大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)GmMYB174a基因，其在大豆中的表達(dá)受到高鹽、干旱、低溫及植物激素ABA處理的誘導(dǎo)。本發(fā)明對(duì)培育耐非生物脅迫（耐鹽）的作物、林草等新品種具有重要價(jià)值，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對(duì)在干旱/高鹽土壤中農(nóng)作物產(chǎn)量的提高有重要意義。
【專利說(shuō)明】大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYBI 74a及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a及其編碼基因
與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。目前，基因工程育種已經(jīng)成為增強(qiáng)作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細(xì)胞有多種途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的作用。植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多類轉(zhuǎn)錄因子與植物耐逆性相關(guān)，例如:EREBP/AP2中的DREB類，bZIP, MYB, WRKY等
坐寸ο
[0003]MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子。MYB結(jié)構(gòu)域是一段約51~53個(gè)氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。
[0004]自從1987年克隆了玉米與色素合成有關(guān)的ZmMYBCl基因后，又從很多植物中分離到功能各異的MYB因。植物的MYB蛋白大都只含有兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，它們是一個(gè)大轉(zhuǎn)錄因子家族，參與許多生物學(xué) 過(guò)程，例如，次生代謝的調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞分化，應(yīng)答激素刺激和外界環(huán)境脅迫以及抵抗病原菌的侵害。植物中還發(fā)現(xiàn)了含一個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白以及含3個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白。它們可能分別在維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性、調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄和參與細(xì)胞周期的控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化上起重要作用。
[0005]MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，研究表明，MYB參與非生物脅迫的應(yīng)答。在非生物脅迫調(diào)控信號(hào)途徑中，MYB基因存在受ABA誘導(dǎo)和不受ABA誘導(dǎo)或甚至受抑制表達(dá)，表明MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)非生物脅迫應(yīng)答時(shí)可能參與ABA調(diào)控途徑，也可參與非ABA調(diào)控途徑。擬南芥MYB家族成員Atmyb2受干旱脅迫快速誘導(dǎo)，并且也受高鹽和外源ABA誘導(dǎo)表達(dá)。過(guò)量表達(dá)能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的干旱耐性；擬南芥MYB成員H0S10的突變植株hoslO-1對(duì)冷害的適應(yīng)能力急劇減弱，并對(duì)脫水和NaCl處理高度敏感；在脫水脅迫條件下，ABA的含量增加。這表明H0S10對(duì)冷害適應(yīng)是必需的，并通過(guò)控制ABA生物合成來(lái)影響植株的脫水脅迫的耐性。而下列基因是不受ABA誘導(dǎo)，擬南芥HPPBF-1是受鹽誘導(dǎo)表達(dá)的單一 MYB類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因；水稻0smyb4受低溫誘導(dǎo)，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)能夠增加轉(zhuǎn)基因植株的冷害和凍害抗性。對(duì)擬南芥1500個(gè)鹽效應(yīng)基因進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)受NaCl誘導(dǎo)的MYB基因僅四個(gè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a及其編碼基因。
[0007]本發(fā)明提供種蛋白，名稱為GmMYB174a,來(lái)源于大豆屬大豆(Glycine max (L.)Merrill)，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]上述序列表中的序列I由361個(gè)氨基酸殘基組成。
[0009]上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列I所示的DNA序列缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表2所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0010]上述蛋白的氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā)生的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起的。
[0011]編碼是上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0012]上述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子:
[0013](I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0014](2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0015](3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0016]上述序列表序列2由1086個(gè)核苷酸組成，且編碼區(qū)為自5’末端第1-1086位核苷酸。
[0017]上述嚴(yán)格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5MNaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC，
0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0018]含有上述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體；上述重組載體可以pPROK-1I為出發(fā)載體，在pPROKII的多克隆位點(diǎn)Xba I和Kpn I間插入自序列表中序列I的自5’末端的第1-1086位脫氧核苷酸得到的重組質(zhì)粒pPR0KI1-GmMYB174a。
[0020]上述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
[0021]使用GmMYB174a構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin))，或組織特異表達(dá)啟動(dòng)子(如種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0022]為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。
[0023]擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]上述引物對(duì)中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對(duì)中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。
[0025]上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0026]上述應(yīng)用中,所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性；
[0027]上述應(yīng)用具體為將所述基因通過(guò)所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根，所述轉(zhuǎn)基因毛狀根的增長(zhǎng)率大于與轉(zhuǎn)空載體毛狀根；其中，轉(zhuǎn)空載體毛狀根為將PROK II轉(zhuǎn)入目的植物得到的轉(zhuǎn)空載體毛狀根。
[0028]所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物優(yōu)選為豆科植物，如大豆、百脈根、苜蓿、花生、綠豆、蕓豆、菜豆等；或其它雙子葉植物，如油菜、黃瓜、番茄、白菜、煙草、茄子等；所述單子葉植物優(yōu)選為水稻、小麥、玉米、草坪草等；也可以為樹(shù)，如楊樹(shù)、合歡、槐樹(shù)、水黃皮等。
[0029]上述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物理解為不僅包含轉(zhuǎn)化過(guò)程的最終產(chǎn)物，也包含其轉(zhuǎn)基因子代。
[0030]本發(fā)明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“編碼序列”、“開(kāi)放閱讀框(ORF) ”等包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個(gè)或多個(gè)原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應(yīng)的反義鏈。
[0031]本發(fā)明基因可通過(guò)如下方式導(dǎo)入宿主中:將本發(fā)明基因插入表達(dá)盒中，再將表達(dá)盒通過(guò)植物表達(dá)載體、非致病自我復(fù)制的病毒或農(nóng)桿菌導(dǎo)入宿主。攜帶本發(fā)明基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
[0032]轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。
[0033]本發(fā)明基因可通過(guò)如下方式導(dǎo)入宿主中:將本發(fā)明基因插入表達(dá)盒中，再將表達(dá)盒通過(guò)植物表達(dá)載體、非致病自我復(fù)制的病毒或農(nóng)桿菌導(dǎo)入宿主。攜帶本發(fā)明基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。[0034]本發(fā)明的基因可以在序列2的基礎(chǔ)上進(jìn)行以下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果:
[0035]I)為了在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)本發(fā)明核苷酸序列，本發(fā)明核苷酸序列可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化。如可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性。而且，優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%，優(yōu)選為多于45%，更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60%。
[0036]2)為了翻譯的有效起始，可以修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾。
[0037]3)將本發(fā)明基因與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)。所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種。例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定。盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)。
[0038]優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子包括CaMV 35S和19S啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子還可為來(lái)源于在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的幾種肌動(dòng)蛋白基因中的啟動(dòng)子。另一個(gè)優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子為泛素啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子還可為在根、木髓、葉或花粉中引導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，即組織特異性啟動(dòng)子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利US 6，040，504)、水稻蔗糖合酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利US 5，604，121)、夜香樹(shù)黃化葉卷曲病毒啟動(dòng)子(W0 01/73087)。
[0039]化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為Rab29A啟動(dòng)子(美國(guó)專利US 5，614，395)。
[0040]4)將本發(fā)明基因與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率。例如來(lái)源于CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接。
[0041]5)可向本發(fā)明基因中引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV, MCMV和AMV)。
[0042]在實(shí)際操作中，也可以將本發(fā)明基因進(jìn)行細(xì)胞靶向定位。可利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，將來(lái)源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了。
[0043]上述重組載體中的出發(fā)載體可根據(jù)所使用的轉(zhuǎn)化技術(shù)及靶植物物種的特性進(jìn)行選擇。上述選擇可體現(xiàn)在載體中的抗性標(biāo)記的選擇上。對(duì)于一些靶物種，可以優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇性標(biāo)記。通常用在轉(zhuǎn)化中的選擇性標(biāo)記包括賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因,和賦予對(duì)methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。
[0044]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)GmMYB174a基因，其在大豆中的表達(dá)受到高鹽、干旱、低溫及植物激素ABA處理的誘導(dǎo)。將GmMYB174a基因?qū)氪蠖箍曝S一號(hào)根中，獲得轉(zhuǎn)GmMYB174a基因的毛狀根。在鹽和干旱分別脅迫后的毛狀根的表型分析證明，轉(zhuǎn)GmMYB174a基因的毛狀根生長(zhǎng)狀態(tài)均明顯好于對(duì)照(轉(zhuǎn)空載體毛狀根)，說(shuō)明本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)GmMYB174a基因的毛狀根能夠顯著提高植物的耐鹽/旱性。本發(fā)明對(duì)于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價(jià)值，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對(duì)在干旱/高鹽土壤中農(nóng)作物產(chǎn)量的提高有重要意義。
[0045]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1為GmMYB174a基因在各種處理下的表達(dá)特征
[0047]圖2為植物表達(dá)載體pPR0KI1-GmMYB174a示意圖
[0048]圖3為GmMYB174a過(guò)表達(dá)毛狀根在正常條件下的生長(zhǎng)
[0049]圖4為轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根的耐鹽性分析
[0050]圖5為轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根的耐旱性分析
【具體實(shí)施方式】
[0051 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0052]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053]下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值或平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0054]所有植物材料均生長(zhǎng)于22° C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗)。
[0055]大?科豐I 號(hào)(Glycine max L.Merr.Kefeng I)記載在 W.K.Zhang, Y.J.Wang, G.Z.Luoj J.S.Zhang, C.Y.He，X.L Wuj J.Y.Gaij S.Y.Chen, QTL mapping of ten agronomictraits on the soybean (Glycine max L.Merr.) genetic map and their associationwith EST markers, Theor.App1.Genet, 2004，108:1131-1139 ；也記載在王修強(qiáng)、蓋鈞溢、喻德躍，廣譜抗源科豐I號(hào)對(duì)大豆花葉病毒強(qiáng)毒株系群SC-8抗性的遺傳研究，大豆科學(xué)，2003年03期；公眾可從中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；
[0056]pROKII 載體(雙兀表達(dá)載體)記載在 D.C.Baulcombej G.R.Saunders, M.W.Bevanj Μ.A.Mayo and B.D.Harrison, Expression of biologically active viral satellite RNAfrom the nuclear genome of transformed plants.Nature 321 (1986)，pp.446 - 449 中，公眾可以從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0057]發(fā)根農(nóng)桿菌K599 記載在 Attila Keresztj et al., Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, NatureProtocols，2007，2 (4)，549-552)中，公眾可從Peter M Gressnon教授，The University ofQueensland, St Lucia, Queensland 4072，Australia，獲得，或經(jīng)Peter M Gressnon教授同意(書面同意書)后由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0058]哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(col-0):種子購(gòu)自Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)。
[0059]實(shí)施例1、大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a基因的克隆和表達(dá)
[0060]在對(duì)大豆轉(zhuǎn)錄因子MYB家族在高鹽、干旱和低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)有個(gè)基因受上述處理的誘導(dǎo)，將其命名為GmMYB174a ;具體如下:[0061]一、大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a基因的克隆
[0062]大豆科豐I號(hào)3周齡幼苗經(jīng)200mM NaCl處理6小時(shí)，取2克新鮮葉片，在液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍水溶液中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清液中加入無(wú)水乙醇沉淀得到總RNA。提取的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用Primer-F和Primer-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量約為IKb的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。
[0063]Primer-F:5’ -CCCTCTAGA ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’(下劃線標(biāo)注 Xba I 酶切識(shí)別位點(diǎn))(序列3)；
[0064]Primer-R:5? -CCCGGTACC CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3’ (下劃線標(biāo)注 Kpn I 酶切識(shí)別位點(diǎn))(序列4)。
[0065]PCR 擴(kuò)增體系(50yl):cDNA I μ I, IOXbuffer 5 μ I，dNTP(IOmM) I μ I，Primer-Fl μ I, Primer-R I μ I, Pfu DNA Polymerase (TaKaRa) I μ I, ddH20 40 μ I。擴(kuò)增條件為:94°C 3min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 10m。
[0066]將該回收片段(PCR產(chǎn)物)與pGEM-T Easy (Promega)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為GmMYB174a，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列2自5’末端第1-1086位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為GmMYB174a,該蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列I所不。序列表中序列2由1086個(gè)核苷酸組成，序列表中序列I由361個(gè)氨基酸殘基組成。
[0067]也可人工合成序列表中序列2,用Primer-F和Primer-R進(jìn)行PCR,得到同樣的PCR產(chǎn)物。
[0068]二、大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a基因的表達(dá)受非生物脅迫誘導(dǎo)
[0069]將大豆科豐I號(hào)3周齡幼苗作如下脅迫處理:
[0070]I)鹽脅迫處理(200mM NaCl處理):將幼苗移入200mM NaCl水溶液中，室溫，約25。C ；
[0071]2)滲透脅迫處理(干旱處理):將幼苗根部小心的吸去水分，置于濾紙上暴露于室溫空氣(25°C)中；
[0072]3)低溫脅迫處理(4°C低溫處理):將幼苗浸入預(yù)冷的水中，置于4°C冰箱；
[0073]4)脫落酸(ABA)處理(100 μ M ABA處理)，將幼苗根浸入100 μ M ABA水溶液中，室溫，約25° C。
[0074]5) CK處理:幼苗未經(jīng)任何處理記作CK ；
[0075]6)水處理:將幼苗浸入蒸餾水中，處理溫度約25°C ；
[0076]每種處理在1、3、6、12小時(shí)分別收集新鮮葉片Ig在液氮中研碎(CK組直接收集葉片)，懸于4mol/L硫氫酸胍水溶液中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清液中加入無(wú)水乙醇沉淀得到總RNA。對(duì)GmMYB174a基因在上述處理時(shí)的表達(dá)特征進(jìn)行定量PCR分析，引物為Primer-F 和 Primer-R。大豆 GmTubulin 基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，所用引物為 Primer-TF 和 Primer-TR。Q-PCR得到的值是基因相對(duì)于GmTubulin的表達(dá)量。RT-PCR需要先通過(guò)調(diào)整模板cDNA的量來(lái)使GmTubulin的表達(dá)量一致，再進(jìn)行基因的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0077]Primer-F:5，-ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’
[0078]Primer-R:5，-CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3J
[0079]Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，
[0080]Primer-TR:5，-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’[0081]結(jié)果如圖1所示，A為干旱處理；B為200mM NaCl處理；C為4°C低溫處理；D為100 μ M ABA處理；從圖中看出，GmMYB174a基因?qū)Φ蜏?、干旱、高鹽和ABA處理均有應(yīng)答反應(yīng)，但是應(yīng)答反應(yīng)的模式不同。除了 ABA處理外，GmMYB174a表達(dá)在上述處理I小時(shí)時(shí)均明顯受誘導(dǎo)，GmMYB174a表達(dá)在干旱處理時(shí)持續(xù)升高至12小時(shí)，高鹽和低溫處理3小時(shí)時(shí)均升至最高，之后下降，高鹽處理12時(shí)時(shí)將至最低，而低溫處理12小時(shí)時(shí)復(fù)又升高。在ABA處理I小時(shí)時(shí)，略下降，至3小時(shí)明顯升高,至6小時(shí)復(fù)又下降。
[0082]實(shí)施例2、大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB174a基因的應(yīng)用
[0083]一、轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根的獲得
[0084]1、重組表達(dá)載體pPR0KI1-GmMYB174a的構(gòu)建
[0085]用限制性內(nèi)切酶Xba I和Kpn I雙酶切由實(shí)施例1用Primer-F和Primer-R作為引物獲得的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣酶切植物表達(dá)載體pROK II得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，該質(zhì)粒為將序列表中的序列2插入pROK II的Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)之間得到的載體，將該載體命名為pROK I1-GmMYB174a,且序列表中的序列2位于CaMV 35S啟動(dòng)子之后。重組表達(dá)載體pROK I1-GmMYB174a結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。
[0086]2、轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根(過(guò)量表達(dá)GmMYB174a基因毛狀根)的獲得
[0087]I)將上述I得到的重組表達(dá)載體pROK I1-GmMYB174a,通過(guò)電擊法導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，得到重組農(nóng)桿菌。
[0088]提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果為該質(zhì)粒為pROK I1-GmMYB174a,將含有該質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌命名為K599/pR0K II _GmMYB174a。
[0089]2)用注射器將重組農(nóng)桿菌K599/pR0K I1-GmMYB174a接種生長(zhǎng)6天含兩片真葉的大豆科豐I號(hào)幼苗，保濕生長(zhǎng):光照16小時(shí)，溫度25°C，濕度50%。2周后，長(zhǎng)出毛狀根即為轉(zhuǎn)化的毛狀根。共獲得32個(gè)轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根根系，待毛狀根生長(zhǎng)至4_6cm時(shí)可進(jìn)一步作轉(zhuǎn)基因鑒定和耐逆性檢測(cè)。以相同的方法將空載體pROK II轉(zhuǎn)入大豆科豐I號(hào)幼苗，得到27個(gè)轉(zhuǎn)空載體毛狀根根系，以作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
[0090]3)分別提取編號(hào)為1-32的轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根和編號(hào)為1_27的轉(zhuǎn)空載體毛狀根的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用Primer-F和Primer-R進(jìn)行GmMYB174a基因表達(dá)量分析。Real-Time PCR反應(yīng)使用Τ0Υ0Β0公司的RealTime PCR Master Mix試劑盒，并按照說(shuō)明進(jìn)行操作。GmMYB174a基因表達(dá)量檢測(cè)所用引物為Primer-F和Primer-R ；大豆GmTubulin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo),所用引物為Primer-TF和Primer-TR。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0091]Primer-F:5’ -ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’
[0092]Primer-R:5，-CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3，
[0093]Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，[0094]Primer-TR:5’ -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3J
[0095]編號(hào)為1-15的轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根和編號(hào)為1_15的轉(zhuǎn)空載體毛狀根分子鑒定中的GmMYB174a的平均相對(duì)表達(dá)量如圖4A所示，其中，OE為轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根，對(duì)照為轉(zhuǎn)空載體毛狀根，從圖中看出，轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根中GmMYB174a的相對(duì)表達(dá)量為3.65±0.3 ;轉(zhuǎn)空載體毛狀根中檢測(cè)出的GmMYB174a的相對(duì)表達(dá)量是大豆原有的GmMYB174a的表達(dá)，為
0.50±0.15。
[0096]編號(hào)為16-32的轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根和編號(hào)為16_27的轉(zhuǎn)空載體毛狀根分子鑒定中的GmMYB174a的平均相對(duì)表達(dá)量如圖5A所示，其中，OE為轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根，對(duì)照為轉(zhuǎn)空載體毛狀根，從圖中看出，轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根中GmMYB174a的相對(duì)表達(dá)量為
3.35±0.25 ;轉(zhuǎn)空載體毛狀根中GmMYB174a的相對(duì)表達(dá)量為0.40±0.2。
[0097]上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GmMYB174a基因根系中GmMYB174a的表達(dá)量遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)空載體根系中GmMYB174a的表達(dá)量。
[0098]二、轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根系的耐旱、耐鹽和耐低溫鑒定
[0099]實(shí)驗(yàn)樣本如下:轉(zhuǎn)空載體毛狀根，記為對(duì)照；轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根，記為0E。
[0100]在水中培養(yǎng)10天的對(duì)照和OE的毛狀根生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差異，長(zhǎng)度為8.1±3.9cm和
7.8±3.7cm,見(jiàn)圖 3。
[0101]1、耐鹽性鑒定
[0102]將轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根(OE)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對(duì)照)各取10個(gè)經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理3天，即浸入IOOmM NaCl水溶液中25°處理3天。每個(gè)株系各10個(gè)單株。
[0103]處理3天后，拍照觀察，結(jié)果如圖4B所示，經(jīng)IOOmM NaCl處理3天的轉(zhuǎn)空載體毛狀根和轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根的表型，可以看出，在IOOmM NaCl處理下，二者毛狀根的生長(zhǎng)速
度有顯著差異。
[0104]測(cè)量毛狀根長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，具體如下:經(jīng)IOOmMNaCl水溶液處理前轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根和轉(zhuǎn)空載體毛狀根的長(zhǎng)度分別為4.3±2.8cm和4.5±2.7cm,兩者間沒(méi)有顯著差異；經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理后轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根和轉(zhuǎn)空載體毛狀根的長(zhǎng)度分別為6.2 ±2.3cm和5.2 ±2.1cm ；
[0105]毛狀根的增長(zhǎng)率=(處理后根長(zhǎng)-處理前根長(zhǎng))/處理前根長(zhǎng)
[0106]將增長(zhǎng)率作圖如圖4C所示，經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根的長(zhǎng)度增長(zhǎng)率為42±28%。而經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理轉(zhuǎn)空載體毛狀根的長(zhǎng)度增長(zhǎng)率為16 ±35%,兩者有顯著差異。
[0107]2、耐旱性鑒定:
[0108]將轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根(OE)和轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對(duì)照)分別浸入1% (體積百分含量)PEG (聚乙二醇6000) 25°處理3天。每個(gè)株系各10個(gè)單株。
[0109]處理3天后，拍照觀察，結(jié)果如圖5B所示，經(jīng)1%PEG處理3天的轉(zhuǎn)空載體毛狀根和轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根的表型，可以看出，在1%PEG處理下二者的生長(zhǎng)狀態(tài)有顯著差異。
[0110]測(cè)量毛狀根長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，具體如下:經(jīng)1%PEG處理前轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根和轉(zhuǎn)空載體毛狀根的長(zhǎng)度分別為4.6±2.1cm和4.1±2.3cm ；經(jīng)1%PEG處理后轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀根和轉(zhuǎn)空載體毛狀根的長(zhǎng)度分別為6.4±2.0cm和
5.7 ±2.4cm ；[0111]毛狀根的增長(zhǎng)率=(處理后根長(zhǎng)-處理前根長(zhǎng))/處理前根長(zhǎng)
[0112]將增長(zhǎng)率作圖如圖5C所示，PEG濃度為1%時(shí)，轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對(duì)照)增長(zhǎng)率約為3923%，而轉(zhuǎn)GmMYB174a毛狀根(OE)的增長(zhǎng)率約為63±21%。
[0113]轉(zhuǎn)GmMYB174a基因毛狀`根的增長(zhǎng)率與轉(zhuǎn)空載體毛狀根的增長(zhǎng)率有明細(xì)差異。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(I)或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.如權(quán)利要求6所述的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對(duì)中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。
8.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述雙子葉植物為大豆。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103588867SQ201210293058
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月16日
【發(fā)明者】陳受宜, 張勁松, 王昉, 陳昊偉, 張萬(wàn)科, 馬彪, 林晴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所