專利名稱：防治魔芋軟腐病的生防菌株kmxu22及其生防菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治魔芋軟腐病的生防菌株KMXY22及其生防菌劑，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
魔芋(Amorphophallus konjac)是多年生草本植物,也是世界上迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一高含葡苷聚糖(konjac glucomannan, KGM)的特種經(jīng)濟作物(劉佩英，2004)。因其具有獨特理化性質(zhì)和凝膠復(fù)配等功能，目前魔芋產(chǎn)品被廣泛用于食品、保健、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域，并被WHO評為十大保健食品之一。此外，魔芋還能作為再生性資源，能有效替代其他植物膠，緩解資源壓力。全球魔芋適種地區(qū)主要分布在亞洲和非洲，人工規(guī)模化種植主要是日本和中國。日本因土地、勞動力資源有限等原因，近年來魔芋產(chǎn)業(yè)開始嚴(yán)重萎縮，而中國已成為世界魔芋原料生產(chǎn)與供給中心，占全球的60%，且種植規(guī)模有進(jìn)一步擴大趨勢。目前我國魔芋種植面積約為150萬畝，根據(jù)中國園藝學(xué)會魔芋協(xié)會預(yù)計，我國魔芋最適種植面積在300萬畝以上，產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮?。?xì)菌性軟腐病(BSR)是魔芋生產(chǎn)上極易發(fā)生的重要病害，時常給魔芋種植業(yè)帶來毀滅性的災(zāi)害，從種植到儲藏都易發(fā)病，我國以云南、四川、重慶、湖北等魔芋主產(chǎn)地危害較為嚴(yán)重，國外，以日本發(fā)病比較嚴(yán)重。同時，該病還能危害多種蔬菜如白菜、生菜等，常造成重大的經(jīng)濟損失。魔芋種植基地平均病株率25%以上，減產(chǎn)達(dá)30-80%。嚴(yán)重時部分田塊基本絕收，嚴(yán)重挫傷了農(nóng)民種植魔芋的積極性。目前在魔芋生產(chǎn)上尚未培育出有效的抗病品種，也無防治該病的特效藥劑，導(dǎo)致該病近幾年頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重制約著魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展(崔鳴等，2009)。已有報道表明，引起我國魔芋軟腐病菌魔芋的病原為胡蘿卜軟腐果膠桿菌(歐文氏菌)胡蘿卜軟腐亞種 Pectobacterium(Erwinia) carotovora subsp. carotovora(Pcc,又稱Ecc)和菊歐文氏菌Erwinia chrysantherni (Ech),以Pcc為優(yōu)勢種群，占80%以上(修建華等，2006 ;李曉紅，2009)。眾多研究結(jié)果表明軟腐病菌不能直接侵染魔芋球莖，但會侵染芽鞘、根和傷口 ；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)球莖表面無氣孔也無皮孔，另外，感病芽鞘氣孔周圍沒有病原菌聚集，表明魔芋軟腐病菌侵染途徑與馬鈴薯軟腐病從皮孔侵入不同，且不能從氣孔侵入(吳金平，2010)。化學(xué)農(nóng)業(yè)對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞，病原菌對藥劑的抗性也越來越明顯，同時化學(xué)農(nóng)藥不易降解，高殘留，對人畜不安全等都嚴(yán)重限制了將來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用，特別是魔芋這一類高附加值的特種經(jīng)濟作物，目前魔芋產(chǎn)品已經(jīng)被廣泛用于食品、保健、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域。因此，非化學(xué)類防治措施目前逐漸成為防治魔芋軟腐病及土傳病害的核心方式，而生物防治則為最有前途的方法。突光假單胞菌(Psdeuomnoda fluorescens)在植物病害防治方面，國內(nèi)外均有一些報道，其一方面能夠作物植物促生長菌劑，增強作物抗病性；另一方面能夠作為生防菌劑，防治作物病害。本發(fā)明利用健康魔芋內(nèi)生的熒光假 單胞菌(P. fluorescens)防治魔芋軟腐病，國內(nèi)外尚未見報道與利用。參考文獻(xiàn)
[I]劉佩英.魔芋學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.[2]崔鳴，李川.魔芋軟腐病的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)研究進(jìn)展.中國植保導(dǎo)干Ij，2009，29(6) :33-35.[3]修建華，姬廣海，王敏，等.魔芋軟腐病菌分子鑒定與遺傳多樣性.微生物學(xué)報，2006，46(4): 522-525.[4]李曉紅.魔芋軟腐病菌致病性測定及遺傳多樣性分析.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009.[5]吳金平.魔芋軟腐病病原菌及其拮抗菌的研究.武漢大學(xué)博士學(xué)位論文，2010.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中魔芋軟腐病防治難度大、成本高，不宜使用化學(xué)農(nóng)藥和農(nóng)藥殘留高的問題，而提供一種防治魔芋軟腐病的生防菌株KMXY22及其生防菌劑。本發(fā)明從健康魔芋植株中分離得到了分離了一株具有防治魔芋軟腐病的菌株KMXY22，對其鑒定結(jié)果表明該細(xì)菌屬于熒光假單孢菌，該菌株命名為熒光假單孢菌(Psdeuomnoda fluorescens) KMXY22。該菌株已經(jīng)保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日期2012年9月21 日；保藏號為 CGMCC NO. 6597。本發(fā)明的菌體特征及菌落特征菌株為桿狀，大小為0.4iinT0. 7iimX1.0iim 1. 2iim，革蘭氏染色陰性，無芽孢，單極生鞭毛，能運動。在KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成1.2mm菌落，菌落產(chǎn)生橙色或褐黃色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊；所述的LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化鈉(NaCl) 5g/L，pH7.0，瓊脂 17g/L。本發(fā)明的生防菌劑經(jīng)過如下步驟得到a.將菌株KMXY22移植到含有LB培養(yǎng)基的試管進(jìn)行一環(huán)活化，32 V培養(yǎng)48小時；LB液體培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L，pH7. 0 ；b.取一環(huán)活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH7. 0 的 LB培養(yǎng)液中，在120轉(zhuǎn)/min、32 °C下培養(yǎng)72小時，獲得發(fā)酵菌液；c.將發(fā)酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，種子罐的溫度32°C,發(fā)酵18小時或19小時或20小時后獲得發(fā)酵種子菌種；d.將發(fā)酵種子菌種按接種量1:20倍的比例接種于發(fā)酵罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐的溫度為32°C,接種發(fā)酵菌液菌體5小時后,每隔2小時對發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察含菌量、測定發(fā)酵液的酸堿度，發(fā)酵72-96小時，當(dāng)菌含量大于
2X 101° 2 X IO11 CFU/ml以上，酸堿度為7. 0 7. 6時，儲存作為生防菌劑。本發(fā)明所用的設(shè)備均為市場銷售的通用設(shè)備。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、本發(fā)明的菌株KMXY22，分離自魔芋健康植株，為魔芋內(nèi)生細(xì)菌，具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境和有較好的生防作用。2、本發(fā)明的生防菌劑制作容易且成本低，無毒、無害、及無環(huán)境污染，有利于魔芋產(chǎn)業(yè)的有機栽培，保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，實施農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展；該菌劑還具有促生增產(chǎn)作用，有利于改良魔芋種植土壤，增加土壤中的微生物活性。3、平板拮抗實驗表明KMXY22菌劑對魔芋軟腐病菌和相關(guān)植物病原細(xì)菌具有明顯的抑制作用。4、溫室小區(qū)試驗結(jié)果顯示KMXY22菌劑能有效控制魔芋軟腐病菌對魔芋植株的侵染，抑制病原菌的生長，達(dá)到控制軟腐病病情發(fā)生的效果。另外，KMXY22菌劑能有效促進(jìn)魔芋植株的生長并提高其抗逆和抗病性。 5、大田和溫室試驗結(jié)果顯示KMXY22菌劑對魔芋軟腐病防效為73 84%，增產(chǎn)20 25%。
具體實施例方式實施例所用的設(shè)備均為市場銷售的通用設(shè)備。實施例1 :生防菌劑的制備本發(fā)明的生防菌劑經(jīng)過如下步驟得到a.將菌株KMXY22移植到含有LB培養(yǎng)基的試管進(jìn)行一環(huán)活化，32 V培養(yǎng)48小時；LB液體培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L，pH7. 0 ；b.取一環(huán)活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH7. 0 的 LB培養(yǎng)液中，在120轉(zhuǎn)/min、32 °C下培養(yǎng)72小時，獲得發(fā)酵菌液；c.將發(fā)酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，種子罐的溫度32°C,發(fā)酵18小時或19小時或20小時后獲得發(fā)酵種子菌種；d.將發(fā)酵種子菌種按接種量1:20倍的比例接種于發(fā)酵罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐的溫度為32°C,接種發(fā)酵菌液菌體5小時后,每隔2小時對發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察含菌量、測定發(fā)酵液的酸堿度，發(fā)酵發(fā)酵72小時或86小時或96小時，當(dāng)菌含量大于2 X 101° 2 X IO11 CFU/ml以上，酸堿度為7. 0或7. 6時，儲存作為生防菌劑。實施例2 :平板拮抗試驗采用打孔法對魔芋軟腐病菌的抑制效果進(jìn)行評價。將魔芋軟腐病病原細(xì)菌懸液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上(牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，蛋白胨10. 0g，水1000ml，瓊脂10. 0g, pH7. 0，下同)，用無菌打孔器均勻打4個6mm孔，向孔內(nèi)加入50 的KMXY22發(fā)酵液。32°C培養(yǎng)一天后，抑菌圈直徑平均達(dá)到30. 2mm。說明KMXY22菌株對魔芋軟腐病菌具有顯著的抑制作用。實施例3 :魔芋軟腐病溫室防效試驗
設(shè)三個處理，處理I為滅菌水對照組，處理2為KMXY22菌劑，處理3為殺細(xì)菌劑72%農(nóng)用硫酸鏈霉素(青島農(nóng)樂化工偉業(yè)有限公司)2000倍液。魔芋一年生種球種植入魔芋軟腐病菌病土中，種植前用KMXY22菌劑浸種30分鐘，作物種植15 20天后用1: 40倍的KMXY22菌劑穴灌，每公斤液體穴灌8-10株作物；作物種植100天后用1: 40倍KMXY22菌劑灌根一次，每公斤液體灌根5-6株作物。其他清水對照和72%農(nóng)用硫酸鏈霉素農(nóng)藥處理同上述方法和用量。每667 Hf施用該制劑的量，根據(jù)作物移栽株數(shù)計算而定。結(jié)果顯示，KMXY22菌劑在溫室試驗中對魔芋軟腐病的防效達(dá)86. 91%，高于農(nóng)藥對照組。同時該KMXY22菌劑能促進(jìn)水稻植株的生長，生物量增長率為24. 95% (表I所示)。2010年3月15日移栽一年生魔芋植株，在2010年11月進(jìn)行調(diào)查，考察魔芋的生長和病害發(fā)生狀況。表I KMXY22對魔芋軟腐病菌的溫室試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.防治魔芋軟腐病的生防菌株KMXU22，為熒光假單孢菌(Psdeuomnoda fluorescens),該菌株2012年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO. 6597。
2.用權(quán)利要求1所述的生防菌株KMXU22制備的生防菌劑，其特征在于該生防菌劑經(jīng)如下步驟得到a.將菌株KMXY22移植到含有LB培養(yǎng)基的試管進(jìn)行一環(huán)活化，32V培養(yǎng)48小時，LB 培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0，瓊脂17g/L ;b.取一環(huán)活化后的菌苔移入用IOOOml錐形瓶裝的600ml配方為胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，pH7. O的LB培養(yǎng)液中，在120轉(zhuǎn)/min、32 °C下培養(yǎng)72小時， 獲得發(fā)酵菌液；c.將發(fā)酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，種子罐的溫度32°C，發(fā)酵18-20小時后獲得發(fā)酵種子菌種；d.將發(fā)酵種子菌種按接種量1:20倍的比例接種于發(fā)酵罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐的溫度為32°C,接種發(fā)酵菌液菌體5小時后，每隔2小時對發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察含菌量、測定發(fā)酵液的酸堿度，發(fā)酵72-96小時，當(dāng)菌含量大于 2 X 101° 2 X IO11 CFU/ml以上，酸堿度為7. O 7. 6時，儲存作為生防菌劑。
全文摘要
防治魔芋軟腐病的生防菌株KMXU22及其生防菌劑，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株KMXU22的保藏號為CGMCC NO. 6597。菌劑經(jīng)如下步驟得到菌株KMXY22移植到試管一環(huán)活化，32 ℃ 培養(yǎng)48小時，試管中的LB液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化鈉 5g/L，pH7.0；活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml配方同a.的LB培養(yǎng)液中，120轉(zhuǎn)/min、32 ℃下培養(yǎng)72小時，獲得發(fā)酵菌液； 將發(fā)酵菌液按接種量1200培的比例接種于種子罐中的LB培養(yǎng)液中，溫度32℃，發(fā)酵18-20小時后獲得發(fā)酵種子菌種； 將發(fā)酵種子菌種按接種量120倍的比例接種于發(fā)酵罐中，溫度為32℃，發(fā)酵72-96小時，當(dāng)菌含量大于2×1010～2×1011 CFU/ml以上，酸堿度為7.0～7.6時，儲存作為生防菌劑。本發(fā)明成本低，無毒害及污染，生防效果佳。
文檔編號A01N63/00GK103013853SQ20121041002
公開日2013年4月3日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者余磊, 趙建榮 申請人:昆明學(xué)院