基因的全長序列，為一個(gè)750bp長片段的完整ORF閱讀框，編碼249個(gè)氨基酸，結(jié)果見圖1和2。將該序列用BLAST 軟件在線分析(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/Blast.cgi)進(jìn)行同源性測(cè)定，以確定該編碼序列的同源序列，同時(shí)尋找其有關(guān)序列的相關(guān)信息，比對(duì)結(jié)果見圖3。經(jīng)過比較其有關(guān)序列信息，該基因序列為枯草芽孢桿菌全基因組序列的一部分，同時(shí)該有關(guān)序列的信息表明，該基因是一段沒有被注釋功能的基因，表明該編碼基因表達(dá)的產(chǎn)物可能是一個(gè)未注釋功能的新的抗菌蛋白。4、抗菌蛋白HASl編碼基因的原核表達(dá)及功能驗(yàn)證
提取陽性克隆質(zhì)粒PMD19-T/HAS1，經(jīng)及麗Y I和5^ I雙酶切后電泳回收小片段，將實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)載體pET32a質(zhì)粒同樣經(jīng)及麗Y I和fee I雙酶切后電泳回收大片段，使用連接試劑盒將得到的小片段和大片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)細(xì)胞BL2KDE3)，挑取陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將證實(shí)為陽性克隆的菌落接種于裝有200ml新鮮無菌的LB液體培養(yǎng)基(內(nèi)含Amp+50 μ mol/mL和IPTGO. 01 μ mol/mL)的三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在37°C恒溫?fù)u床上170rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)后離心除去菌體，加硫酸銨至80%飽和度，靜置過夜后12000rpm離心收集蛋白，用2ml0. Olmol/L磷酸緩沖液(pH7. O)充分溶解，同時(shí)以轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET32a的大腸桿菌表達(dá)細(xì)胞BL21 (DE3)的菌落的培養(yǎng)基收集蛋白為對(duì)照，在混有甘蔗黑穗病菌孢子的固體LB平板上，放置兩個(gè)滅菌的牛津杯，分別加入上述收集到的兩種蛋白液各100 μ L，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，做抑制甘蔗黑穗病菌的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，加入抗菌蛋白HASl編碼基因的原核表達(dá)產(chǎn)物的牛津杯周圍出現(xiàn)明顯的抑制圈，表明該蛋白液對(duì)甘蔗黑穗病菌有抑制活性，而對(duì)照組沒有，這充分表明了抗菌蛋白的生物抑菌活性，結(jié)果見圖4和5。5、抗菌蛋白HASl的毒理學(xué)分析
以O(shè)ECD文件為參考，以抗菌蛋白HASl蛋白為目標(biāo)，在NCBI中檢索已知毒蛋白與其氨基酸相似性進(jìn)行比較，其結(jié)果見圖6。從圖中可知，抗菌蛋白HASl為一個(gè)新的抗菌蛋白，其編碼基因與已知的毒蛋白相似性極低，具有毒性的可能性極小。根據(jù)http://ambl. lsc. pku. edu. cn的資料，對(duì)抗菌蛋白HASl的致敏性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果也沒有發(fā)現(xiàn)與致敏序列相似的序列(No Signigicant Similarity was found)(http://ambl. lsc. pku. edu. cn),(見圖 7)。
同樣以O(shè)E⑶文件為參考，以抗菌蛋白HASl為目標(biāo)，在NCBI中檢索已知抗?fàn)I養(yǎng)因子與其氨基酸相似性進(jìn)行比較，其結(jié)果見圖8。從圖中可知，新的抗菌蛋白HASl編碼的基因序列同已知的抗?fàn)I養(yǎng)因子無相似性。綜上分析可知，抗菌蛋白HASl為無毒、無過敏性、無抗?fàn)I養(yǎng)因子的新型抗菌蛋白，因此其可以作為一種新的抗原材料用在轉(zhuǎn)基因作物的育種上。
權(quán)利要求
1.一種抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.一種原核表達(dá)載體，它含有權(quán)利I所述抗菌蛋白編碼基因HASl的基因序列。
4.權(quán)利要求1所述抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌蛋白編碼基因HAS1基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。該序列是以生防菌株HAS為研究對(duì)象，經(jīng)過對(duì)其抑菌機(jī)理的研究得到的，然后以菌株HAS的基因組DNA為模板，并用特異性表達(dá)引物進(jìn)行PCR法擴(kuò)增得到其編碼基因的全表達(dá)序列，隨后構(gòu)建了原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，并以甘蔗黑穗病菌為靶標(biāo)進(jìn)行了表達(dá)產(chǎn)物抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其表達(dá)產(chǎn)物同樣具有抗甘蔗黑穗病菌的能力，通過網(wǎng)上比對(duì)表明該抗菌蛋白是一種新的抗菌蛋白，編碼該抗菌蛋白的基因序列可為今后的抗病育種提供新材料。
文檔編號(hào)A01N47/44GK103031309SQ201210553669
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者熊國如, 伍蘇然, 趙更峰, 馮翠蓮, 張樹珍 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所