專利名稱：一種抗豬熱應(yīng)激的富硒復(fù)合菌飼料添加劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼料添加劑的應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種抗豬熱應(yīng)激的富硒復(fù)合菌飼料添加劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)南方的大部分地區(qū)夏季和初秋氣溫高、濕度大，中北部近年來(lái)夏季氣溫也很高，加上沒(méi)有像發(fā)達(dá)國(guó)家那樣采用控溫控濕全封閉的豬舍，因此豬的熱應(yīng)激問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，特別是對(duì)集約化高密度飼養(yǎng)下的豬產(chǎn)生了極大地影響。國(guó)外學(xué)者報(bào)道，18-28公斤的小豬在35°C環(huán)境溫度時(shí)，其體溫可高出正常體溫I. 4°C，長(zhǎng)期暴露在高溫下的豬，過(guò)多的產(chǎn)熱蓄積在體內(nèi)不能散出，導(dǎo)致豬的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生變化，引起熱應(yīng)激。熱應(yīng)激的豬表現(xiàn)為精神沉郁、體溫升高、心跳加快、呼吸急促甚至發(fā)生熱性喘息、采食減少、喜歡飲水、活動(dòng)量減少、伸張軀體、生長(zhǎng)緩慢或停滯、繁殖機(jī)能下降、抗氧化功能和免疫功能下降，這嚴(yán)重制約 了豬的生產(chǎn)效率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)外有許多減少豬熱應(yīng)激的措施。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家大多數(shù)豬場(chǎng)通過(guò)采用控溫控濕全封閉豬舍來(lái)解決這一難題。但是由于我國(guó)電價(jià)成本相對(duì)于豬肉價(jià)格較高，控溫控濕全封閉豬舍很難推廣；實(shí)際生產(chǎn)中，尤其在氣溫超過(guò)30°C時(shí)，通常采用通風(fēng)降溫結(jié)合沖洗等措施降低豬舍溫度，緩解熱應(yīng)激對(duì)豬只的不良影響。但是降溫的同時(shí)也極大的增加了豬舍濕度，不利于豬只自身體溫調(diào)節(jié)，所以作用非常有限。目前報(bào)道的抗熱應(yīng)激添加劑也較多，如電解質(zhì)平衡劑、酸制劑、藥物與生物制劑，但這些抗熱應(yīng)激添加劑的效果都不太理想，而長(zhǎng)期使用某些抗熱應(yīng)激藥物，難免出現(xiàn)毒副作用和藥物殘留。另外，高溫?zé)釕?yīng)激可使動(dòng)物發(fā)生氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激是豬只高溫?zé)釕?yīng)激反應(yīng)的一部分。因此，在豬舍條件短期內(nèi)難于實(shí)現(xiàn)根本改善的前提下，另辟蹊徑，開(kāi)發(fā)一種以抗氧化作用為主要特點(diǎn)的新型綠色抗豬熱應(yīng)激飼料添加劑，對(duì)于解決熱應(yīng)激導(dǎo)致的豬只的生長(zhǎng)性能、抗氧化與免疫功能下降問(wèn)題具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。眾所周知,硒是人和動(dòng)物所必需的微量元素,是一種多功能的生命營(yíng)養(yǎng)元素。研究表明，砸具有抗氧化，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，提聞機(jī)體免疫力和抗病力，提聞繁育機(jī)能，抗腫瘤，防治地方病，延緩衰老，拮抗有毒元素等多種功能。自然界中，硒以有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒形式存在。無(wú)機(jī)硒包括硒酸鹽和亞硒酸鹽。有機(jī)硒存在形式之一是以可解離的因子，常見(jiàn)于細(xì)菌；另一種以氨基酸共價(jià)鍵結(jié)合形式存在，主要是有結(jié)合硒的蛋白又稱為含硒蛋白(硒蛋氨酸Se-Met)和以硒半胱氨酸(Se-Cys)形式參入到多肽鏈的蛋白質(zhì)稱為硒蛋白又叫硒酶(如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、碘甲腺原氨酸脫碘酶和硒蛋白-P等)。硒是通過(guò)硒蛋白發(fā)揮作用的，Se-Cys被認(rèn)為是硒的生物活性形式。Se-Met參入各種蛋白質(zhì)中置換蛋氨酸，但組織中的Se-Met不能在體內(nèi)合成，主要來(lái)自膳食。硒在動(dòng)物機(jī)體中以Se-Cys的形式參與構(gòu)成谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)，從而清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧自由基。硒可以由谷胱甘肽(GSH)介導(dǎo)，生成硒代三硫化物(GSSeSG)和硒代硫化物(GSSeH)。硒具有增加GSH-Px的活力，降低機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化物堆積的功能。大量研究表明，有機(jī)硒的生物利用率高于無(wú)機(jī)硒，且毒性較小，適口性好。生物有機(jī)化是獲得有機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素的簡(jiǎn)便而經(jīng)濟(jì)的途徑，有利于實(shí)際生產(chǎn)中大量應(yīng)用。硒的生物有機(jī)化主要是在植物和微生物體內(nèi)進(jìn)行的。有關(guān)硒特別是硒酵母對(duì)雞和奶牛熱應(yīng)激的影響近年來(lái)研究較多，但對(duì)豬熱應(yīng)激的影響鮮有報(bào)道。益生菌是指“當(dāng)攝入一定量時(shí)能對(duì)宿主的健康有作用的微生物活體”，主要包括乳酸菌類、雙歧桿菌類、芽孢桿菌類、光合細(xì)菌類和酵母類等。研究表明，益生菌能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥病原、增強(qiáng)腸道屏障功能來(lái)防止腸道感染，維持腸道菌群平衡，提高免疫機(jī)能。近來(lái)有報(bào)道，益生菌具有緩解家禽熱應(yīng)激的能力，例如乳桿菌能提高熱應(yīng)激蛋雞和肉雞的生產(chǎn)性能和采食量。但應(yīng)用益生菌尤其是應(yīng)用復(fù)合益生菌對(duì)豬熱應(yīng)激的影響鮮有報(bào)道，至于應(yīng)用富含有機(jī)硒的復(fù)合益生菌緩解豬的熱應(yīng)激國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單、低成本生產(chǎn)的富硒復(fù)合菌飼料添加劑具有抗豬熱應(yīng)激的作 用。在含有無(wú)機(jī)硒源的發(fā)酵液中加入復(fù)合菌，并加入有機(jī)硒轉(zhuǎn)化促進(jìn)劑，其中的多種益生菌能將無(wú)機(jī)態(tài)的硒轉(zhuǎn)變成有機(jī)態(tài)的硒，得到一種可同時(shí)發(fā)揮有機(jī)硒和復(fù)合益生菌等多重作用的飼料添加劑。用該添加劑飼喂高溫環(huán)境下的豬只，能緩解熱應(yīng)激所帶來(lái)的不利影響，提高豬的抗氧化性能、免疫功能與生長(zhǎng)性能，降低熱應(yīng)激蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平。技術(shù)方案熱應(yīng)激條件下，機(jī)體的氧化應(yīng)激加劇，消耗的抗氧化物質(zhì)增多。本發(fā)明利用有機(jī)硒和復(fù)合益生菌都能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的原理，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出以3種不同的益生菌(嗜酸乳桿菌，嗜熱鏈球菌和釀酒酵母)為菌種，接種于含亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)出具有有機(jī)硒和復(fù)合益生菌等多重作用的飼料添加劑，將該添加劑飼喂熱應(yīng)激條件下的豬只，能有效發(fā)揮抗熱應(yīng)激的作用。一種具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑在制備具有抗豬熱應(yīng)激作用的飼料中的應(yīng)用。所述的具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑優(yōu)選按照以O(shè). 2-0. 5mg/kg的硒水平添加到基礎(chǔ)日糧中，進(jìn)一步優(yōu)選按照以O(shè). 3mg/kg的硒水平添加到基礎(chǔ)日糧中。本發(fā)明所述的一種具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑，所述的富硒復(fù)合菌飼料添加劑通過(guò)如下方法制備得到將無(wú)機(jī)硒源加入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為4 10mg/L ;按I : 2 2(v/v/v)比例將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)種子液，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)種子液和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)種子液接種于添加了有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和益生菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量為2% 5% (v/v)，在發(fā)酵溫度為20 40°C，通氣量為0. 05m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為0. 04Mpa的條件下發(fā)酵30 40h，獲得富硒復(fù)合菌添加劑；所獲得的富硒復(fù)合菌添加劑中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的CFU分別達(dá)到109/mL、IO1VmL和IOicVmL左右；含硒量為4 10mg/L ;其中有機(jī)硒含量在90%以上，硒蛋氨酸含量在75%以上；其中，所述的無(wú)機(jī)硒源配制含硒量為0. 5 5mg/ml的亞硒酸鈉溶液，100 125°C，高壓蒸汽滅菌30min,備用；所述的生產(chǎn)培養(yǎng)基0. 5% 2%酵母膏，O 1%牛肉浸膏，O. 5% 3%葡萄糖，pH自然；115°C，高壓蒸汽滅菌15min，備用；所述的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量為每升生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入I 5g寡糖、O. 01 O. 5g蛋氨酸、O. 01 O. 5g絲氨酸、O. I 2g硫酸銨、O. 01 O. 5g磷酸氫二鉀和O. 01 O. 5g磷酸二氫鉀。本發(fā)明所述的具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑中，所述的釀酒酵母種子液，嗜酸乳桿菌種子液和嗜熱鏈球菌種子液分別優(yōu)選通過(guò)如下方法獲得I)將保存在4°C的釀酒酵母接種于斜面活化培養(yǎng)基上，20 30°C，培養(yǎng)30 40h ；如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，20 30°C，220r/min，搖床培養(yǎng)30 40h，得到釀酒酵母種子液； 2)將保存在4°C的嗜酸乳桿菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 40°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 40°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜酸乳桿菌種子液；3)將保存在4°C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 43°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 43°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜熱鏈球菌液體種子液；其中，所述的斜面活化培養(yǎng)基配方如下釀酒酵母活化培養(yǎng)基酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml, pH為5. 5 6. 0,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸鈉5g,檸檬酸三銨 2g，吐溫 801ml，MgSO4 · 7H20 O. 58g，MnSO4 · 4H20 0. 05g, K2HP042g,瓊脂 20g，水1000ml, pH為6. 2 6. 4 ; 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基胰蛋白胨5g，魚蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2. 5g，抗壞血酸O. 5g，硫酸鎂O. 25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氫二鉀5g，瓊脂20g，水1000ml, pH為
6.7 7. 1,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；所述的液體活化培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基中不加瓊脂。本發(fā)明所述的具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑的生產(chǎn)方法，包括①菌種釀酒酵母，嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌，均為農(nóng)業(yè)部允許使用的飼料級(jí)益生菌菌種；②生產(chǎn)培養(yǎng)基0. 5% 2%酵母膏，O 1%牛肉浸膏，O. 5% 3%葡萄糖，pH自然；115°C，高壓蒸汽滅菌15min，備用；③斜面活化培養(yǎng)基 釀酒酵母活化培養(yǎng)基酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml, pH為5. 5 6. 0,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸鈉5g,檸檬酸三銨 2g，吐溫 801ml，MgSO4 · 7H20 0. 58g，MnSO4 · 4H20 0. 05g, K2HP042g,瓊脂 20g，水1000ml, pH為6. 2 6. 4 ; 115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基胰蛋白胨5g，魚蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2. 5g，抗壞血酸O. 5g，硫酸鎂O. 25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氫二鉀5g，瓊脂20g，水1000ml, pH為6· 7 7· 1,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用；④液體活化培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基中不加瓊脂；⑤無(wú)機(jī)硒源配制含硒量為 O. 5 5mg/ml的亞硒酸鈉溶液，100 125°C,高壓蒸汽滅菌30min,備用；⑥菌種的活化與種子液的獲得將保存在4°C的釀酒酵母接種于斜面活化培養(yǎng)基上，20 30°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，20 30°C，220r/min,搖床培養(yǎng)30 40h,得到釀酒酵母種子液；將保存在4°C的嗜酸乳桿菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 40°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 40°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜酸乳桿菌種子液；將保存在4°C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 43°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 43°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜熱鏈球菌液體種子液；⑦發(fā)酵將無(wú)機(jī)硒源加入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為4 10mg/L ;按I : 2 : 2比例將釀酒酵母種子液，嗜酸乳桿菌種子液和嗜熱鏈球菌種子液接種于添加了有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和益生菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量為2% 5%(v/v)，在發(fā)酵溫度為20 40°C，通氣量為O. 05m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為O. 04Mpa的條件下發(fā)酵30 40h，獲得富硒復(fù)合菌添加劑；所獲得的富硒復(fù)合菌添加劑中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的CFU分別達(dá)到Io9AiUio1cVmI^P IOicVmL ;含硒量為4 10mg/L ;其中有機(jī)硒含量在90%以上，硒蛋氨酸含量在75%以上。本發(fā)明建議的日糧組成及飼喂方法根據(jù)國(guó)家研究委員會(huì)制定的豬營(yíng)養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)，配制了除硒之外的其他營(yíng)養(yǎng)都滿足營(yíng)養(yǎng)需要的玉米豆柏型基礎(chǔ)日糧，將富硒復(fù)合菌以O(shè). 3mg/kg的硒水平添加到基礎(chǔ)日糧中，連續(xù)飼喂。自由采食和飲水，用藥和防疫按豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行。有益效果本發(fā)明利用益生菌可將無(wú)機(jī)態(tài)的硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)態(tài)的硒以及不同益生菌的協(xié)同作用原理，篩選出特定的益生菌，以及針對(duì)所述益生菌組合物的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和益生菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑，通過(guò)在富含有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的培養(yǎng)基中對(duì)益生菌的發(fā)酵生產(chǎn)出富含較高量有機(jī)硒的復(fù)合菌產(chǎn)品。本發(fā)明的富硒復(fù)合菌同時(shí)發(fā)揮有機(jī)硒和復(fù)合益生菌的多重功效，能顯著提高熱應(yīng)激條件下豬的平均日增重，降低料重比，提高抗氧化能力和免疫功能，降低熱應(yīng)激蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平，緩解熱應(yīng)激所帶來(lái)的不利影響。


圖I.富硒復(fù)合菌對(duì)斷奶仔豬肝臟(A)、腎臟(B)和脾臟(C)相對(duì)熱休克蛋白Hsp70mRNA表達(dá)的影響。Con為對(duì)照組，P為復(fù)合菌組，SS為亞硒酸鈉組，SP為富硒復(fù)合菌組。柱形圖代表平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤。同一臟器內(nèi)平均值帶有不同字母表示差異顯著(P〈0. 05)。圖2.富硒復(fù)合菌對(duì)斷奶仔豬肝臟(A)、腎臟(B)和脾臟(C)相對(duì)熱休克蛋白Hsp27mRNA表達(dá)的影響。Con為對(duì)照組，P為復(fù)合菌組，SS為亞硒酸鈉組，SP為富硒復(fù)合菌組。柱形圖代表平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤。同一臟器內(nèi)平均值帶有不同字母表示差異顯著(p〈0. 05)。圖3.富硒復(fù)合菌對(duì)育肥豬外周血(A)和脾臟(B)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響。對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧組，試驗(yàn)組為基礎(chǔ)日糧加富硒復(fù)合菌組。柱形圖代表平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤。同一臟器內(nèi)平均值帶有不同字母表示差異顯著(p〈0. 05)。圖4.富硒復(fù)合菌對(duì)育肥豬肝臟(A)、腎臟(B)和脾臟(C)相對(duì)熱休克蛋白Hsp70mRNA表達(dá)的影響。對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧組，試驗(yàn)組為基礎(chǔ)日糧加富硒復(fù)合菌組。柱形圖代表平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤。同一臟器內(nèi)平均值帶有不同字母表示差異顯著(P〈0. 05)。圖5.富硒復(fù)合菌對(duì)育肥豬肝臟(A)、腎臟(B)和脾臟(C)相對(duì)熱休克蛋白Hsp27mRNA表達(dá)的影響。對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧組，試驗(yàn)組為基礎(chǔ)日糧加富硒復(fù)合菌組。柱形圖代表平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤。同一臟器內(nèi)平均值帶有不同字母表示差異顯著(P〈0. 05)。
具體實(shí)施方案 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I以江蘇興化某豬場(chǎng)48頭28日齡斷奶仔豬為實(shí)施對(duì)象I.富硒復(fù)合菌飼料添加劑的生產(chǎn)⑴菌種嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus):購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，菌株代號(hào)為I. 1878 ；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus):購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，菌株代號(hào)為I. 2471 ；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，菌株代號(hào)為2. 2081。(2)無(wú)機(jī)硒源配制Se濃度為I. 0mg/ml的亞硒酸鈉溶液800ml, 115°C,高壓蒸汽滅菌30min,備用。(3)菌種的活化與種子液的獲得將保存在4°C的釀酒酵母接種于斜面培養(yǎng)基上，28 V，培養(yǎng)32h ;如此連續(xù)活化3次后，再接種于0. 5L液體活化培養(yǎng)基中，28 V，220r/min,搖床培養(yǎng)32h，得到釀酒酵母液體種子液A ;將保存在4°C的嗜酸乳桿菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)32h ;如此連續(xù)活化3次后，再接種于IL液體活化培養(yǎng)基中，37 °C，培養(yǎng)32h，得到嗜酸乳桿菌種子液B ;將保存在4°C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，370C，培養(yǎng)32h ;如此連續(xù)活化3次后，再接種于IL液體活化培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)32h，得到嗜熱鏈球菌液體種子液C。(4)發(fā)酵將生產(chǎn)培養(yǎng)基2kg葡萄糖、2kg酵母浸膏溶解在20L水中，然后加入到BI0TECH-BS/JS(150L)發(fā)酵罐中，加80L水補(bǔ)至100L，115°C，高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至40 50°C，加入800ml亞硒酸鈉(lmg/ml，以Se計(jì))溶液；加入硒轉(zhuǎn)化及益生菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑培養(yǎng)基中加入已滅菌的IOOg寡糖、I克蛋氨酸、I克絲氨酸、IOOg硫酸銨、20g磷酸氫二鉀和20g磷酸二氫鉀，充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓蠼尤刖N液A 0. 5L、菌種液B IL和菌種液C IL ；培養(yǎng)溫度30°C ;通氣量0. 05mVh ;轉(zhuǎn)數(shù)70r/min ;罐壓0. 04Mpa ;發(fā)酵時(shí)間36h ;發(fā)酵結(jié)束，將富硒復(fù)合菌發(fā)酵液分裝入桶，4°C冷藏，備用。上述發(fā)酵獲得的富硒復(fù)合菌中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的CFU分別達(dá)到 3. 75X 109/mL、4. 46X1010/mL 和 5. 12X1010/mL ;含硒量為 7. 5mg/L，其中有機(jī)硒含量為91. 34%以上，硒蛋氨酸含量為76. 26%。2.復(fù)合菌飼料添加劑的生產(chǎn)按照生產(chǎn)富硒復(fù)合菌飼料添加劑的方法生產(chǎn)復(fù)合菌飼料添加劑，不同的是不加入無(wú)機(jī)硒，也不加入有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑。發(fā)酵獲得的復(fù)合菌中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的CFU分別達(dá)到5. 18 XlOVmL,5. 87 X IO1VmL和6. 05X liT/mL。3.富硒復(fù)合菌飼料添加劑飼喂高溫環(huán)境下的斷奶仔豬(I)實(shí)施動(dòng)物與分組試驗(yàn)選用48頭28日齡杜長(zhǎng)大斷奶仔豬(平均體重7. 7±0. 5kg)，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭，Con組為玉米豆柏型基礎(chǔ)日糧；P組在其基礎(chǔ)日糧中添加一定量 的復(fù)合菌(與SP組含等量益生菌數(shù));SS組在其基礎(chǔ)糧中添加O. 3mg. kg—1硒的亞硒酸鈉；SP組在其基礎(chǔ)糧中添加O. 3mg · kg—1硒的富硒復(fù)合菌。(2)日糧與飼養(yǎng)管理試驗(yàn)采用玉米一豆柏型基礎(chǔ)日糧，其營(yíng)養(yǎng)組成除了硒之外，均按照NRC( 1998)關(guān)于斷奶仔豬所需營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐進(jìn)行配制(表I)。將富硒復(fù)合菌、亞硒酸鈉、復(fù)合菌按實(shí)驗(yàn)所需劑量添加到基礎(chǔ)日糧中，配制成3種試驗(yàn)日糧，基礎(chǔ)日糧作對(duì)照。充分混勻后，分別取樣，測(cè)定實(shí)際硒含量(表2)。試驗(yàn)豬飼養(yǎng)在夏天自然高溫環(huán)境下的豬舍，自由采食、飲水、每日喂料3次，每天記錄豬舍溫度，舍溫26 40°C，其他管理按豬場(chǎng)常規(guī)管理進(jìn)行。試驗(yàn)時(shí)間為2011年6月12日-7月30日，其中預(yù)試期7d，正式試驗(yàn)期42d，試驗(yàn)組與對(duì)照組分別飼喂試驗(yàn)日糧和基礎(chǔ)日糧。表I斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平
權(quán)利要求
1.一種具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑在制備具有抗豬熱應(yīng)激作用的飼料中的應(yīng)用；所述的富硒復(fù)合菌飼料添加劑通過(guò)如下方法制備得到 將無(wú)機(jī)硒源加入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為4 10mg/L ;按I : 2 : 2的體積比將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)種子液，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)種子液和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)種子液接種于添加了有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量為2% 5%，在發(fā)酵溫度為20 40°C，通氣量為O. 05m3A,轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為O. 04Mpa的條件下發(fā)酵30 40h，獲得富硒復(fù)合菌添加劑；所獲得的富硒復(fù)合菌添加劑中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的CFU分別達(dá)到109/mL、IO1VmL和IOicVmL ;含硒量為4 10mg/L ;其中有機(jī)硒含量在90%以上，砸蛋氣Ife含量在75 %以上；其中， 所述的無(wú)機(jī)硒源配制含硒量為0. 5 5mg/ml的亞硒酸鈉溶液，100 125°C，高壓蒸汽滅菌30min,備用； 所述的生產(chǎn)培養(yǎng)基0. 5% 2%酵母膏，O 1%牛肉浸膏，0. 5% 3%葡萄糖，pH自然；115°C，高壓蒸汽滅菌15min，備用； 所述的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量為每升生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入I 5g寡糖、0. 01 0. 5g蛋氨酸、0. 01 0. 5g絲氨酸、0. I 2g硫酸銨、0. 01 0. 5g磷酸氫二鉀和0.01 0. 5g磷酸二氫鉀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求I所述的具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑按照以0. 2-0. 5mg/kg的硒水平添加到基礎(chǔ)日糧中。
3.一種具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑，其特征在于所述的富硒復(fù)合菌飼料添加劑通過(guò)如下方法制備得到 將無(wú)機(jī)硒源加入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為4 10mg/L ;按I : 2 : 2的體積比將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)種子液，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)種子液和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)種子液接種于添加了有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量為2% 5%，在發(fā)酵溫度為20 40°C，通氣量為0. 05m3A,轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為0. 04Mpa的條件下發(fā)酵30 40h，獲得富硒復(fù)合菌添加劑；所獲得的富硒復(fù)合菌添加劑中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌的CFU分別達(dá)到109/mL、IO1VmL和IOicVmL ;含硒量為4 10mg/L ;其中有機(jī)硒含量在90%以上，砸蛋氣Ife含量在75 %以上；其中， 所述的無(wú)機(jī)硒源配制含硒量為0. 5 5mg/ml的亞硒酸鈉溶液，100 125°C，高壓蒸汽滅菌30min,備用； 所述的生產(chǎn)培養(yǎng)基0. 5% 2%酵母膏，O 1%牛肉浸膏，0. 5% 3%葡萄糖，pH自然；115°C，高壓蒸汽滅菌15min，備用； 所述的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量為每升生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入I 5g寡糖、0. 01 0. 5g蛋氨酸、0. 01 0. 5g絲氨酸、0. I 2g硫酸銨、0. 01 0. 5g磷酸氫二鉀和0.01 0. 5g磷酸二氫鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑，其特征在于所述的釀酒酵母種子液，嗜酸乳桿菌種子液和嗜熱鏈球菌種子液分別通過(guò)如下方法獲得 I)將保存在4°C的釀酒酵母接種于斜面活化培養(yǎng)基上，20 30°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，20 30°C，220r/min,搖床培養(yǎng)30 40h，得到釀酒酵母種子液； 2)將保存在4°C的嗜酸乳桿菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 40°C，培養(yǎng)30 40h；如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 40°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜酸乳桿菌種子液； 3)將保存在4°C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 43°C，培養(yǎng)30 40h；如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 43°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜熱鏈球菌液體種子液； 其中，所述的斜面活化培養(yǎng)基配方如下 釀酒酵母活化培養(yǎng)基酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml，pH為5. 5 6. 0,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； 嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨 2g，吐溫 801ml, MgSO4 · 7H20 O. 58g，MnSO4 · 4H20 0. 05g, K2HPO4 2g，瓊脂 20g，水1000ml, pH為6. 2 6. 4 ；115°C，高壓蒸汽滅菌15min,備用； 嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基胰蛋白胨5g,魚蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母浸膏2. 5g,抗壞血酸O. 5g，硫酸鎂O. 25g，甘油IOg,乳糖3g，磷酸氫二鉀5g，瓊脂20g,水1000ml，pH為6. 7 ·7.1,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； 所述的液體活化培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基中不加瓊脂。
5.權(quán)利要求3所述的具有抗豬熱應(yīng)激作用的富硒復(fù)合菌飼料添加劑的生產(chǎn)方法，其特征在于包括 ①菌種釀酒酵母，嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌，均為農(nóng)業(yè)部允許使用的飼料級(jí)益生菌菌種； ②生產(chǎn)培養(yǎng)基=0.5% 2%酵母膏，O 1%牛肉浸膏，O. 5% 3%葡萄糖，pH自然；115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； ③斜面活化培養(yǎng)基 釀酒酵母活化培養(yǎng)基酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml，pH為5. 5 6. 0,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； 嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨 2g，吐溫 801ml, MgSO4 · 7H20 0. 58g，MnSO4 · 4H20 0. 05g, K2HPO4 2g，瓊脂 20g，水1000ml, pH為6. 2 6. 4 ；115°C，高壓蒸汽滅菌15min,備用； 嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基胰蛋白胨5g,魚蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母浸膏2. 5g,抗壞血酸O. 5g，硫酸鎂O. 25g，甘油IOg,乳糖3g，磷酸氫二鉀5g，瓊脂20g,水1000ml，pH為6. 7 ·7.1,115°C,高壓蒸汽滅菌15min,備用； ④液體活化培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基中不加瓊脂； ⑤無(wú)機(jī)硒源配制含硒量為0.5 5mg/ml的亞硒酸鈉溶液，100 125°C，高壓蒸汽滅菌30min,備用； ⑥菌種的活化與種子液的獲得將保存在4°C的釀酒酵母接種于斜面活化培養(yǎng)基上，20 30°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，20 300C，220r/min,搖床培養(yǎng)30 40h，得到釀酒酵母種子液；將保存在4°C的嗜酸乳桿菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 40°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 40°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜酸乳桿菌種子液；將保存在4°C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30 43°C，培養(yǎng)30 40h ;如此連續(xù)活化3 5次后，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，30 43°C，培養(yǎng)30 40h，得到嗜熱鏈球菌液體種子液； ⑦發(fā)酵將無(wú)機(jī)硒源加入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為4 10mg/L ；按1:2: 2的體積比將釀酒酵母種子液，嗜酸乳桿菌種子液和嗜熱鏈球菌種子液接種于添加了有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量為2% 5%，在發(fā)酵溫度為20 40°C，通氣量為O. 05m3A,轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為O. 04Mpa的條件下發(fā)酵30 40h，獲得富硒復(fù)合菌添加劑；所獲得的富硒復(fù)合菌添加劑中釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌 的CFU分別達(dá)到109/mL、IO1VmL和IOicVmL ;含硒量為4 10mg/L ;其中有機(jī)硒含量在90%以上，硒蛋氨酸含量在75%以上；所述的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化和復(fù)合菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量為每升 生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入I 5g寡糖、O. 01 O. 5g蛋氨酸、O. 01 O. 5g絲氨酸、O. I 2g硫酸銨、O. 01 O. 5g磷酸氫二鉀和O. 01 O. 5g磷酸二氫鉀。
全文摘要
本發(fā)明屬于飼料添加劑的應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種抗豬熱應(yīng)激的富硒復(fù)合菌飼料添加劑及其應(yīng)用。選用釀酒酵母、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌作菌種，按1:2:2的體積比混合接種于含亞硒酸鈉與硒轉(zhuǎn)化和益生菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑的適宜發(fā)酵液中，在溫度為20～40℃，通氣量為0.05m3/h，轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為0.04Mpa的條件下發(fā)酵30～40h，通過(guò)適當(dāng)?shù)暮罄m(xù)處理，獲得富含有機(jī)硒的復(fù)合菌制劑。飼喂該制劑能顯著改善高溫環(huán)境下豬的日增重和料重比，增強(qiáng)抗氧化性能和免疫功能，降低熱休克蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平，有效發(fā)揮抗豬熱應(yīng)激的作用。
文檔編號(hào)A23K1/16GK102823772SQ201210333510
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者黃克和, 甘芳, 陳興祥, 任飛, 呂晨輝, 趙如茜, 潘翠玲, 周紅, 葉耿坪, 石秀麗 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)