專利名稱：防治根結(jié)線蟲的復(fù)合微生物制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌復(fù)配制劑，尤其涉及一種防治根結(jié)線蟲的淡紫擬青霉 (P. Iilacinus)復(fù)合微生物制劑及其制備方法,本發(fā)明還涉及該復(fù)合微生物制劑在防治植物根結(jié)線蟲中的用途，屬于淡紫擬青霉生防制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淡紫擬青霉(P. Iilacinus)是一種土壤及多種植物根圍的習(xí)居菌,對南方根結(jié)線蟲的寄生率很高，可達(dá)80%以上。現(xiàn)已認(rèn)為淡紫擬青霉是一種非常重要的植物寄生線蟲卵寄生真菌，目前已廣泛應(yīng)用于防治根結(jié)線蟲、胞囊線蟲等有害植物寄生線蟲。到目前為止， 世界上已經(jīng)有了多種以淡紫擬青霉分生孢子為主要有效成分的殺線制劑，其中包括可濕性粉劑、顆粒劑及微膠囊菌劑等。
淡紫擬青霉可以寄生線蟲卵且寄生率高，但是對二齡幼蟲的寄生效果較差，而且淡紫擬青霉在一定程度上還有利于卵孵化，所以在其制劑中添加具有對二齡幼蟲有殺害作用但不影響淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長的物質(zhì)將能有效提高淡紫擬青霉的殺線蟲效果。因此，篩選能夠出促進(jìn)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)或抑制根結(jié)線蟲卵孵化的增效物，將其與淡紫擬青霉孢子進(jìn)行復(fù)配得到復(fù)合微生物制劑將能夠有效提高淡紫擬青霉孢子防治根結(jié)線蟲的效果。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種有效防治根結(jié)線蟲的淡紫擬青霉復(fù)合微生物制劑；
本發(fā)明的目的之二是提供一種制備上述淡紫擬青霉復(fù)合微生物制劑的方法；
本發(fā)明的目的之三是將所述的淡紫擬青霉復(fù)合微生物制劑應(yīng)用于防治植物根結(jié)線蟲。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種防治根結(jié)線蟲的復(fù)合微生物制劑，包括淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液、增效劑和載體；其中，所述的增效劑選自植物生長激素、誘抗劑或/和無機(jī)鹽中的任意一種或多種。
所述的植物生長激素優(yōu)選為吲哚乙酸、2，4-D、萘乙酸或吲哚丁酸中的任意一種或多種；其中，按質(zhì)量百分比計(jì)，吲哚乙酸占制劑總量的O. 00001-0. 005 %，優(yōu)選為 O. 0001-0. 001 %，最優(yōu)選為O. 001 % ；2, 4-D占制劑總量的O. 00005-0. 005 % ;萘乙酸占制劑總量的O. 00001-0. 001 %,更優(yōu)選為O. 00001-0. 0001 % ;吲哚丁酸占制劑總量的 O. 0003-0. 0008 %，優(yōu)選為0. 0003-0. 0005 %，更優(yōu)選為 O. 0005 %。
所述的誘抗劑優(yōu)選為草酸或水楊酸；按質(zhì)量百分比計(jì)，草酸占制劑總量的 O. 05-0. 15%，優(yōu)選為O. 05-0. 1% ;水楊酸占制劑總量的O. 001-0. 01%。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中含有高濃度的草酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用，其中，當(dāng)制劑中草酸的用量為500-1500mg/L(即0. 05-0. 15% )，尤其是 500-1000mg/L(即0. 05-0. 1% )時，其對于淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用最為顯著。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中濃度為10-1000mg/L的水楊酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)抑制率和菌絲日生長速率抑制率的影響均為極顯著(p〈0. 01)。通過LSD多重比較表明，水楊酸各用量之間存在差異性(P〈0. 05)。各用量水楊酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)菌絲日生長速率均有一定抑制作用，制劑中低用量(10-100mg/L)的水楊酸對其抑制率較小，隨著其在制劑中用量的增加抑制率顯著增高，當(dāng)其在制劑中的含量大于500mg/ml時，孢子萌發(fā)抑制率大于 50%，菌絲生長速率抑制率達(dá)到了 100%。因此，本發(fā)明制劑中水楊酸的用量優(yōu)選為占制劑總量的 0. 001-0. 01%。
本發(fā)明還考察了多種無機(jī)鹽對于淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或其菌絲生長的影響效果。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的無機(jī)鹽對于淡紫擬青霉孢子或萌發(fā)或菌絲生長均有嚴(yán)重的抑制作用，不適宜作為淡紫擬青霉的增效劑。本發(fā)明從大量的無機(jī)鹽中最終篩選到CuS04、 (NH4)2SCVNH4Cl和NH4NO3這四種無機(jī)鹽對于淡紫擬青霉孢子或萌發(fā)或菌絲生長具有一定的促進(jìn)作用，有作為淡紫擬青霉殺線蟲的增效劑的可能性；其中，NH4Cl對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有較為顯著的促進(jìn)作用，NH4NOjf淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長均有明顯的促進(jìn)作用， 這兩種銨鹽不僅對根結(jié)線蟲卵的孵化抑制率很高，對二齡根結(jié)線蟲幼蟲表現(xiàn)為半致死濃度的這兩種銨鹽對淡紫擬青霉分生孢子寄生卵表現(xiàn)為促進(jìn)作用，由此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將NH4Cl或 NH4NO3加入到淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液中能顯著提高淡紫擬青霉的殺線蟲效果。本發(fā)明通過更進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無機(jī)鹽占制劑總量的1.0-2. 2%，尤其是1.0-1. Iwt %時，最有利于淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或菌絲生長。
淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液可通過各種商業(yè)途徑購買得到，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員也可按照文獻(xiàn)中所公開的方法制備得到淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液；
作為參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考下述方法制備得到淡紫擬青霉孢子粉(I)制備淡紫擬青霉發(fā)酵液；(2)從淡紫擬青霉發(fā)酵液中回收孢子產(chǎn)物；(3)干燥所回收的淡紫擬青霉孢子產(chǎn)物，即得淡紫擬青霉粉。
淡紫擬青霉發(fā)酵液的制備方法已在各種文獻(xiàn)中公開(例如周靖等.淡紫擬青霉 (P. Iilacinus)培養(yǎng)條件的優(yōu)化.微生物學(xué)雜志.2007年3月第27卷第2期.45-48 ;毛成利等，淡紫擬青霉的研究開發(fā).化學(xué)工程師.2004年7月.63-64.)，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可按照文獻(xiàn)中所公開的各種方法制備得到淡紫擬青霉發(fā)酵液；例如，采用三級培養(yǎng)方法，即 種子培養(yǎng)、二級液體擴(kuò)大培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到淡紫擬青霉菌發(fā)酵液；其中，在液體發(fā)酵培養(yǎng)時，可以采用發(fā)酵罐發(fā)酵或采用搖瓶培養(yǎng)的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；三級培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件均已在文獻(xiàn)中公開，作為參考，其中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種。所述的氮源包括但不限于硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種。
本發(fā)明的目的之二的是提供了一種制備上述淡紫擬青霉復(fù)合制劑的方法，該方法包括以下步驟將各組分混合在一起，攪拌均勻，粉碎過篩，制備得到相應(yīng)的微生物制劑，可以是顆粒制劑、粉劑、可濕性粉劑或微膠囊菌劑等。
其中，所述的載體可以是硅藻土、高嶺土、木屑、活性碳或草炭、農(nóng)作物秸桿、干燥的農(nóng)家肥等；此外，本發(fā)明的制劑中還可加入輔料或/和助劑；所述的輔料可以是蟹殼粉或幾丁質(zhì)等；所述的助劑可以是潤濕劑、分散劑或穩(wěn)定劑等。
本發(fā)明從植物生長激素、誘抗劑、無機(jī)鹽等多種促進(jìn)植物根系生長的或提高植物抗病性或提高殺線效果的物質(zhì)中篩選對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長影響較小的物質(zhì)作為增效劑，將所篩選到的增效劑與淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液復(fù)配得到本發(fā)明淡紫擬青霉復(fù)合微生物制劑，該復(fù)合微生物制劑能夠有效促進(jìn)促進(jìn)植物根系生長，誘導(dǎo)植物根系產(chǎn)生對根結(jié)線蟲等病害的抗性，且能夠提高淡紫擬青霉對根結(jié)線蟲的防治效果。
說明如無特別說明，本發(fā)明中所述的百分比均為質(zhì)量百分比。


圖I植物生長激素對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)結(jié)果。
圖2植物生長激素對淡紫擬青霉菌絲生長的影響試驗(yàn)結(jié)果。
圖3誘抗劑對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)結(jié)果。
圖4誘抗劑對淡紫擬青霉菌絲生長速率的影響試驗(yàn)結(jié)果。
圖5無機(jī)鹽對淡紫擬青霉孢子生長的影響試驗(yàn)結(jié)果。
圖6無機(jī)鹽對淡紫擬青霉菌絲生長的影響試驗(yàn)結(jié)果。
說明圖I-圖6所有數(shù)據(jù)都是基于對照組CK的基礎(chǔ)上計(jì)算出來，所以所有圖中CK 組的數(shù)據(jù)為O。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
生物材料
淡紫擬青霉(P. Iilacinus)菌株購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心,菌種商業(yè)購買編號為cfcc 86080。
預(yù)備實(shí)施例淡紫擬青霉孢子粉的制備
—、淡紫擬青霉(P. Iilacinus)發(fā)酵液的制備
I、將淡紫擬青霉菌種活化后，進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)；
搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(按質(zhì)量百分比計(jì))
葡萄糖1.5-2%硝酸鈉0.4-0.6%硫酸銨0.2-0.3%黃豆粉0.2-0.3%磷酸氫二鉀0.1-0.2%硫酸鎂0.1-0.2%水余量
液體發(fā)酵條件500ml三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基200ml，高壓滅菌后接種淡紫擬青霉孢子懸浮液，接種量為I. 5-3%，置于24-28°C，搖床150_200r/min，培養(yǎng)18_36h。
2、二級液體擴(kuò)大培養(yǎng)(按質(zhì)量百分比計(jì)):
二級液體擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成
葡萄糖3-5%硝酸鈉0.4-0.6%硫酸銨0.2-0.3%黃豆粉0.2-0.3%磷酸氫二鉀0.1-0.2%硫酸鎂0.1-0.2%水余量
將上述二級液體擴(kuò)大培養(yǎng)基發(fā)酵罐中在位滅菌；
液體發(fā)酵條件發(fā)酵溫度25_28°C，罐壓O. 6-0. 8bar，其通氧量可以是100-300L/ h，轉(zhuǎn)速 150-250rpm，起始 pH 值 5. 5-6. O。
3、液體發(fā)酵培養(yǎng)
液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成
葡萄糖10-18%硝酸鈉0.2-0.3%硫酸銨0.1-0.15%黃豆粉0.1-0.15%磷酸氫二鉀0.1-0.2%硫酸鎂0.1-0.2%
土豆浸出液(20%) 10-30%水余量
將上述液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中在位滅菌；
液體發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為28_30°C，其通氧量可以是100_300L/h，前24h，通氣量控制在 100-150L/h，后期控制在 250-300L/h ;起始 pH 5. 0-6. O ;轉(zhuǎn)速150-200r/min ;罐壓0. 6-0. 8Mpa，發(fā)酵周期控制在6d，一般鏡檢孢子濃度達(dá)到109個/ml以上即可。
二、從發(fā)酵液中回收并干燥孢子產(chǎn)物
將發(fā)酵液離心，離心條件為相對離心力為4000g，離心時間為40mi n，每100毫升發(fā)酵液中加入絮凝劑2. Og ;棄上清，將沉淀菌漿用硅藻土載體吸附后陰干至產(chǎn)品中的含水量低于10%，即得孢子粉。
實(shí)施例I可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 999%，吲哚乙酸 O. 001%,硅藻土 10%，潤濕劑PEG 2%,分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與吲哚乙酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例2可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 99%，吲哚乙酸O. 01%, 硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與吲哚乙酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例3可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 99999%，吲哚乙酸 O. 0001%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與吲哚乙酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例4可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 99999 %，萘乙酸 O. 0001%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與萘乙酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例5可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 999%，萘乙酸O. 001%, 硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與萘乙酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例6可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 9995%，吲哚丁酸 O. 0005%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與吲哚丁酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例7可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 995%，2，4_D O. 005%, 硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與2，4-D、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例8可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 99995 %，2，4_D O. 00005%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與2，4-D、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例9可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 95%，草酸O. 05%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過 325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與草酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻， 即得。
實(shí)施例10可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 85%，草酸O. 15%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過 325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與草酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻， 即得
實(shí)施例10可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 999%，水楊酸O. 001%, 硅藻土 10%，潤濕劑P EG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與水楊酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例11可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85. 99%，水楊酸O. 01%，硅藻土 10%，潤濕劑P EG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與水楊酸、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例12可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉85%，NH4C11%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過 325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與NH4C1、潤濕劑和分散劑混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻， 即得。
實(shí)施例13可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉84. 9% ,NH4NO3L 1%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過 325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與潤濕劑、分散劑和N H4NO3混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
實(shí)施例14可濕性粉劑的制備
按下述質(zhì)量百分配比稱取各組分淡紫擬青霉孢子粉84.9495%、NH4C1 1%，硅藻土 10%，潤濕劑PEG2%、分散劑木鈉2%、吲哚丁酸O. 0005%，草酸O. 05% ;將淡紫擬青霉孢子粉和硅藻土混合均勻后粉碎過325目篩；將粉碎后的產(chǎn)物與潤濕劑、分散劑、吲哚丁酸和草酸混合均勻后用氣流磨磨細(xì)，混合均勻，即得。
試驗(yàn)例I植物生長激素和誘抗劑對于淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長速率影響的篩選試驗(yàn)
I.植物生長激素種類及用量對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或菌絲生長的影響試驗(yàn)
I. I試驗(yàn)方法
I. I. I植物生長調(diào)節(jié)劑對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響
取O. ImL濃度為IO3個孢子/mL的淡紫擬青霉孢子懸浮液，涂布在含不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的平板上；以不含植物生長調(diào)節(jié)劑的PDA平板為對照CK。每個處理重復(fù)3次。 將所有處理的平板置于25°C下培養(yǎng)3-4d后，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。然后以對照組CK為基準(zhǔn)計(jì)算出分生孢子的萌發(fā)抑制率，即
抑制率(％ ) =1-實(shí)驗(yàn)組CFU/對照組CFU
I. I. 2植物生長調(diào)節(jié)劑對淡紫擬青霉菌絲生長的影響
在含有植物生長調(diào)節(jié)劑的PDA平板上接種蘸有淡紫擬青霉孢子懸浮液的直徑為 6mm的濾紙片，以不含植物生長調(diào)節(jié)劑為對照，每個處理重復(fù)3次，每隔3d測量菌落的生長直徑，計(jì)算菌落直徑日增長量菌落直徑日增長量(mm/d) =d/生長天數(shù)。然后以對照組CK 為基準(zhǔn)計(jì)算出菌絲生長抑制率，即
抑制率(％ ) =1-實(shí)驗(yàn)組菌絲生長速率/對照組菌絲生長速率
I. 2試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖I和圖2，試驗(yàn)結(jié)果表明，制劑中吲哚乙酸(IAA)的終濃度或用量為 O. l-50mg/L或O. l-50mg/kg(即0· 00001-0. 005%)時，其對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，吲哚乙酸在制劑中的用量為10mg/L(即0.001% )時，其對孢子萌發(fā)表現(xiàn)出非常強(qiáng)的促進(jìn)作用，與其它濃度相比存在顯著性差異(P〈0.05);當(dāng)其在制劑中的用量達(dá)到100mg/L時，其對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的抑制率表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，抑制率超過了 25 %，當(dāng)其在制劑中的用量達(dá)到了 1000mg/L時孢子萌發(fā)完全被抑制，但菌絲仍然可以慢速生長。吲哚乙酸對淡紫擬青霉菌絲的生長呈現(xiàn)出微弱的抑制作用，當(dāng)其用量為I. 0-10. Omg/ L時，對于淡紫擬青霉菌絲的生長幾乎不表現(xiàn)出抑制作用。經(jīng)過綜合考察，制劑中吲哚乙酸的用量可以為 0. l-50mg/L(0. 00001-0. 005%)，優(yōu)選為 I. 0-10. 0mg/L(0. 0001-0. 001%)，更優(yōu)選為 10. 0mg/L (0. 001%)。
從試驗(yàn)結(jié)果可見，吲哚丁酸對于淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的抑制作用較弱，其在制劑中的濃度為3. 0-10. 0mg/L時，對于淡紫擬青霉孢子的萌發(fā)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，其在制劑中的濃度為5. 0mg/L(即0. 0005% )時，對于淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用最為顯著 (P〈0. 05)。吲哚丁酸在制劑中的用量為3. 0-8. 0mg/L時，對于紫擬青霉孢子菌絲的生長均表現(xiàn)出促進(jìn)作用。當(dāng)制劑中吲哚丁酸的用量為5. 0mg/L時，淡紫擬青霉孢子萌發(fā)率最高，菌絲日生長量也為最大，且與其它濃度相比呈現(xiàn)極顯著差異(P〈0.05)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果， 可以看出吲哚丁酸在制劑中的用量為3. 0-8. 0mg/L(0. 0003-0. 0008%)時較為適宜，優(yōu)選為 3. 0-5. 0mg/L (0. 0003-0. 0005%)，最優(yōu)選為 5. 0mg/L (0. 0005%)。
從試驗(yàn)結(jié)果可見，用量為0_500mg/L的2，4_D對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)抑制率和菌CN 102919279 A書明說8/10 頁絲日生長速率的影響均不顯著。低用量(即0.5-50mg/L)的2，4-D對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲日生長量均有促進(jìn)作用，略高于對照組，本發(fā)明通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中2，4-D用量 O. 5-50mg/L或O. 5_50mg/kg(即O. 00005-0. 005%)時，其作為淡紫擬青霉殺線蟲劑的增效劑的效果為最好。
從試驗(yàn)結(jié)果可見，制劑中用量為0-100mg/L的萘乙酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲日生長量的影響均不顯著，均低于對照組，對孢子的萌發(fā)和生長沒有促進(jìn)作用。當(dāng)用量達(dá)到1000mg/L時，淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長菌完全被抑制。通過LSD多重比較表明， 各濃度之間差異性不顯著(P〈0. 05)。
2.誘抗劑的種類及濃度對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或菌絲生長速率的影響試驗(yàn)
2. I試驗(yàn)方法
2. I. I誘抗劑對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響
取0. ImL濃度為103個孢子/mL的淡紫擬青霉孢子懸浮液，涂布在含不同濃度誘抗劑的平板上。以不含誘抗劑的PDA平板為對照。每個處理重復(fù)3次。將所有處理的平板置于25°C下培養(yǎng)3-4d后，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。然后以對照組CK為基準(zhǔn)計(jì)算出分生孢子的萌發(fā)抑制率，即
抑制率(％ ) =1-實(shí)驗(yàn)組CFU/對照組CFU
2. I. 2誘抗劑對淡紫擬青霉菌絲生長的影響
在含有誘抗劑的PDA平板上接種蘸有淡紫擬青霉孢子懸浮液的直徑為6_的濾紙片，以不含誘抗劑為對照，每個處理重復(fù)3次，每3d測量菌落的生長直徑，計(jì)算菌落直徑日增長量菌落直徑日增長量(mm/d) =d/生長天數(shù)。然后以對照組CK為基準(zhǔn)計(jì)算出菌絲生長抑制率，即
抑制率(％ )=1_實(shí)驗(yàn)組菌絲生長速率/對照組菌絲生長速率
2. 2試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4，將試驗(yàn)結(jié)果通過方差分析表明，制劑中草酸的用量為 50-1000mg/L時，其對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)抑制率的影響為顯著(P〈0. 05)，對其菌絲日生長速率的影響為不顯著。通過LSD多重比較表明，草酸各用量之間并不存在差異性 (P〈0.05)。制劑中草酸的用量為50-100mg/L時)草酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有抑制作用， 但是高用量的(500-1500mg/L)的草酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用。草酸各種用量濃度對淡紫擬青霉菌絲日生長速率均有一定抑制作用，而且各濃度之間不存在差異性。綜合各實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明確定，采用用量為500-1000mg/L(即0. 05-0. 1% )的草酸來作為淡紫擬青霉殺線蟲劑的增效劑的效果為最好。
試驗(yàn)結(jié)果通過方差分析表明(圖3、圖4)，制劑中水楊酸的用量為IO-IOOOmg/ L時，其對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)抑制率和菌絲日生長速率抑制率的影響均為極顯著 (P〈0. 01)。通過LSD多重比較表明，水楊酸各用量之間存在差異性(P〈0. 05)。各用量水楊酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)菌絲日生長速率均有一定抑制作用，低用量(10-100mg/L)的水楊酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)抑制率較小，但是隨著用量的增加抑制率顯著增高，當(dāng)用量大于500mg/L時，孢子萌發(fā)抑制率大于50%，菌絲生長速率抑制率達(dá)到了 100%。因此，本發(fā)明確定水楊酸在制劑中的用量優(yōu)選為10-100mg/L(即0. 001-0. 01% )0
3幾種具有殺線蟲效果的無機(jī)鹽對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或菌絲生長的影響試驗(yàn)10
3. I試驗(yàn)方法
3. I. I無機(jī)鹽對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響
在營養(yǎng)液添加相應(yīng)的無機(jī)鹽和淡紫擬青霉分生孢子，調(diào)整到相應(yīng)的無機(jī)鹽的濃度和分生孢子濃度，混勻，恒溫26°C振蕩(120r/min)培養(yǎng)12h，重復(fù)三次取樣測定各處理中的孢子萌發(fā)數(shù)，以芽管的長度超過孢子寬度的一半視為萌發(fā)。然后以對照組CK為基準(zhǔn)計(jì)算出分生孢子的萌發(fā)抑制率，即
抑制率(％ )=1_實(shí)驗(yàn)組萌發(fā)數(shù)/對照組萌發(fā)數(shù)
3. I. 2無機(jī)鹽對淡紫擬青霉菌絲生長的影響
在含有相應(yīng)濃度的PDA平板上接種蘸有淡紫擬青霉孢子懸浮液的直徑為6mm的濾紙片，以不含無機(jī)鹽為對照，每個處理重復(fù)3次，每3d測量菌落的生長直徑，計(jì)算菌落直徑日增長量菌落直徑日增長量(mm/d) =d/生長天數(shù)。然后以對照組CK為基準(zhǔn)計(jì)算出菌絲生長抑制率，即
抑制率(％ )=1_實(shí)驗(yàn)組菌絲生長速率/對照組菌絲生長速率
3. 2試驗(yàn)結(jié)果
由表1-3、圖5和圖6可見，NH4HCO3、檸檬酸、K2HP04、FeCl3四種殺線蟲化合物對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或菌絲生長速率抑制率都較大，所以不適于作為淡紫擬青霉殺線蟲的增效劑；CuS04、(NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制率很小，而且N H4Cl對其孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，NH4NO3對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長均有促進(jìn)作用，所以本發(fā)明優(yōu)選用CuS04、(NH4)2SO4,NH4Cl,NH4NO3這四種無機(jī)鹽對根結(jié)線蟲半致死率的濃度來作為淡紫擬青霉的增效劑。
表I幾種無機(jī)鹽對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)抑制率影響的方差分析結(jié)果平方和 dfF SigT組間20949 ^Ol72992.757 34.002000
組內(nèi)1408.2581688.016e it*22357.56023
表2幾種無機(jī)鹽對淡紫擬青霉菌絲生長抑制率影響的方差分析結(jié)果平方和Cll均方 F組間10751.00071535.857 78.222 000
組內(nèi)274.8841419.635總計(jì)I 1025.88421
通過方差分析表明，幾種具有殺線蟲效果的無機(jī)鹽和檸檬酸對淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長速率的影響是極顯著的。隨后對其不同種類的增效劑進(jìn)行LSD多重比較，結(jié)果見圖5和6。
表3三種增效劑對淡紫擬青霉侵染根結(jié)線蟲卵的影響
權(quán)利要求
1.一種防治線蟲的復(fù)合微生物制劑，其特征在于，包括淡紫擬青霉(P. Iilacinus)孢子粉或發(fā)酵液、增效劑和載體；其中，所述的增效劑選自植物生長激素、誘抗劑或具有殺線效果的無機(jī)鹽中的任意一種或多種。
2.按照權(quán)利要求I所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于所述的植物生長激素為吲哚乙酸、2，4-D、萘乙酸或吲哚丁酸中的任意一種或多種。
3.按照權(quán)利要求2所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于其中，按質(zhì)量百分比計(jì)，吲哚乙酸占制劑總量的O. 00001-0. 005 %，優(yōu)選為O. 0001-0. 001 %，最優(yōu)選為O. 001 % ;2，4-D 占制劑總量的O. 00005-0. 005% ;萘乙酸占制劑總量的O. 00001-0. 001%，優(yōu)選為O.00001-0. 0001% ;吲哚丁酸占制劑總量的 O. 0003-0. 000. 8%，優(yōu)選為 O. 0003-0. 0005%,最優(yōu)選為O. 0005%。
4.按照權(quán)利要求I所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于所述的誘抗劑為草酸或水楊酸。
5.按照權(quán)利要求4所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì)，草酸占制劑總量的O. 05-0. 15%，優(yōu)選為O. 05-0. 1% ;水楊酸占制劑總量的O. 001-0. 01%。
6.按照權(quán)利要求I所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于所述的無機(jī)鹽包括CuS04或銨鹽。
7.按照權(quán)利要求6所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于所述的銨鹽是(NH4)2S04、NH4Cl 或 NH4NO3O
8.按照權(quán)利要求6或7所述的復(fù)合微生物制劑，其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì)，無機(jī)鹽占制劑總量的O. 1-2. 2%，優(yōu)選為1.0-1. 1%。
9.一種制備權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述復(fù)合微生物制劑的方法,其特征在于,包括以下步驟將各組分混合均勻，干燥，粉碎過篩，即得。
10.權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述復(fù)合微生物制劑在防治植物根結(jié)線蟲中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治根結(jié)線蟲的復(fù)合微生物制劑及其制備方法。所述復(fù)合微生物制劑包括淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液、增效劑和載體；其中，所述的增效劑選自植物生長激素、誘抗劑或具有殺線效果的無機(jī)鹽中的任意一種或多種。本發(fā)明從植物生長激素、誘抗劑或無機(jī)鹽中篩選出能夠增加淡紫擬青霉防效且不影響淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和菌絲生長的增效劑，將所篩選到的增效劑和載體加入到淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液中制備得到防治根結(jié)線蟲的復(fù)合微生物制劑。本發(fā)明復(fù)合微生物制劑對根結(jié)線蟲具有良好的防治效果，還能夠提高植物的抗病力并能顯著促進(jìn)植物根系生長。
文檔編號A01P5/00GK102919279SQ20121042599
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者汪來發(fā), 王曦茁, 郭志斌, 林彩麗, 田國忠, 馬建偉 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所