專利名稱：一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種有益的根際微生物。其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，可生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。將其制備成活菌制劑添加至飼料中，不僅能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，還能減少動(dòng)物腸道內(nèi)的有害菌，從而降低動(dòng)物的發(fā)病率?，F(xiàn)有的飼用枯草芽孢桿菌制劑，普遍存在活菌濃度不夠高、穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)。中 國(guó)專利申請(qǐng)201010604530. 9公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法，該方法采用液體深層發(fā)酵制備含有枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液，然后再將發(fā)酵液制備成液體制劑或經(jīng)閃蒸后制備成粉體制劑。該方法雖然在一定程度上提高了枯草芽孢桿菌制劑的活菌濃度和穩(wěn)定性，但仍存在諸多不足之處，主要包括1、該方法并未對(duì)制劑中枯草芽孢桿菌的芽孢率進(jìn)行考察，而芽孢率直接影響菌體的保存和復(fù)活，是影響制劑質(zhì)量和穩(wěn)定性的重要因素；2、該方法采用的發(fā)酵培養(yǎng)基包含氮源、碳源、金屬離子等多種成分，其配制過(guò)程復(fù)雜，成本高；3、該方法發(fā)酵時(shí)需采用壓力容器，對(duì)設(shè)備要求高，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)成本低、菌體轉(zhuǎn)化率高的枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以下步驟
a、將枯草芽孢桿菌種液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的O. 2-0. 5%，在30-37°C、攪拌轉(zhuǎn)速為200-300rpm、通氣體積比1:0. 5-0. 8的條件下，發(fā)酵10_18h，得到發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方以質(zhì)量體積比計(jì)為玉米粉I. 0-2. 0%，低溫豆粉I. 0-2. 0%，消泡劑O. 2-0. 5%，其余為水；
上述枯草芽孢桿菌種液是按照常規(guī)方法，由市售枯草芽孢桿菌菌株擴(kuò)大培養(yǎng)得到的。上述低溫豆粉是指優(yōu)質(zhì)大豆在不經(jīng)過(guò)加熱的條件下，將大豆所含油脂壓榨完畢后得到脫油的豆餅，豆餅再經(jīng)干燥研磨處理得到的固定細(xì)度的粉末。b、向a步驟所得發(fā)酵液中添加沸石粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的2-6%，攪拌均勻后噴霧干燥，得到枯草芽孢桿菌干粉。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基采用玉米粉、低溫豆粉等；上述原料廉價(jià)易得，生產(chǎn)成本低。加入消泡劑后，能有效減少發(fā)酵培養(yǎng)基中的泡沫，有利于發(fā)酵培養(yǎng)基的攪拌和通氣，從而有利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和芽孢化；所得發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的活菌濃度高達(dá)
I.01 X 109cfu/mL以上。向發(fā)酵液中添加沸石粉，能夠?qū)莶菅挎邨U菌的芽孢起到良好的吸附作用，避免芽孢在后續(xù)噴霧干燥過(guò)程中受到損傷；所得枯草芽孢桿菌干粉制劑中活菌濃度高達(dá)4. O X 108cfu/g以上，芽孢率高達(dá)98%以上。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，無(wú)需添加Mg2+、Mn2+Xu2+等金屬離子即可得到高芽孢率的枯草芽孢桿菌干粉制劑。該干粉制劑的高芽孢率保障了其儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中的穩(wěn)定性和飼喂后的繁殖性能。本發(fā)明的制備方法，還具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)；其發(fā)酵步驟在常壓下即可進(jìn)行，對(duì)設(shè)備要求低。本發(fā)明a步驟中的發(fā)酵培養(yǎng)基在接入枯草芽孢桿菌種液之前，最好于115-125 下滅菌20-30min，然后冷卻至常溫備用。發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌處理可有效避免雜菌污染，提高所得發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的純度。本發(fā)明所述消泡劑可以是聚醚型消泡劑、硅油型消泡劑、有機(jī)硅消泡劑中的任意一種，優(yōu)選聚醚消泡劑。本發(fā)明所述噴霧干燥，其工藝條件優(yōu)選進(jìn)風(fēng)溫度180-200°c、出風(fēng)溫度70-100°C、進(jìn)料速度3-5 L/h。在該工藝條件下，干燥速率較快，同時(shí)，枯草芽孢桿菌的芽孢損傷較小，所得枯草芽孢桿菌干粉粒度均勻。 本發(fā)明還提供了一種按照上述方法制備的枯草芽孢桿菌干粉。上述枯草芽孢桿菌干粉中，枯草芽孢桿菌活菌濃度> 5.3X108cfu/g，芽孢率
彡 98%ο本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌干粉具有活菌濃度高、芽孢率高的特點(diǎn)，從而使其具有穩(wěn)定性強(qiáng)、繁殖性好的優(yōu)勢(shì)；本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌干粉的制備方法，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，效果優(yōu)良，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和推廣價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面用具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但并不以任何方式意味著對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。下述實(shí)施例所采用的枯草芽孢桿菌菌株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為 ACCC01430。實(shí)施例I
a、枯草芽孢桿菌種液的制備將上述枯草芽孢桿菌菌株在無(wú)菌環(huán)境下接入IL三角玻璃搖瓶LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-14h，培養(yǎng)基裝量為20%，全程培養(yǎng)溫度為30-32°C，培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 200-220rpm。發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將I. Okg玉米粉、I. Okg低溫豆粉、O. 2kg的聚醚消泡劑混合后，加水至100L,混合均勻后于115_125°C下滅菌20-30min,冷卻至常溫備用?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵取上述枯草芽孢桿菌種液O. 2kg接種至上述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，控制溫度為30-32°C、攪拌轉(zhuǎn)速為200-220rpm、通氣體積比為1:0. 5，發(fā)酵10h，得到發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的PH值自然變化，采用平板稀釋法測(cè)定發(fā)酵液中的枯草芽孢桿菌活菌濃度，結(jié)果為I. 01 X 109cfu/mL ；
b、噴霧干燥向a步驟所得發(fā)酵液中添加沸石粉，作為菌體附著劑，沸石粉添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的2%，攪拌O. 5h后，進(jìn)行噴霧干燥處理。噴霧干燥設(shè)備的進(jìn)風(fēng)溫度為180-190°C,出風(fēng)溫度為70-80°C，進(jìn)料速度為3L/h，得到枯草芽孢桿菌干粉。經(jīng)平板稀釋法測(cè)定其中的枯草芽孢桿菌活菌濃度，結(jié)果為5. 3X108cfu/g ;采用結(jié)晶紫染色法，于油鏡下觀察，測(cè)得其芽孢率為98%。結(jié)果表明本發(fā)明方法所得枯草芽孢桿菌制劑活菌濃度高、芽孢率高。實(shí)施例2
a、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將2.Okg玉米粉、2. Okg低溫豆粉、O. 5kg的聚醚消泡劑混合后，加水至100L，混合均勻后于115-125°C下滅菌20_30min，冷卻至常溫備用。枯草芽孢桿菌發(fā)酵取實(shí)施例I中制備的枯草芽孢桿菌種液O. 5kg接種至上述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，控制溫度為35-37°C、攪拌轉(zhuǎn)速為280-300rpm、通氣體積比為1:0. 8，發(fā)酵18h，得到發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH值自然變化，采用平板稀釋法測(cè)定發(fā)酵液中的枯草芽孢桿菌活菌濃度，結(jié)果為I. 17X109cfu/mL ；
b、噴霧干燥向a步驟所得發(fā)酵液中添加沸石石粉，作為菌體附著劑，沸石石粉添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的6%，攪拌Ih后，進(jìn)行噴霧干燥處理。噴霧干燥設(shè)備的進(jìn)風(fēng)溫度為190-200°C，出風(fēng)溫度為90-100°C，進(jìn)料速度為5L/h，得到枯草芽孢桿菌干粉。經(jīng)平板稀釋法測(cè)定其中的枯草芽孢桿菌活菌濃度，結(jié)果為5. 5X 108cfu/g ;采用結(jié)晶紫染色法，于油鏡下觀察，測(cè)得其芽孢率為98%。結(jié)果表明本發(fā)明方法所得枯草芽孢桿菌制劑活菌濃度高、芽孢率高。實(shí)施例3
a、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將I.5kg玉米粉、I. 8kg低溫豆粉、O. 3kg的聚醚消泡劑混合后，加水至100L，混合均勻后于115-125°C下滅菌20_30min，冷卻至常溫備用?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵取實(shí)施例I中制備的枯草芽孢桿菌種液O. 3kg接種至上述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，控制溫度為32-35°C、攪拌轉(zhuǎn)速為220-280rpm、通氣體積比為1:0. 6，發(fā)酵15h，得到發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH值自然變化，采用平板稀釋法測(cè)定發(fā)酵液中的枯草芽孢桿菌活菌濃度，結(jié)果為I. 24X 109cfu/mL ；
b、噴霧干燥向a步驟所得發(fā)酵液中添加沸石石粉，作為菌體附著劑，沸石石粉添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的4%,攪拌45min后，進(jìn)行噴霧干燥處理。噴霧干燥設(shè)備的進(jìn)風(fēng)溫度為185-195°C，出風(fēng)溫度為80-90°C，進(jìn)料速度為4L/h，得到枯草芽孢桿菌干粉。經(jīng)平板稀釋法測(cè)定其中的枯草芽孢桿菌活菌濃度，結(jié)果為5. 6X 108cfu/g ;采用結(jié)晶紫染色法，于油鏡下觀察，測(cè)得其芽孢率為99%。結(jié)果表明本發(fā)明方法所得枯草芽孢桿菌制劑活菌濃度高、芽孢率高。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟 a、將枯草芽孢桿菌種液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的O.2-0. 5%，在30-37°C、攪拌轉(zhuǎn)速為200-300rpm、通氣體積比為1:0. 5-0. 8的條件下，發(fā)酵10_18h，得到發(fā)酵液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方以質(zhì)量體積比計(jì)為玉米粉I. 0-2. 0%，低溫豆粉I. 0-2. 0%，消泡劑O. 2-0. 5%，其余為水； b、向a步驟所得發(fā)酵液中添加沸石石粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的2-6%，攪拌均勻后噴霧干燥，得到枯草芽孢桿菌干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于a步驟所述發(fā)酵培養(yǎng)基在接種前，于115_125°C下滅菌20-30min，然后冷卻至常溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于所述消泡劑為聚醚消泡劑、硅油消泡劑、有機(jī)硅消泡劑中任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于所述噴霧干燥，其工藝條件為進(jìn)風(fēng)溫度180-200°C、出風(fēng)溫度70-100°C、進(jìn)料速度3_5 L/h。
5.—種枯草芽孢桿菌制劑,其特征在于它是由權(quán)利要求1 4中任意一項(xiàng)所述制備方法制備的枯草芽孢桿菌干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于該制劑中枯草芽孢桿菌活菌濃度彡5. 3X 108cfu/g，芽孢率彡98%ο
全文摘要
本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法，該制劑的制備方法是將枯草芽孢桿菌種液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。然后向發(fā)酵液中加入沸石石粉，混合均勻后進(jìn)行噴霧干燥，得到所述枯草芽孢桿菌制劑。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方以質(zhì)量體積比計(jì)為玉米粉1.0-2.0%，低溫豆粉1.0-2.0%，消泡劑0.2-0.5%，其余為水。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌制劑具有活菌濃度高、芽孢率高的優(yōu)點(diǎn)，其制備方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉。
文檔編號(hào)A23K1/16GK102919534SQ20121039872
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者劉磊, 谷新華, 袁昉 申請(qǐng)人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司