專利名稱：線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的復(fù)配制劑和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物農(nóng)藥制劑，尤其涉及一種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的的生物農(nóng)藥復(fù)配制劑，本發(fā)明還涉及該生物農(nóng)藥復(fù)配制劑的制備方法及其在防治根結(jié)線蟲(chóng)中的應(yīng)用，屬于植物寄生線蟲(chóng)的生物防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淡紫擬青霉(P.1ilacinus)是一種土壤及多種植物根圍的習(xí)居菌,對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的寄生率很高，可達(dá)80%以上?，F(xiàn)已認(rèn)為淡紫擬青霉是一 種非常重要的植物寄生線蟲(chóng)卵寄生真菌，目前已廣泛應(yīng)用于防治根結(jié)線蟲(chóng)、胞囊線蟲(chóng)等有害植物寄生線蟲(chóng)。作為防治植物病原線蟲(chóng)的重要生防菌之一，淡紫擬青霉孢子快速萌發(fā)可直接影響菌株對(duì)寄主的致病力，并且可以大量地減少根結(jié)線蟲(chóng)卵的孵化。迄今為止，世界上已經(jīng)有了多種以淡紫擬青霉分生孢子為主要有效成分的殺線制齊U，其中包括可濕性粉劑、顆粒劑及其微膠囊菌劑等。雖然淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵寄生效果很高，實(shí)際應(yīng)用也較多，但是對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵后期和二齡幼蟲(chóng)的寄生效果很差，而且研究發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物還有助于根結(jié)線蟲(chóng)卵的孵化。由于孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均需一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而撒施在土壤中的孢子較難迅速?gòu)耐寥阑蚣闹鳙@得其萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)，從而有可能增加孢子萌發(fā)和侵入卵所需的時(shí)間，而添加孢子萌發(fā)促進(jìn)劑可起到補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的作用，促進(jìn)淡紫擬青霉分生孢子快速侵入根結(jié)線蟲(chóng)卵，提高殺線效果。因此，篩選能夠促進(jìn)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)的刺激物(簡(jiǎn)稱孢子萌發(fā)促進(jìn)劑)，將其加入到孢子制劑當(dāng)中，以便在淡紫擬青霉分生孢子接觸卵后能夠迅速萌發(fā)和侵入，減少卵的孵化，可增強(qiáng)孢子制劑防治植物根結(jié)線蟲(chóng)的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種孢子萌發(fā)率高、作用時(shí)間短、卵寄生率高、能夠有效抑制根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的復(fù)配制劑；本發(fā)明目的之二是提供一種制備所述真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的復(fù)配制劑的方法;本發(fā)明目的之三是提供將所制備的真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的復(fù)配制劑應(yīng)用于防治植物根結(jié)線蟲(chóng)；本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種孢子萌發(fā)率高、能夠有效抑制根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑，包括淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液、孢子萌發(fā)促進(jìn)劑；其中，所述的孢子萌發(fā)促進(jìn)劑選自維生素B1、糖類物質(zhì)、氨基酸大分子或有機(jī)氮源中的一種或一種以上；優(yōu)選的，所述的糖類物質(zhì)是蔗糖、D-山梨醇、麥芽糖或肌醇；所述氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺；所述的大分子有機(jī)氮源為蛋白胨或牛肉膏。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維生素能夠顯著地影響淡紫擬青霉孢子萌發(fā)和二級(jí)孢子產(chǎn)生，其中，核黃素、抗壞血酸、維生素B6對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有抑制作用，只有維生素BI對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用，其對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)效果要優(yōu)于糖類物質(zhì)、氨基酸和大分子有機(jī)氮源，所以在淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液中僅添加維生素BI就能有效的達(dá)到促進(jìn)孢子萌發(fā)的顯著效果。為此，本發(fā)明提供了一種抑制根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制齊 ，包括淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液和維生素BI ；為了達(dá)到更好的效果，其中，按質(zhì)量百分比計(jì)，各組分的用量?jī)?yōu)選為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 8-99. 95%，維生素BI O. 05-0. 2% ；更優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 9%，維生素BI O. 1%。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述由淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液和維生素BI組成的復(fù)配制劑中加入糖類物質(zhì)能夠更有效的抑制根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化；其中，所加入的糖類物質(zhì)優(yōu)選為蔗糖、D-山梨醇、麥芽糖或肌醇，更優(yōu)選為蔗糖；其中，加入蔗糖后，按質(zhì)量百分比計(jì)，復(fù)配制劑中各組分的用量?jī)?yōu)選為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 6-99. 9%，維生素Β10. 05-0. 2%、蔗糖O. 05-0. 2% ;更優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 75%，維生素BI O. 1%、蔗糖O. 15%。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述復(fù)配制劑中加入特定的氨基酸能夠顯著提高制劑的防治根結(jié)線蟲(chóng)的效果；其中，所加入的氨基酸優(yōu)選為L(zhǎng)-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺或，更優(yōu)選為L(zhǎng)-丙氨酸或L-谷氨酸；其中，在生物農(nóng)藥復(fù)配劑中加入氨基酸后，按質(zhì)量百分比計(jì)，生物農(nóng)藥復(fù)配劑中各組分的用量?jī)?yōu)選為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 4-99. 85%，維生素BI O. 05-0. 2%、蔗糖O. 05-0. 2%、氨基酸O. 05-0. 2% ;更優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 65%，維生素BI O. 1%、蔗糖O. 15%、氨基酸O. 1%。本發(fā)明通過(guò)更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述生物農(nóng)藥復(fù)配制劑中加入大分子有機(jī)氮源能夠顯著促進(jìn)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)，其中，所述的大分子有機(jī)氮源優(yōu)選為蛋白胨或牛肉膏，更優(yōu)選為蛋白胨；在生物農(nóng)藥復(fù)配劑中加入蛋白胨后，按質(zhì)量百分比計(jì)，生物農(nóng)藥復(fù)配劑中各組分的用量?jī)?yōu)選為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 2-99. 8%，維生素BIO. 05-0. 2%、蔗糖O. 05-0. 2%、氨基酸O. 05-0. 2%、蛋白胨O. 05-0. 2% ;更優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 55%，維生素Β10. 1%、蔗糖O. 15%、氨基酸O. 1%、蛋白胨O. 1%。本發(fā)明中所述的淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液的濃度可以是任何一種防治根結(jié)線蟲(chóng)有效量的濃度，例如，淡紫擬青霉孢子粉的活孢子數(shù)可以是IO6個(gè)/g以上，孢子發(fā)酵液的濃度可以是IO6個(gè)/ml以上，優(yōu)選為孢子濃度為5 X IO6個(gè)/ml的孢子發(fā)酵液；淡紫擬青霉孢子粉、孢子或孢子發(fā)酵液可通過(guò)各種商業(yè)途徑購(gòu)買得到，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員也可按照文獻(xiàn)中所公開(kāi)的方法制備得到淡紫擬青霉孢子粉、孢子或孢子發(fā)酵液。作為參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考下述方法制備得到淡紫擬青霉孢子粉(1)制備淡紫擬青霉液體發(fā)酵液；(2)從淡紫擬青霉液體發(fā)酵液中回收孢子產(chǎn)物；(3)干燥所回收的淡紫擬青霉孢子產(chǎn)物，即得淡紫擬青霉粉。
淡紫擬青霉液體發(fā)酵液的制備方法已在各種文獻(xiàn)中公開(kāi)(例如周靖等.淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)培養(yǎng)條件的優(yōu)化.微生物學(xué)雜志.2007年3月第27卷第2期.45-48 ;毛成利等，淡紫擬青霉的研究開(kāi)發(fā).化學(xué)工程師.2004年7月.63-64.)，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可按照文獻(xiàn)中所公開(kāi)的各種方法制備得到淡紫擬青霉液體發(fā)酵液；例如，采用三級(jí)培養(yǎng)方法，即種子培養(yǎng)、二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到淡紫擬青霉菌發(fā)酵液；其中，在液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可以采用發(fā)酵罐發(fā)酵或采用搖瓶培養(yǎng)的方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。三級(jí)培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件均已在文獻(xiàn)中公開(kāi)，作為參考，其中，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一種或多種。所述的氮源包括但不限于硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨或黃豆粉中的任一種或多種。淡紫擬青霉在24°C _30°C范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)產(chǎn)孢，所以在制備淡紫擬青霉液體發(fā)酵液的各個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各培養(yǎng)溫度可以是24°C -30°C。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程搖床轉(zhuǎn)速可以為80-250r/min,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220r/min時(shí)，產(chǎn)孢量會(huì)達(dá)到最高。液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為3-9時(shí)均能產(chǎn)孢；當(dāng)初始pH值為5. 0-5. 5時(shí)，淡紫擬青霉的孢子產(chǎn)量相對(duì)較高；當(dāng)液 體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值是5. O時(shí)，淡紫擬青霉的產(chǎn)孢量達(dá)到最高。發(fā)酵罐的罐壓可以為O. 6-0. 8Mpa ;在用發(fā)酵罐或搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，其通氧量可以是50_300L/h。至于如何從液體發(fā)酵產(chǎn)物中回收孢子，可以采用諸如離心或過(guò)濾等方法從淡紫擬青霉液體發(fā)酵產(chǎn)物中回收孢子。本發(fā)明中所述的“干燥”方式可以是真空冷凍干燥、陰干或加熱烘干等方式；其中，采用陰干或加熱烘干的方式干燥孢子時(shí)，優(yōu)選的，將待干燥的孢子液(所述的孢子液可以是將發(fā)酵液離心后所得到的沉淀物(孢子菌漿)，也可以是將發(fā)酵液濃縮后所得到的濃縮液等)用載體進(jìn)行吸附，再將吸附有孢子液的載體進(jìn)行自然干燥(即陰干)或加熱烘干。本發(fā)明的目的之四的是提供了一種制備上述真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑的方法，該方法包括以下步驟(1)按所述用量稱取各組分；(2)將各組分混合在一起，攪拌均勻，即得。本發(fā)明真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑按生防菌劑的常規(guī)制備方法制備成液體生防制劑(原菌劑)或固體生防菌劑；例如，可向生物農(nóng)藥組合物中加入輔料(蟹殼粉、幾丁質(zhì))、吸附載體(硅藻土、高嶺土、木屑、活性碳或草炭、農(nóng)作物秸桿、干燥的農(nóng)家肥等)、助劑等，制備得到相應(yīng)的微生物固體制劑或液體制劑，例如，可以是油齊 、直接發(fā)酵液、水齊 、顆粒制劑、可濕性粉劑、微膠囊菌劑等。本發(fā)明通過(guò)對(duì)五大類生化營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)影響的比較，篩選出能顯著刺激孢子萌發(fā)的物質(zhì)，加入其孢子制劑當(dāng)中，以便在淡紫擬青霉分生孢子接觸卵后能夠迅速萌發(fā)和侵入，減少卵的孵化，增強(qiáng)孢子制劑控制根結(jié)線蟲(chóng)的效果。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明采用正交試驗(yàn)獲得促進(jìn)孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最佳組合，并用生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其防治根結(jié)線蟲(chóng)的生防效果，本發(fā)明生物農(nóng)藥復(fù)配劑與根結(jié)線蟲(chóng)作用5天，其寄生率就可達(dá)到80%以上，根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化率接近為零。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明生物農(nóng)藥復(fù)配菌劑能顯著地提高淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵寄生率并有效縮短作用時(shí)間，對(duì)于植物根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果有顯著地提聞。


圖1不同糖類物質(zhì)對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)及其二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2不同氨基酸對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)及其二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果O圖3不同無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)及其二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4不同維生素對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)及其二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果O圖5不同有機(jī)氮源對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)及其二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。生物材料淡紫擬青霉(P.1ilacinus)菌株購(gòu)自中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心,菌種商業(yè)購(gòu)買編號(hào)為cfcc 86080。預(yù)備實(shí)施例淡紫擬青霉孢子粉的制備—、淡紫擬青霉(P.1ilacinus)發(fā)酵液的制備 1、將淡紫擬青霉菌種活化后，進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)；搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(按質(zhì)量百分比計(jì))葡萄糖1. 5-2%硝酸鈉O. 4-0. 6%硫酸銨O. 2-0. 3%黃豆粉O. 2-0. 3%磷酸氫二鉀O. 1-0. 2%硫酸鎂O. 1-0. 2%水余量液體發(fā)酵條件500ml三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基200ml，高壓滅菌后接種淡紫擬青霉孢子懸浮液，接種量為1. 5-3%，置于24-28°C，搖床150_200r/min，培養(yǎng)18_36h。2、二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(按質(zhì)量百分比計(jì)):葡萄糖3-5%硝酸鈉O. 4-0. 6%硫酸銨O. 2-0. 3%黃豆粉O. 2-0. 3%磷酸氫二鉀O. 1-0. 2%
硫酸鎂(λ1-0. 2%水余量將上述液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中在位滅菌；液體發(fā)酵條件發(fā)酵溫度25_28°C，罐壓O. 6-0. 8bar，其通氧量可以是100-300L/h，轉(zhuǎn)速 150-250rpm，起始 pH 值 5. 5-6. O。3、液體發(fā)酵培養(yǎng)葡萄糖10-18%硝酸鈉O. 2-0. 3% 硫酸銨O. 1-0. 15%黃豆粉O. 1-0. 15%磷酸氫二鉀O. 1-0. 2%硫酸鎂O. 1-0. 2%土豆浸出液(20%) 10-30%水余量將上述液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中在位滅菌；液體發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為28_30°C，其通氧量可以是100_300L/h，前24h，通氣量控制在 100-150L/h，后期控制在 250-300L/h ;起始 pH :5. 0-6. O ;轉(zhuǎn)速150-200r/min ;罐壓0. 6-0. 8Mpa，發(fā)酵周期控制在6d，一般鏡檢孢子濃度達(dá)到IO9個(gè)/ml以上即可。二、從發(fā)酵液中回收并干燥孢子產(chǎn)物將發(fā)酵液離心，離心條件為相對(duì)離心力為4000g，離心時(shí)間為40min，每100毫升
發(fā)酵液中加入絮凝劑2. Og ;棄上清，將沉淀菌漿用硅藻土載體吸附后陰干至產(chǎn)品中的含水量低于10%，即得孢子粉。實(shí)驗(yàn)例I防治根結(jié)線蟲(chóng)的生物農(nóng)藥復(fù)配劑的組分種類及用量的篩選實(shí)驗(yàn)1.材料與方法1.1供試菌株和根結(jié)線蟲(chóng)卵粒供試囷株淡紫擬青霉囷株購(gòu)自中國(guó)林業(yè)微生物囷種保減管理中心，囷種商業(yè)購(gòu)買編號(hào)為cfcc 86080 ；供試根結(jié)線蟲(chóng)卵采自北京市郊區(qū)珠寶屯村日光溫室內(nèi)栽培的番茄根系，室內(nèi)鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)。1. 2淡紫擬青霉孢子懸浮液制備淡紫擬青霉菌株接種于PDA平板上，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5_7d，用O. 05%(V/V)的無(wú)菌Tween-80溶液將PDA平板上的孢子洗下來(lái)，在振蕩器或搖床上混合均勻，然后采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用Tween-20溶液調(diào)整其孢子濃度為2X IO8個(gè)/ml。1. 3孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的篩選本試驗(yàn)選用糖類7種、氨基酸4種、維生素5種、無(wú)機(jī)鹽6種、高分子有機(jī)氮源2種分別單獨(dú)作為添加劑使用，濃度均為O. lwt%,以不加添加劑作為對(duì)照組，篩選出對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)具有促進(jìn)作用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。將篩出有利于孢子萌發(fā)的維生素B1、L-丙氨酸、蔗糖和蛋白胨作為孢子萌發(fā)促進(jìn)因子，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，水平為O. 05wt%,0. lwt%和O. 2wt%，按正交試驗(yàn)獲得9個(gè)實(shí)驗(yàn)組合，每個(gè)處理重復(fù)3次，進(jìn)行孢子萌發(fā)率測(cè)定。
1. 4孢子萌發(fā)率測(cè)定取5ml淡紫擬青霉孢子懸浮液，分別與5ml營(yíng)養(yǎng)液(各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加劑溶液)混勻，恒溫26°C振蕩(120r/min)培養(yǎng)8h (正交試驗(yàn))，12h (添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))，重復(fù)三次取樣測(cè)定各處理中的孢子萌發(fā)率，以芽管的長(zhǎng)度超過(guò)孢子寬度的一半視為萌發(fā)。1. 5根結(jié)線蟲(chóng)卵的獲得和生物測(cè)定根結(jié)線蟲(chóng)卵粒的獲得將病根洗凈，剪成O. 5cm的小段，放入500ml三角瓶?jī)?nèi)，倒入200ml 1%次氯酸鈉溶液，用力猛搖3min，將卵懸浮液先過(guò)300目篩，再過(guò)500目篩，然后使用蒸餾水連續(xù)清洗幾次，盡量洗盡次氯酸鈉，留在第二個(gè)篩上的便為根結(jié)線蟲(chóng)卵粒，用蒸餾水沖出，用滅菌水調(diào)節(jié)，使懸浮液中卵粒濃度為1000個(gè)/ml。
含有孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的孢子懸浮液的制備按篩選出的孢子萌發(fā)促進(jìn)劑組合配制含有Tween-20的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶液(不同濃度的維生素BI和蔗糖)，然后加入孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為IO7個(gè)/ml，然后再稀釋成IO6UO5個(gè)/ml的系列濃度，以不含孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的Tween-20溶液為對(duì)照。寄生率測(cè)定在經(jīng)過(guò)高壓滅菌的培養(yǎng)皿(直徑為6cm)中每皿加入Iml卵懸浮液，處理每皿加入4ml上述孢子懸浮液，對(duì)照每皿加4ml無(wú)菌水，封口膜封住置于25°C培養(yǎng)箱中，3d后連續(xù)3d定時(shí)于解剖鏡下鏡檢，統(tǒng)計(jì)孵化線蟲(chóng)數(shù)、未寄生卵粒和寄生卵粒。每個(gè)處理和每次計(jì)數(shù)均重復(fù)3次。1. 6數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用軟件SPSS13. O分別進(jìn)行方差分析和最小極差法(LSD)顯著性差異比較(P ^ O. 05)，正交試驗(yàn)結(jié)果用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1孢子萌發(fā)促進(jìn)劑的篩選真菌孢子的萌發(fā)一般需要一定的碳氮營(yíng)養(yǎng)及其它生化因子的誘導(dǎo)。糖類、維生素、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽離子和高分子氮源等五大類共24種生化營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)率和二級(jí)孢子的產(chǎn)生的影響如下。糖類提供了生命活動(dòng)所必需的能量物質(zhì)和細(xì)胞骨架物質(zhì)。方差分析表明，所試7種糖類物質(zhì)能顯著影響淡紫擬青霉孢子萌發(fā)或刺激芽管形成(df=7，F(xiàn)=9642. 59，P<0.01),對(duì)二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響是不顯著的(df=7，F(xiàn)=12. 973，P〈0. 01)。從圖1以及LSD多重比較分析得出，D-木糖、葡萄糖和海藻糖對(duì)淡紫擬青霉孢子的萌發(fā)表現(xiàn)為抑制作用，顯著低于對(duì)照組，且三種糖類對(duì)淡紫擬青霉分生孢子萌發(fā)差異性顯著；其它四種糖類物質(zhì)對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響為促進(jìn)作用，其促進(jìn)效果為肌醇〈麥芽糖〈D-山梨醇〈蔗糖，其中蔗糖對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，接近70%，且與另外三種糖類存在顯著差異性。氨基酸是合成蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。表中列出了不同氨基酸處理的孢子萌發(fā)率及二級(jí)分生孢子形成率與對(duì)照間的比較。經(jīng)方差分析表明，各種氨基酸對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響具有顯著差異(df=4，F(xiàn)=6173. 54，P〈0. 01 )，但對(duì)二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響不具顯著性差異(df=4，F(xiàn)=415. 27, P〈0.01)。所試四種氨基酸對(duì)孢子萌發(fā)的影響均達(dá)顯著水平，其中，L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-天冬酰胺對(duì)孢子均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，尤以L-丙氨酸最為明顯，但是通過(guò)LSD多重比較(P〈0. 05)表明，L-丙氨酸和L-天冬酰胺對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用差異性不顯著，所以兩種氨基酸均可作為促進(jìn)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的氨基酸。
無(wú)機(jī)鹽離子是真菌正常生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中許多金屬離子還是重要的輔酶因子。方差分析表明，各種無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)(df=6，F(xiàn)=670. 834, P〈0. 05)和產(chǎn)生二級(jí)孢子(df=6，F(xiàn)=36. 968，P〈0. 05)的影響差異性顯著。其中Fe2 (SO4) 3和CaCl2對(duì)淡紫擬青霉孢子的萌發(fā)率具有促進(jìn)作用，但均與CK組差不多，其他無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用。維生素是組成輔酶的重要成分，參加多種生化反應(yīng)，但真菌并不能通過(guò)自身來(lái)合成所有的維生素，有些維生素必須從外界攝取。方差分析表明，維生素能夠顯著地影響淡紫擬青霉孢子萌發(fā)(df=4，F(xiàn)=20009. 284，Ρ〈0· 05)和二級(jí)孢子產(chǎn)生(df=4，F(xiàn)=531. 775，P〈0. 05)。核黃素、抗壞血酸、維生素B6對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有抑制作用，只有維生素BI對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，而且顯著高于對(duì)照組。方差分析表明，兩種有機(jī)氮源對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響具有顯著性差異(df=2, F=10715. 221，P〈0. 05)，對(duì)二級(jí)孢子產(chǎn)生率的影響同樣具有顯著性差異(df=2，F(xiàn)=37. 926,P<0. 05)。兩種大分子有機(jī)氮源牛肉膏和蛋白胨對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用，萌發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組。由以上正交實(shí)驗(yàn)直觀分析得出，四個(gè)因素對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響如下維生素BI〉蔗糖 > 丙氨酸 > 蛋白胨。篩選得出最佳組合為=A1B1C1D2,即從直觀分析來(lái)看，最佳回收率的組合為維生素B1:0. 1%，丙氨酸0. 1%，蔗糖0. 1%，蛋白胨O. 1%。而且低濃度對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用大于高濃度。通過(guò)方差分析表明，維生素BI，丙氨酸和蔗糖含量對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響是極顯著，而蛋白胨含量對(duì)孢子萌發(fā)影響是不顯著。各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同水平通過(guò)LSD多重比較表明，濃度為O. 05%和O. 1%的蛋白胨對(duì)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的影響是不顯著的，所以應(yīng)選用低濃度的蛋白胨作為促進(jìn)孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所以通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出的最佳組合為維生素B1:0. 1%，丙氨酸0. 1%，蔗糖0. 1%，蛋白胨O. 05%。表I
權(quán)利要求
1.一種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑，其特征在于，包括淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)孢子粉或孢子發(fā)酵液、孢子萌發(fā)促進(jìn)劑；其中，所述的孢子萌發(fā)促進(jìn)劑選自維生素B1、糖類物質(zhì)、氨基酸大分子或有機(jī)氮源中的一種或一種以上；優(yōu)選的，所述的糖類物質(zhì)是蔗糖、D-山梨醇、麥芽糖或肌醇；所述氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺或；所述的大分子有機(jī)氮源是蛋白胨或牛肉膏。
2.—種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑，其特征在于，包括淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液、維生素BI。
3.按照權(quán)利要求2所述的復(fù)配制劑，其特征在于，各組分的用量為按質(zhì)量百分比計(jì)，淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 8-99. 95%，維生素BI O. 05-0. 2% ;優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液99. 9%，維生素BI O. 1%。
4.一種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑，其特征在于，包括淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液、維生素BI和糖類物質(zhì)；所述糖類物質(zhì)是蔗糖、D-山梨醇、麥芽糖或肌醇。
5.按照權(quán)利要求4所述的復(fù)配制劑，其特征在于，各組分的用量為按質(zhì)量百分比計(jì)，淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 6-99. 9%，維生素B10. 05-0. 2%、糖類物質(zhì)O. 05-0. 2% ；優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 75%，維生素B10. 1%、糖類物質(zhì) O. 15%。
6.一種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑，其特征在于，包括淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液、維生素B1、糖類物質(zhì)和氨基酸；所述糖類物質(zhì)是蔗糖、D-山梨醇、麥芽糖或肌醇；所述氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺。
7.按照權(quán)利要求6所述的復(fù)配制劑，其特征在于，各組分的用量為按質(zhì)量百分比計(jì)，淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 4-99. 85%，維生素BI O. 05-0. 2%、糖類物質(zhì)O.05-0. 2%、氨基酸O. 05-0. 2% ;優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 65%，維生素BI O. 1%、糖類物質(zhì)O. 15%、氨基酸O. 1%。
8.—種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配制劑，其特征在于，由以下組分組成淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液、維生素B1、糖類物質(zhì)、氨基酸和大分子有機(jī)氮源；所述的糖類物質(zhì)是蔗糖、D-山梨醇、麥芽糖或肌醇；所述氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸、L-谷氨酸或L-天冬酰胺；所述的大分子有機(jī)氮源為蛋白胨或牛肉膏。
9.按照權(quán)利要求8所述的復(fù)配制劑，其特征在于，各組分的用量為按質(zhì)量百分比計(jì)，淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 2-99. 8%，維生素B10. 05-0. 2%、糖類物質(zhì)O. 05-0. 2%、氨基酸O. 05-0. 2%、大分子有機(jī)氮源O. 05-0. 2% ;優(yōu)選的，各組分的用量為淡紫擬青霉孢子粉或孢子發(fā)酵液99. 55%，維生素BI O. 1%、糖類物質(zhì)O. 15%、氨基酸O. 1%、大分子有機(jī)氮源O. 1% ；所述糖類物質(zhì)是蔗糖；所述氨基酸是L-丙氨酸；所述大分子有機(jī)氮源是蛋白胨。
10.權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的復(fù)配制劑在防治根結(jié)線蟲(chóng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種線蟲(chóng)卵寄生真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配菌劑及其制備方法和應(yīng)用。所述真菌和孢子萌發(fā)促進(jìn)劑復(fù)配菌劑包括淡紫擬青霉孢子粉或發(fā)酵液、孢子萌發(fā)促進(jìn)劑。本發(fā)明采用正交試驗(yàn)獲得能夠促進(jìn)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最佳組合，并通過(guò)室內(nèi)生測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其促進(jìn)淡紫擬青霉孢子萌發(fā)及防治根結(jié)線蟲(chóng)的生防效果。本發(fā)明復(fù)配菌劑作用于根結(jié)線蟲(chóng)5天，對(duì)于根結(jié)線蟲(chóng)卵寄生率就可達(dá)80%以上，根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化率幾乎為零，明顯優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明復(fù)配菌劑中所添加的孢子萌發(fā)促進(jìn)劑能夠有效促進(jìn)孢子萌發(fā)從而提高了淡紫擬青霉對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生率并縮短了作用時(shí)間，最終顯著提高了對(duì)植物根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果。
文檔編號(hào)A01P5/00GK102986737SQ201210424889
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者王曦茁, 汪來(lái)發(fā), 郭志斌, 馬建偉, 樸春根, 李永 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所