專利名稱：殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及ー種改造的PIC9殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
背景技術：
植物蟲害是導致農(nóng)作物損失的主要因素，給農(nóng)民造成重大的經(jīng)濟損失，甚至影響到當?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學殺蟲劑和生物殺蟲制齊U，但二者在實際應用中都具有局限性化學殺蟲劑會帶來環(huán)境污染的問題，并導致抗藥性昆蟲的出現(xiàn)；而生物殺蟲制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復施用，大大增加了生產(chǎn)成本。為了解決化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應用中的局限性，科學家們經(jīng)過研究 發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得ー些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。PIC9殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的ー種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種(Bacillusthuringiensis subsp. kurstaki, B. t. k.)產(chǎn)生的伴孢結(jié)晶蛋白，是不溶性晶體蛋白。PIC9蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性PH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導致細胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。毎年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾或棉鈴蟲等。目前未發(fā)現(xiàn)PIC9殺蟲蛋白在植物中的表達水平和毒カ的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述PIC9殺蟲蛋白在植物中(尤其為玉米)具有較高的表達量和毒力。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白質(zhì)，包括(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加ー個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(C)通過包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或(d)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列具有在嚴格條件下與SEQ ID NO: I的核苷酸序列雜交的互補序列；或(e)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與(d)的核苷酸序列同類編碼。所述嚴格條件可為在6XSSC (檸檬酸鈉)、0. 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,0. 1%SDS各洗膜I次。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲基因，包括
(a)編碼具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(b )編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列為在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加ー個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列；或(d)在嚴格條件下與(C)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(e)與(d)的核苷酸序列同類編碼。所述嚴格條件可為在6XSSC (檸檬酸鈉)、() 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,0. 1%SDS各洗膜I次。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了ー種表達盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述殺蟲基因。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了ー種包含所述表達盒的重組載體。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了ー種包含所述殺蟲基因的轉(zhuǎn)基因宿主生物，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。進ー步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了ー種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，包括獲得所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于増加昆蟲靶范圍的方法，包括將所述表達盒在植物中與至少ー種不同于所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲蛋白質(zhì)ー起表達。進ー步地，所述第二種殺蟲蛋白質(zhì)為Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過氧化物酶。在本發(fā)明中，PIC9-01殺蟲蛋白在ー種轉(zhuǎn)基因植物中的表達可以伴隨著ー個或多個Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達。這種超過ー種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現(xiàn)。另外，ー種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達PIC9-01殺蟲蛋白，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了ー種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，包括將所述殺蟲基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了ー種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，使導入后的植物產(chǎn)生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括使昆蟲害蟲與抑制量的所述殺蟲蛋白質(zhì)或由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
優(yōu)選地，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導入植物細胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限干，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規(guī)技術，優(yōu)選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺 失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸ー個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有 Ala/Ser，Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe,Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。對于本領域的技術人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science 244 1081-1085)。后一技術是在分子中甸一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學或光親和標記等技術測定(參見，如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith 等，1992，J. Mol. Biol 224:899-904 ;Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59_64)。因此，與序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發(fā)明殺蟲基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明殺蟲基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中ー個核酸分子是另ー個核酸分子的“互補物”。本發(fā)明中，當一個核酸分子的姆ー個核苷酸都與另ー個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使ー個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.0 X SSC洗滌，這些條件對本領域技術人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0父55(、50で到高度嚴格條件的約0.2\55(、50で。此外，洗滌步 驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65で。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中ー個保持不變而另ー個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴格條件可為在6XSSC、0. 5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO: I發(fā)生特異性雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,0. 1%SDS各洗膜I次。因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發(fā)明序列I雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。當核酸序列編碼的多肽與參照核酸序列編碼的多肽有相同的氨基酸序列時，該核酸序列與參照核酸序列是本發(fā)明所述的“同類編碼”。本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子，增強子，前導序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述殺蟲基因的調(diào)節(jié)序列。所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內(nèi)進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導植物內(nèi)組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在緑色組織中指導編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創(chuàng)傷誘導啟動子。創(chuàng)傷誘導啟動子或指導創(chuàng)傷誘導的表達模式的啟動子是指當植物經(jīng)受機械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導啟動子的示例包括但不限干，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。所述轉(zhuǎn)運肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細胞器或細胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。所述前導序列包含但不限于，小RNA病毒前導序列，如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導序列。所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風化環(huán)病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。對于單子葉植物應用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子I、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應用而言， 所述內(nèi)含子包含但不限干，CAT-I內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于a -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。本發(fā)明中所述的“殺蟲”是指對農(nóng)作物害蟲是有毒的。更具體地，目標昆蟲是害蟲，例如，但不限干，大部分鱗翅目害蟲，如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾、棉鈴蟲或水稻ニ化
蟲貝等。本發(fā)明中，所述殺蟲蛋白質(zhì)具有PIC9-01氨基酸序列，如序列表中SEQ ID N0:2所示。所述殺蟲基因具有PIC9-01核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO: I所示。所述殺蟲基因為用于植物，特別是玉米轉(zhuǎn)化的DNA序列，除了包含由PIC9-01核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運肽的編碼區(qū)、編碼選擇性標記的蛋白質(zhì)或賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。本發(fā)明中PIC9-01殺蟲蛋白質(zhì)對危害玉米的大多數(shù)鱗翅目害蟲具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含PIC9-01核苷酸序列，通過表達抑制量的該蛋白而保護其免受害蟲的威脅。抑制量是指致死的或亞致死的劑量。同時，植物在形態(tài)上應是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學或生物殺蟲劑的需要(所述化學或生物殺蟲劑為針對由PIC9-01核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)所靶向的昆蟲的殺蟲劑)。植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達水平可通過本領域內(nèi)所描述的多種方法進行檢測，例如通過應用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的量。 可以應用不同的試驗測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標昆蟲主要為鱗翅目害蟲，更具體地為亞洲玉米螟、東方黏蟲、棉鈴蟲、水稻ニ化螟或大螟等。此外，包含本發(fā)明殺蟲基因(PIC9-01基因)序列的表達盒在植物中還可以與至少ー種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，具有以下優(yōu)點I、毒力強。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)PIC9-01的殺蟲毒力強，尤其是針對為害玉米的鱗翅目害蟲。2、表達量高。本發(fā)明殺蟲基因PIC9-01采用玉米的偏好密碼子，完全符合玉米基因的特性，使得本發(fā)明殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達，尤其是玉米，其表達量高且穩(wěn)定性好。下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進ー步的詳細描述。


圖I為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有PIC9-01核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有PIC9-01核苷酸序列的重組表達載體DBN100071構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有已知序列的重組表達載體DBN100071R構(gòu)建流程圖；圖4為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種亞洲玉米螟的抗蟲效果圖；圖5為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種東方黏蟲的抗蟲效果圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例進ー步說明本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的技術方案。第一實施例、PIC9-01基因序列的獲得和合成I、獲得PIC9-01基因序列PIC9-01殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(699個氨基酸)，如序列表中SEQ ID N0:2所示；依據(jù)玉米偏好性密碼子獲得編碼相應于所述PIC9-01殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列 (699個氨基酸)的核苷酸序列(2100個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:1所示。玉米的密碼子使用偏好性可參考 http://www. kazusa. or. jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi species=38112402、合成上述PIC9-01核苷酸序列所述PIC9-01核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: I所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述PIC9-01核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述PIC9-01核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的3，端還連接有SpeI酶切位點。同時，合成PIC9-01取代核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:3所示)，其為所述PIC9-01氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中第674位Cys替換為Tyr ;合成的所述PIC9-01取代核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述PIC9-01取代核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的3’端還連接有SpeI酶切位點。同時，合成PIC9-01缺失核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:4所示)，其為所述PIC9-01氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中缺失第641至650位氨基酸；合成的所述PIC9-01缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述PIC9-01缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的3’端還連接有SpeI酶切位點。同時，合成PIC9-01添加核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:5所示)，其為所述PIC9-01氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中在第699位后添加5個氨基酸Asp、Glu、Arg、Asn、Leu ;合成的所述PIC9-01添加核苷酸序列(SEQ ID NO:5)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述PIC9-01添加核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的3’端還連接有SpeI酶切位點。第二實施例、重組表達載體的構(gòu)建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌I、構(gòu)建含有PIC9-01核苷酸序列的重組克隆載體DBN01-T將合成的PIC9-01核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT :A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖I所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動子；!7為17 RNA聚合酶啟動子；PIC9-01為PIC9-01核苷酸序列(SEQ ID NO: I) ；MCS為多克隆位點)。然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞(Transgen, Beijing, China ；Cat. No :0)501),其熱激條件為50 y I 大腸桿菌 Tl 感受態(tài)細胞、IOiU質(zhì)粒DNA (重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用IOOii I 冰預冷的溶液 I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA (こニ胺四こ酸)，50mM 葡萄糖，pH8. 0)懸??；加入150 Ul新配制的溶液II (0. 2M NaOH, 1% SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 U I冰冷的溶液III(4M醋酸鉀，2M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水こ醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液，沉淀用質(zhì)量濃度為70%的こ醇洗滌后晾干；加入30iU含RnaSe(20ii g/ml)的TE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA, PH8. 0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆?。提取的質(zhì)粒經(jīng)AscI和SpeI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述PIC9-01核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列，即PIC9-01核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC9-01取代核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，miPIC9_01為PIC9-01取代核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中所述PIC9-01取代核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC9-01缺失核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，mdPIC9_01為PIC9-01缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述PIC9-01缺失核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC9-01添加核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，maPIC9_01為PIC9-01添加核苷酸序列(SEQ ID N0:5)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN04-T中所述PIC9-01添加核苷酸序列正確插入。2、構(gòu)建含有PIC9-01核苷酸序列的重組表達載體DBN100071用限制性內(nèi)切酶AscI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達載體DBNBC-01 (載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的PIC9-01核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的AscI和SpeI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領域技術人員所熟知的，表達載體DBNBC-01中的AscI和SpeI酶切位點也是利用常規(guī)的酶切方法引入的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100071，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界；Ubi :玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO:6) ;PIC9_01 PIC9-01核苷酸序列(SEQ ID NO: I) ;Nos :胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID NO: 7) ；PMI :磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:8) ;LB :左邊界)。將重組表達載體DBN100071用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞，其熱激條件為50iil大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞、IOiU質(zhì)粒DNA (重組表達載體DBN100071)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動);然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小吋，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨IOg/し酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶AscI和SpeI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體DBN100071在AscI和SpeI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: I所示核苷酸序列，即PIC9-01核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100071的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述PIC9-01取代核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100071-i。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100071-i在AscI和SpeI位點間即為所述PIC9-01取代核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100071的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述PIC9-01缺失核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載 體DBN100071-d。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100071-d在AscI和SpeI位點間即為所述PIC9-01缺失核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100071的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN04-T切下的所述PIC9-01添加核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100071-a。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100071_a在AscI和SpeI位點間即為所述PIC9-01添加核苷酸序列。
3、構(gòu)建含有已知序列的重組表達載體DBN100071R (正對照)按照本發(fā)明第二實施例中I所述的構(gòu)建含有PIC9-01核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T的方法，利用已知序列(SEQ ID NO:9)構(gòu)建含有已知序列的重組克隆載體DBNOIR-To對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBNOlR-T中插入的已知序列為序列表中SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。按照本發(fā)明第二實施例中2所述的構(gòu)建含有PIC9-01核苷酸序列的重組表達載體DBN100071的方法，利用已知序列構(gòu)建含有已知序列的重組表達載體DBN100071R，其構(gòu)建流程如圖3所示(載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供)；Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界;Ubi :玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:6);mR :已知序列(SEQ IDN0:9) ;Nos :胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID NO: 7) ;PMI :磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ IDN0:8)；LB :左邊界)。對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100071R中插入的已知序列為序列表中SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。4、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體DBN100071、DBN100071_i、DBN100071_d、DBN100071-a和DBN100071R (已知序列)用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrgen,Chicago, USA ;Cat. No :18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為100 y L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 y L 質(zhì)粒DNA (重組表達載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆,挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體 DBN100071、DBN100071-i、DBN100071_d、DBN100071-a 和 DBN100071R (已
知序列)結(jié)構(gòu)完全正確。第三實施例、轉(zhuǎn)入PIC9-01核苷酸序列的玉米植株的獲得及驗證I、獲得轉(zhuǎn)入PIC9-01核苷酸序列的玉米植株按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實施例中4所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實施例中2和3構(gòu)建的重組表達載體DBN100071、DBN100071-i、DBN100071-d、DBN100071-a 和 DBN100071R (已知序列)中的 T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、PIC9-01核苷酸序列、PIC9-01取代核苷酸序列、PIC9-01缺失核苷酸序列、PIC9-01添加核苷酸序列、已知序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入PIC9-01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01取 代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01添加核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株(正對照)；同時以野生型玉米植株作為負對照。對于農(nóng)桿菌介導的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)IC9-01核苷酸序列傳遞至幼胚之ー的至少ー個細胞(步驟I :侵染步驟)，所述啟動子可操作地與PIC9-01核苷酸序列相連。在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=O. 4-0. 6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖 68. 5g/L、葡萄糖 36g/L、こ酰丁香酮(AS) 40mg/L、2, 4- ニ氯苯氧こ酸(2，4-D) Img/L，pH5. 3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖 10g/L、こ酰丁香酮(AS)100mg/L、2, 4-ニ氯苯氧こ酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有ー個選擇性的“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- ニ氯苯氧こ酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L, pH5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3 :恢復步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4 :選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5g/L、2，4- ニ氯苯氧こ酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)，導致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5 :再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-こ酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。2、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)入PIC9-01核苷酸序列的玉米植株分別取轉(zhuǎn)入PIC9-01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01添加核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品,用Qiagen的DNeasy Plant MaxiKit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測PIC9基因的拷貝數(shù)。同時以野生型玉米植株作為負對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。檢測PIC9基因拷貝數(shù)的 具體方法如下步驟11、分別取轉(zhuǎn)入PIC9-01核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-01添加核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復；步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/uI；步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為負對照，每個樣品3個重復，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是以下引物和探針用來檢測PIC9-01核苷酸序列、PIC9-01取代核苷酸序列、PIC9-01缺失核苷酸序列和PIC9-01添加核苷酸序列引物I (CFl) :ATCGTGAACAACCAGAACCAGTG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；引物2 (CRl) CTCCAGGATCTCGATCTCCG 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；探針I(yè) (CPl) :CGTGCCGTACAACTGCCTGAACAACC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；以下引物和探針用來檢測已知序列引物3 (CF2) CGACTATGCTGTTCGCTGGTAC 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；引物4 (CR2) GTTGTACCTGACCCAATCACGAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；探針2 (CP2) CGGTCCCCAAACACGTTCGAGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；PCR反應體系為
權(quán)利要求
1.一種殺蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，包括 (a)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或 (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或 (c)通過包含SEQID NO: I的核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或 (d)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列具有在嚴格條件下與SEQ ID NO: I的核苷酸序列雜交的互補序列；或 (e)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與(d)的核苷酸序列同類編碼。
2.—種殺蟲基因，其特征在于，包括 (a)編碼具有SEQID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (b)編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列為在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或 (c)具有SEQID NO: I所示的核苷酸序列；或 Cd)在嚴格條件下與(C)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (e)與(d)的核苷酸序列同類編碼。
3.—種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求2所述殺蟲基因。
4.一種包含權(quán)利要求2所述殺蟲基因或權(quán)利要求3所述表達盒的重組載體。
5.一種包含權(quán)利要求2所述殺蟲基因或權(quán)利要求3所述表達盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
7.—種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括 獲得權(quán)利要求5或6所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞； 在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞； 回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
8.一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求3所述表達盒在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求3所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲蛋白質(zhì)一起表達。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲蛋白質(zhì)為Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、a -淀粉酶或過氧化物酶。
10.一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求2所述殺蟲基因或權(quán)利要求3所述表達盒或權(quán)利要求4所述重組載體導入植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
12.一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求2所述殺蟲基因或權(quán)利要求3所述表達盒或權(quán)利要求4所述重組載體導入植物，使導入后的植物產(chǎn)生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
14.一種控制昆蟲害蟲的方法,其特征在于,包括使昆蟲害蟲與抑制量的權(quán)利要求I所述殺蟲蛋白質(zhì)或由權(quán)利要求2所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)接觸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，殺蟲蛋白質(zhì)包括(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)通過包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或(d)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列具有在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸序列雜交的互補序列；或(e)通過包含核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與(d)的核苷酸序列同類編碼。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)表達量高且對昆蟲害蟲的毒力強。
文檔編號A01K67/033GK102796182SQ201210272820
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者張愛紅, 龐潔, 楊進孝, 牛瑞琪, 董雷, 龐雪兵, 楊秋妹, 傅學乾 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司生物技術中心