專利名稱：一種鑒定辣椒疫霉CesA3基因核苷酸點突變及其對CAA類殺菌劑抗藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關(guān)基因CesA3的克隆及其在Ckks殺菌劑抗性監(jiān)測中的應(yīng)用，具體公開一種快速鑒定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸點突變及其對CAA類殺菌劑抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
辣椒疫病是一種世界性的重要病害，該病于1918年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已遍及世界各地的辣椒種植區(qū)。辣椒疫病的病原是辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian), 為二倍體、絲狀、異宗配合的卵菌。辣椒疫霉的寄主范圍很廣，可侵染茄科、葫蘆科、豆科及松科50多種植物。世界五大洲均有辣椒疫霉引起植物病害發(fā)生的報道。辣椒疫霉可以危害辣椒的根、莖、葉和果實等部位。由于辣椒疫病是多循環(huán)的病害，在一個生長季可以發(fā)生多次接種體的產(chǎn)生和侵染循環(huán)，因此在氣候條件適宜的情況下，短期內(nèi)就可暴發(fā)，蔓延速度極快，使辣椒生產(chǎn)遭受嚴重的經(jīng)濟損失。并且隨著病害的擴展蔓延和研究工作的深入，越來越多的地區(qū)發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉的分布，并且其兩種交配型在多數(shù)地區(qū)同時存在。有性生殖的發(fā)生使得田間辣椒疫霉菌株的遺傳多樣性越來越豐富，給病害的防治帶來很多困難。雖然根據(jù)辣椒疫霉引起植物病害的發(fā)生流行特點，控制水分和濕度可以有效降低病害的嚴重度，然而在特定的地理環(huán)境和土壤條件下，農(nóng)業(yè)防治措施不一定能夠及時實施并有效控制辣椒疫霉引起的病害的發(fā)生，所以化學(xué)防治仍然是防治辣椒疫霉引起的植物病害的最重要措施。但是專門用于卵菌病害防治的殺菌劑種類較少，最具有代表性的是以甲霜靈為代表的苯酰胺類殺菌劑，是第一代專門用于防治卵菌病害的一大類重要的內(nèi)吸性殺菌劑。然而，隨著該類殺菌劑的廣泛使用，有關(guān)甲霜靈類殺菌劑的抗性報道越來越多,抗性群體在田間所占的比例越來越高,并導(dǎo)致對苯酰胺類殺菌劑的抗性成為辣椒疫霉化學(xué)防治中最主要的問題。在此背景下另外一大類可用于辣椒疫霉引起病害的內(nèi)吸性高效殺菌劑一羧酸酰胺類殺菌劑(CAA類殺菌劑)應(yīng)運而生，并成為生產(chǎn)上防治疫病和霜霉病的主要殺菌劑類別，主要包括烯酰嗎啉(dimethomorph)、氟嗎啉(fIumorph)、異丙菌胺(iprovalicarb)和雙塊酸菌胺(mandipropamid)等(FRAC 網(wǎng)站，http://www. frac. info/frac/index. htm)。CAA類殺菌劑作用機制的研究結(jié)果表明，與纖維素合成相關(guān)的蛋白酶cesA3是CAA類殺菌劑的作用靶標(朱書生等，2007 ；Blum et al.，2010)。辣椒疫霉對CAAs殺菌劑的抗性機制目前還未明確，明確其具體的抗性基因及抗性檢測方法，可以對抗性菌株進行早期檢測，了解其抗性發(fā)展動態(tài)，制定合理的病害管理方案，延緩抗藥性的產(chǎn)生。雖然從20世紀90年代末開始使用CAA類殺菌劑防治辣椒疫霉，但田間抗藥性菌株發(fā)現(xiàn)的報道很少。然而在室內(nèi)條件下通過自然培養(yǎng)獲得了對CAA類殺菌劑產(chǎn)生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存適合度較高，推測隨著CAA類殺菌劑在防治辣椒疫霉中的大量使用，田間有可能產(chǎn)生抗性菌株，并帶來較高的抗性風險。植物病原菌抗藥性檢測方法包括普通生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。普通生物學(xué)方法需要通過測定藥劑對病原菌的EC5tl來比較敏感和抗性菌株的差異，試驗需要多個處理，多次重復(fù)，因此檢測周期長、工作量大、消耗的人力資源和材料較多。而且上述常規(guī)方法檢測靈敏度低，抗藥性菌株的突變頻率在1%以上才能被檢測到。而分子生物學(xué)方法，檢測所需時間短、檢測的靈敏度高，檢測頻率在10_5 10_4，更適用于檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢 測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法及其專用引物對。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟以待測辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產(chǎn)物為302bp的片段，則所述待測辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點；所述突變位點指辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3450位核苷酸為C。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3450位核苷酸也就是SEQ ID NO 4中自5’末端起第3450位核苷酸。上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為66°C。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。本發(fā)明的另一個目的是提供辣椒疫霉中CesA3基因或蛋白的突變位點。本發(fā)明所提供的辣椒疫霉中CesA3基因的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3450位核苷酸為C。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3450位核苷酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起第3450位核苷酸。本發(fā)明所提供的辣椒疫霉中CesA3蛋白的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1105位氨基酸為丙氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1105位氨基酸也就是SEQ ID NO :3中自5’末端起第1105位氨基酸。上述任一所述突變位點在鑒定辣椒疫霉抗藥性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述抗藥性為抗CAA類殺菌劑。所述CAA類殺菌劑為異丙菌胺、烯酰嗎啉、氟嗎啉和/或及雙炔酰菌胺。上述應(yīng)用中，存在所述突變位點的辣椒疫霉具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :3所示蛋白或SEQ ID NO :4所示基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供的檢測辣椒疫霉對CAA類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的點突變的方法，可以用于快速、靈敏地檢測田間辣椒疫霉對CAA類殺菌劑的抗性發(fā)生發(fā)展動態(tài)，及時調(diào)整病害防治策略，以延緩和控制抗藥性的進一步發(fā)展。


圖I為抗CAA類殺菌劑的辣椒疫霉菌株及敏感菌株的cesA3基因DNA序列比較發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的一個突變位點。PCASl、PCAS2、nml3、PG13和SY12為敏感菌株，R1_1、R1_2、Rl-3、Rl-5、Rl-7、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4 和 R2-5 為抗性菌株。圖2為采用不同AS-PCR引物進行溫度梯度PCR擴增電泳圖。S :敏感菌株；R :抗性菌株；從上到下反向引物依次為PC05AR、PC05BR、PC05CR及PC05DR，正向引物均為PC05F1。圖3為采用特異性引物PC05F1和PCR05BR擴增對CAA類殺菌劑敏感和抗性的辣椒疫霉菌株。M DNA Marker ；PCASK PCAS2、nml3、PG13 及 SY12 為敏感菌株；R1_1、R1-4、Rl-8、R2-1和R2-5為抗性菌株；NC為空白對照。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。文中“抗性菌株”均指對CAA類殺菌劑抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指對CAA類殺菌劑敏感的辣椒疫霉菌。其中，CAA類殺菌劑可為烯酰嗎啉、氟嗎啉、異丙菌胺及雙炔酰菌胺。下述實施例中使用的辣椒疫霉菌株為抗性菌株Rl-1、Rl-2、Rl-3、Rl_4、R1-5、Rl-7、Rl-8、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4 及 R2-5 ;敏感菌株 PCASl、PCAS2、nml3、PG13 和SY12。上述菌株在文獻“Lu, X. H.，Zhu, S. S.，Bi, Y.，et al. (2010).Baselinesensitivity and resistance—risk assessment of Phytophthora capsici toiprovalicarb. Phytopathology, 100 (11) : 1162-1168. ” 中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。上述菌株nml3采自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)，PG13和SY12均采自中國北京，其他菌株來源見上述文獻，經(jīng)過現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為辣椒疫霉。上述各個菌株均經(jīng)過菌落生長測定法進行抗藥性驗證。實施例I、辣椒疫霉中CesA3基因和CesA3蛋白突變位點的發(fā)現(xiàn)I、菌株抗性菌株為 Rl-1、Rl-2、Rl-3、Rl-5、Rl-7、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4及 R2-5，敏感菌株為 PCASl、PCAS2、nml3、PG13 和 SY12。2、方法I)模板分別以抗性菌株和敏感菌株的基因組DNA為模板。2)纖維素合酶CesA3基因的PCR擴增引物C3F1(5，-TTACTTACCGTACTCCGATCGCACG-3，)C3R1 (5，-GCATGAACTCCAAACACAACAACAGC-3，)；目的片段長度小于2kb的PCR反應(yīng)采用Promega公司試劑，25 μ L反應(yīng)體系中包括I μ L 模板 DNA(30-50ng)，0. 5μ LlOmM dNTP, 2. 5 μ LlO X 擴增緩沖液(含 20mM Mg2+), 0. 3μ LTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，每條引物(10 μ Μ)0. 3 μ L，20. IyL ddH20，反應(yīng)體系根據(jù)后續(xù)試驗需要進行成倍增減。反應(yīng)程序為預(yù)變性94°C IOmin ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，35個循環(huán)；最后72°C下延伸lOmin。擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。
目的片段長度大于2kb的PCR反應(yīng)采用高保真酶(High-FidelityDNAPolymerase, New England Biolabs Inc.)進行 PCR 反應(yīng)。20 μ L 反應(yīng)體系中包括 IyL模板 DNA，O. 4 μ LlOmM dNTP，4 μ L5 X 擴增緩沖液，O. 2 μ L Pfu DNA 聚合酶(2U/μ L)，每條引物(ΙΟμΜ) μ ，12.4μ ddH20，反應(yīng)體系根據(jù)后續(xù)試驗需要進行成倍增減。反應(yīng)程序為預(yù)變性980C 3min ；98°C 15s，72。。3min，35個循環(huán)；最后72°C下延伸IOmin0擴增產(chǎn)物在O. 8%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。擴增產(chǎn)物在O. 8%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。3)測序?qū)CR產(chǎn)物進行測序。以基因組DNA為模板時，抗性菌株的纖維素合酶CesA3基因全長共3559bp，序列如SEQ ID NO :4所示，其中包含136bp的內(nèi)含子序列；cDNA編碼1140個氨基酸，蛋白序列如SEQ ID NO: 3所示。4)序列比對 分別將抗性菌株Rl-U Rl-2、Rl-3、Rl-5、Rl-7、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4、R2-5，與敏感菌株P(guān)CASl、PCAS2、nml3、PG13和SY12的纖維素合酶CesA3基因全長進行測序。通過DANMAN軟件分析序列結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在如下突變位點與敏感菌株相比，抗性菌株中基因組基因CesA3自5’末端起在DNA序列的3450位核苷酸由G突變?yōu)镃，對應(yīng)基因CesA3的cDNA序列的3314位。該位點堿基突變導(dǎo)致氨基酸序列在1105位發(fā)生突變，由甘氨酸(Gly，G)突變?yōu)楸彼?Ala, A)(圖I)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，抗性菌株在3450位都發(fā)生突變并由G突變?yōu)镃，分析測序的峰線圖，可發(fā)現(xiàn)該位點峰線圖清晰單一明確，表明該位點的突變?yōu)榧兒贤蛔儭Ｒ虼?，該位點的突變與辣椒疫霉對CAA類殺菌劑產(chǎn)生抗性相關(guān)(圖I)。實施例2、檢測辣椒疫霉中突變位點的方法一、引物設(shè)計菌株為實施例I中所用菌株P(guān)CASl和R2-5。根據(jù)突變體cesA3基因的序列設(shè)計allele specif ic-PCR引物，正向引物為PC05F1，反向引物PCR05AR的3’ -端最后一個堿基與突變后的堿基互補(表I)。為了增加引物的特異性，在反向引物3’ -端第二個堿基引入錯配堿基(表1，引物PCR05BR、PCR05CR和 PCR05DR)。引物如表I.表I纖維素合酶cesA3基因克隆及抗藥性檢測引物。
權(quán)利要求
1.一種檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟 以待測辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產(chǎn)物為302bp的片段，則所述待測辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點； 所述突變位點指辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3450位核苷酸為C0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，退火溫度為66°C。
3.—種檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。
4.辣椒疫霉中CesA3基因的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3450位核苷酸為C。
5.辣椒疫霉中CesA3蛋白的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1105位氨基酸為丙氨酸。
6.權(quán)利要求4或5所述突變位點在鑒定辣椒疫霉抗藥性中的應(yīng)用；所述抗藥性為抗CAA類殺菌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于存在所述突變位點的辣椒疫霉具有或候選具有抗藥性。
8.SEQ ID NO 3所示蛋白。
9.SEQ ID NO 4所示基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關(guān)基因CesA3的克隆及其在CAAs殺菌劑抗性監(jiān)測中的應(yīng)用，具體公開了一種鑒定辣椒疫霉對CAAs殺菌劑抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該引物對，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示DNA分子組成。本發(fā)明提供的檢測辣椒疫霉對CAA類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的點突變的方法，具有高靈敏度、簡單快速、穩(wěn)定性好的特點，可以用于快速、靈敏地檢測田間辣椒疫霉對CAA類殺菌劑的抗性發(fā)生發(fā)展動態(tài)，對于抗性病害的早期預(yù)警，指導(dǎo)及時調(diào)整病害防治策略，有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102776290SQ20121028186
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者劉西莉, 盧曉紅, 龐智黎, 畢揚, 王治文, 蔡萌, 陳磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)