專利名稱：含嗜酸乳桿菌的飼料添加劑在抗氧化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用技術(shù)，具體地說是涉及含嗜酸乳桿菌(LactobaciIIusacidophilus)新菌株的飼料添加劑在抗氧化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動物體在新陳代謝的過程中會形成活性氧自由基，如超氧自由基(O2 ·-)、羥基自由基(HO·)、過氧化氫(H2O2)等，適量的自由基與穩(wěn)定的氧分子維持著巧妙的生理平衡?；钚匝踝杂苫南饕蕾囉跈C體的抗氧化防御系統(tǒng)的預(yù)防性或阻斷性控制。機體內(nèi)天然的抗氧化系統(tǒng)包括酶類及非酶類兩大類，前者主要是指超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)過氧化物酶(P0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等。后者則是指一些小分子的有機物質(zhì)，也稱之為體內(nèi)天然的抗氧化劑，如維生素E、維生素C、輔酶Q、半胱氨酸、谷胱甘肽及微量元素硒(Se)等。 由于許多化學(xué)合成的抗氧化物存在安全問題，因而發(fā)現(xiàn)安全的有抗氧化活性的天然產(chǎn)物，用以維持體內(nèi)氧化還原的平衡，是一個人們長期關(guān)注和努力的問題。近年來的研究證實，乳酸桿菌具有不同的抗氧化活性，雖然其抗氧化活性己經(jīng)得到了體內(nèi)及體外實驗的證實，但國內(nèi)外的乳酸桿菌制品的研究狀況表明還存在一些問題，尤其是應(yīng)用于產(chǎn)品中的乳酸桿菌菌株的選擇，既要有生理功能又要求菌體能耐受不利于生存的胃腸道的體內(nèi)逆環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供含嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) CGMCC No. 5093的飼料添加劑在提高肉雞抗氧化性能中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述飼料添加劑由嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093凍干粉和載體組成。其中，所述載體優(yōu)選為脫脂奶粉。其中，嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093凍干粉和脫脂奶粉的重量比為1 I. 5 :1 10。其中，所述的嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093凍干粉的活菌數(shù)為IO1c1-IOllCfu/^在本發(fā)明的一個實施方案中，將所述飼料添加劑添加到肉雞基礎(chǔ)日糧中，使所述嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093的活菌數(shù)在基礎(chǔ)日糧中達到107cfu/g以上。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) CGMCC NO. 5093 已在CN201110396544. O 中公布。本發(fā)明提供的嗜酸乳桿菌既對胃腸道環(huán)境具有較強的耐受性，由其制備的飼料添加劑添加進肉雞飼料中后，可升高肉雞血清中SOD、CAT, GSH-Px活力，降低血清和肝臟中的MDA含量。因此，該菌株可用于開發(fā)成飼料添加劑或預(yù)混料添加進肉雞的日糧中，提高肉雞機體抗氧化性能，改善肉品質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I嗜酸乳桿菌的耐受性分析益生菌在進入大腸之前必須適應(yīng)或耐受胃中鹽酸和小腸中高濃度膽鹽的生活環(huán)境，能夠與腸道內(nèi)其它微生物競爭并達到可控制有害微生物繁殖所需的數(shù)量與存活率，這都是益生菌發(fā)揮作用的先決條件。I. I耐酸性試驗嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093菌種活化2代后的液體培養(yǎng)物按2% (w/v)分別加入pH為2. O, 3. O, 4. O, 7. O (對照)的PBS緩沖液中，混勻后置37°C培養(yǎng)箱處理2h，稀釋到適當(dāng)濃度，而后取O. Iml菌懸液，進行平皿菌落計數(shù)，計算酸處理過的菌株存活率=A1AciXKKF0,A1為處理2h后的每毫升活菌數(shù)(CFU/mL)，A0為pH 7. O時每毫升活菌數(shù)(CFU/mL)。
1.2膽汁酸鹽耐受性試驗嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093菌種活化2代后的嗜酸乳桿菌液體培養(yǎng)物按2%接種量接入含豬膽汁酸鈉分別為0% (對照)，0. 1%、0. 2%和O. 3%的PBS緩沖液中，混勻后置37°C培養(yǎng)箱處理2h，稀釋到適當(dāng)濃度，而后取O. Iml菌懸液，進行平皿菌落計數(shù)，計算酸處理過的菌株存活率=A1AtlX 100%, A1為處理2h后的每毫升活菌數(shù)(CFU/mL)，Atl為pH 7. O時每毫升活菌數(shù)(CFU/mL)。耐受性結(jié)果顯示，經(jīng)過37°C溫育2h之后，嗜酸乳桿菌在pH2. 0、pH 3. O,pH 4. O的存活率分別為49. 2%,65. 1%、89· 6%。菌株在O. 1% (w/v),O. 2%和O. 3%濃度的豬膽鹽經(jīng)過37°C溫育2h之后，存活率分別為95%，90%和78%。這表明該嗜酸乳桿菌菌株對膽鹽有較好的耐受性。實施例2嗜酸乳桿菌的飼料添加劑的制備嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093的凍干粉的制備，包括如下步驟(I)菌株的活化將_80°C凍存保存的嗜酸乳桿菌按10%的接種量向MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)20-24h ；(2)種子液的制備將活化的發(fā)酵液按2%的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其質(zhì)量體積比如下葡萄糖1%，大豆蛋白胨2%，酵母膏1%，硫酸銨O. 5%，磷酸氫二鉀O. 2%、氯化鈉O. 2%，硫酸鎂O. 05% ；(3)按1-2%的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入(2)所提供的嗜酸乳桿菌種子液，發(fā)酵條件為37°C，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)18h，得到的發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心IOmin收集菌體，用滅菌蒸餾水洗滌后向菌體沉淀中加入20% (w/v)的凍干保護劑(配方為脫脂奶7%，海藻糖I. 5%，甘油2. 5%，谷氨酸鈉I. 5%，無菌水IOOmL)，-80°C冷凍干燥20h，制成活菌數(shù)為5X10ncfu/g左右的凍干粉。將制備的凍干菌粉中與脫脂奶粉按質(zhì)量比I :10混合均勻，即可得到本發(fā)明的嗜酸乳桿菌活菌制劑。實施例3含嗜酸乳桿菌的飼料添加劑在抗氧化中的應(yīng)用I.實驗方法I. I主要試劑
MDA, SOD、GSH-Px, CAT試劑盒由南京建成生物工程公司提供。I. 2實驗動物及分組選取健康I日齡商品代AA肉雞48只，隨即分成試驗組和對照組兩個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)6只雞，試驗期為21天。I. 3試驗日糧與飼養(yǎng)管理試驗參照《家禽營養(yǎng)需要》(NRC，1994)設(shè)計，采用玉米-豆柏型日糧。對照組飼喂肉雞常規(guī)日糧，試驗組在常規(guī)日糧中添加實施例2所制備的活菌制劑(添加量為1%。)，不含任何抗生素，使基礎(chǔ)日糧中活菌數(shù)為5 X 107cfu/g左右。按照本試驗雞場的常規(guī)管理程序進行免疫和日常管理，試驗在同一欄舍內(nèi)進行，飼養(yǎng)方式為四層階梯式籠養(yǎng)，每籠均放3只雞，每日兩遍給飼，即上午8:00，下午4:00。固定專人飼喂，自由采食，自動飲水器飲水，隨時觀察雞群的生產(chǎn)情況，發(fā)現(xiàn)疾病及時治療。 I. 4測定指標(biāo)血清指標(biāo)超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，過氧化氫酶(CAT)，丙二醛(MDA)，肝臟指標(biāo)MDA含量。各項指標(biāo)按照南京建成生物工程公司試劑盒使用說明書進行測定。I. 5樣品制備第21天飼喂后禁食12h，每個重復(fù)組隨即抽取3只雞，取樣測定各項指標(biāo)。本發(fā)明中肉雞血清的提取過程如下肉雞心臟取血，4°C靜置24h，部分血液離心(lOOOOrpm，IOmin)后分離紅細胞和血清，測定SOD活力，GSH-Px活力，CAT活力，MDA含量。本發(fā)明中肝臟組織勻漿的制備方法如下肉雞心臟采血后處死，取肝組織塊，用預(yù)冷至4°C的生理鹽水，除去血液，濾紙吸干，去掉結(jié)締組織。稱重后放入勻漿器中，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，充分磨碎，使組織勻漿化。將稀釋好的1:10組織勻漿液用低溫離心機1500rpm離心IOmin,留上清液,測定MDA含量I. 6統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS16. O軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用ANOVA過程進行方差分析，各處理間平均值的比較采用LSD多重比較進行差異顯著性檢驗，以p〈0. 05為差異顯著。各項指標(biāo)結(jié)果以均值土方差(Means土S. D.)表不。2.結(jié)果與分析2. I肉雞血清中SOD活力、GSH-Px活力的測定結(jié)果SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。利用試劑盒所示方法測血清中SOD酶和GSH-Px活性值如表I所示。表I嗜酸乳桿菌活菌制劑對肉雞血清中SOD活性、GSH-Px活力的影響
組別肉雞數(shù)(只) SOD (U/mL) GSH-Px活力(U)吋問組6201.35 ±1.78*211.67 ±2 68 試驗組 6 237.13 ± 1.25 231.05 + 2 33
注* p<0. 05，** p<0. 01由表I可見，試驗組肉雞的血清中SOD活力和GSH-Px活力均高于對照組，而用血清中SOD活力顯著升高(p〈0. 05)，說明嗜酸乳桿菌活菌體制劑能夠顯著提高肉雞血清中SOD活性，從而具有抵抗自由基損傷的作用；試驗組GSH-Px活力與對照組相比有所提高，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異(P>0. 05)，可能原因是GSH-Px酶已處于對抗衰老物質(zhì)不敏感的狀態(tài)。2. 2肉雞血清中CAT活力和MDA含量的測定結(jié)果表2嗜酸乳桿菌活菌制劑對肉雞血清中CAT活力、MDA含量的影響
權(quán)利要求
1.含嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC No. 5093的飼料添加劑在提高肉雞抗氧化性能中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述飼料添加劑由嗜酸乳桿菌CGMCCNo. 5093凍干粉和載體組成。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的載體為脫脂奶粉。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，嗜酸乳桿菌CGMCCNo. 5093凍干粉和脫脂奶粉的重量比為1 I. 5 :1 10。
5.如權(quán)利要求2 4任ー項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的嗜酸乳桿菌CGMCCNo. 5093凍干粉的活菌數(shù)為IOici-IO11Cfu/^
6.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述飼料添加劑添加到肉雞基礎(chǔ)日糧中，使所述嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093的活菌數(shù)在基礎(chǔ)日糧中達到107cfu/g以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了含嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC No.5093的飼料添加劑在提高肉雞抗氧化性能中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的嗜酸乳桿菌既對胃腸道環(huán)境具有較強的耐受性，由其制備的飼料添加劑添加進肉雞飼料中后，可升高肉雞血清中SOD、CAT，GSH-Px活力，降低血清和肝臟中的MDA含量。因此，該菌株可作為飼料添加劑或預(yù)混料添加進肉雞的日糧中，提高肉雞機體抗氧化性能，改善肉品質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A23K1/16GK102860419SQ20121035211
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者王凡, 李曉清, 劉婷, 陳麗仙, 王安如 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 浙江大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司, 宿遷大北農(nóng)飼料有限責(zé)任公司