一種凍存細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種細(xì)胞的凍存方法，尤其是一種改良的快速冷凍法，該方法能在保證細(xì)胞特性不變的情況下提高細(xì)胞的活力。本方法中采用帶孔的紗布袋，將凍存管懸吊在液氮的蒸汽層中，能使凍存管內(nèi)細(xì)胞迅速降溫，復(fù)蘇后細(xì)胞的活力高達(dá)95-99%；采用10%的DMSO+90%的血清作為凍存液，能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，保證細(xì)胞外結(jié)晶短時(shí)間內(nèi)凍住，避免水分的滲入對(duì)細(xì)胞造成損傷；本方法適用于對(duì)任何細(xì)胞系的長(zhǎng)期保存，與現(xiàn)有技術(shù)比較，省略了步驟，簡(jiǎn)化了工藝，復(fù)蘇后的細(xì)胞活力高且細(xì)胞特性不變，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存的目的。
【專利說(shuō)明】一種凍存細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及細(xì)胞保存方法，具體地說(shuō)涉及一種細(xì)胞的凍存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞凍存是細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)之一。研究表明，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196°C液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，在需要的時(shí)候進(jìn)行復(fù)蘇細(xì)胞后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)研究中，適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或因其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。目前，涉及細(xì)胞保存的實(shí)驗(yàn)研究中常用的傳統(tǒng)保存方法有:先將放有細(xì)胞的凍存管置于4°C環(huán)境中保存30分鐘；然后再在-20°C環(huán)境中保存60分鐘；之后再在_80°C環(huán)境中過(guò)夜；最后將凍存管放入液氮罐中。但是由于上述細(xì)胞保種方法中步驟較多，且時(shí)間間隔較長(zhǎng)，導(dǎo)致很容易遺忘，本領(lǐng)域公知，其中任何一個(gè)步驟的拖延都會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞存活。
[0003]目前的細(xì)胞凍存技術(shù)還有:中國(guó)專利CN1821393公開(kāi)了細(xì)胞凍存的方法，其中:1、先將細(xì)胞凍存管放在4°C環(huán)境中5分鐘；2、然后液氮面上I分鐘后，再浸入液氮中保存。這種保存方法，細(xì)胞的復(fù)蘇活力為84.15% ;中國(guó)專利CN1944636公開(kāi)了細(xì)胞凍存的方法，其中:1、先將細(xì)胞凍存管放在18-24°C環(huán)境中20-30分鐘；2、再放在液氮蒸汽層8_20小時(shí)后，最后浸入液氮中；中國(guó)專利CN101070534公開(kāi)了細(xì)胞凍存方法是室溫15分鐘，入程序降溫盒，在-85°C環(huán)境中保存4小時(shí)，再浸入液氮中；中國(guó)專利CN101463340公開(kāi)了組織保存，液氮?dú)饣瘜?80°C，5分鐘，進(jìn)液氮，該專利中組織在氣化層放置時(shí)間過(guò)短，組織還未深凍，組織內(nèi)易產(chǎn)生冰晶，影響組織將來(lái)的復(fù)蘇，降低細(xì)胞活力，并且不能長(zhǎng)期保存；中國(guó)專利CN101711522公開(kāi)了組織保存，在液氮液面層5_20分鐘，進(jìn)液氮，該方法中，在操作過(guò)程中凍存管很容易碰到液氮，而保存細(xì)胞或組織的凍存管剛凍存時(shí)，只要碰到少許液氮，復(fù)蘇后的細(xì)胞幾乎不可能存活。
[0004]上述細(xì)胞或組織的保存方法均采用了漸冷的降溫方法，實(shí)踐顯示，該些保存方法仍存在如下缺陷:細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞活力均< 85%%，細(xì)胞不能長(zhǎng)期凍存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的凍存細(xì)胞的方法，具體的，涉及一種改良的快速冷凍法，該方法能在保證細(xì)胞特性不變的情況下提高細(xì)胞的活力。
[0006]通常有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中，針對(duì)組織的保存一般都只需短期保存，但細(xì)胞株的保存，尤其是長(zhǎng)期保存比組織的保存難度顯著的大。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，其包括如下凍存步驟:
[0007](I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，放入離心管中，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，倒棄上清液，沉淀細(xì)胞混勻成單個(gè)細(xì)胞懸液；
[0008](2)配制細(xì)胞凍存液:按體積比配制成含血清和二甲基亞砜的細(xì)胞凍存液；[0009](3)在細(xì)胞凍存液中加入特定濃度的細(xì)胞后，迅速移至凍存管中；
[0010](4)在凍存管外套帶孔的罩袋，懸吊在液氮的蒸汽層中；
[0011](5)然后直接浸入液氮中保存。
[0012]本發(fā)明方法中，按9份血清+1份二甲基亞砜的體積比配制細(xì)胞凍存液:
[0013]本發(fā)明方法中，特定濃度的細(xì)胞為在每Iml細(xì)胞凍存液中加入細(xì)胞0.5_1*107個(gè)；
[0014]本發(fā)明方法中，在凍存管外套帶孔的罩袋，本發(fā)明的實(shí)施例中優(yōu)選紗布口袋，懸吊在液氮的蒸汽層中3-5小時(shí)。
[0015]本發(fā)明方法中，所述的細(xì)胞包括:人和動(dòng)物的原代細(xì)胞株、傳代細(xì)胞株和單抗細(xì)胞株。
[0016]結(jié)果顯示，本發(fā)明的細(xì)胞的凍存方法，由于在凍存管外加帶孔的罩袋，尤其是帶有很多小孔的紗布袋，將凍存管懸吊在液氮的蒸汽層中，能使凍存管內(nèi)細(xì)胞迅速降溫，顯著提高了復(fù)蘇后細(xì)胞的活力，經(jīng)檢測(cè)，復(fù)蘇后細(xì)胞的活力高達(dá)95-99% ;本發(fā)明中，采用10%的DMS0+90%的血清作為凍存液，能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，由于采用快速凍存的方法，能保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即凍住，避免由于緩慢凍存使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷，從而可保證細(xì)胞特性不變，有利于細(xì)胞的長(zhǎng)期保存。
[0017]本發(fā)明的方法適用于對(duì)任何細(xì)胞系的長(zhǎng)期保存，與現(xiàn)有技術(shù)(中國(guó)專利CN1944636)比較，不但省略 了步驟，簡(jiǎn)化了工藝，且經(jīng)跟蹤10多年，結(jié)果表明復(fù)蘇后的細(xì)胞活力確實(shí)能達(dá)到95%-99%，且細(xì)胞特性不變，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存的目的。
[0018]本發(fā)明的凍存細(xì)胞的方法的優(yōu)點(diǎn)有:
[0019]1、采用帶孔的紗布袋，將凍存管懸吊在液氮的蒸汽層中，能使凍存管內(nèi)細(xì)胞迅速降溫，復(fù)蘇后細(xì)胞的活力高達(dá)95-99% ；
[0020]2、采用10%的DMS0+90%的血清作為凍存液，能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，保證細(xì)胞外結(jié)晶短時(shí)間內(nèi)凍住，避免水分的滲入對(duì)細(xì)胞造成損傷；
[0021]3、保證細(xì)胞特性不變，利于細(xì)胞長(zhǎng)期保存。
[0022]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
[0024](I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌細(xì)胞CPA_Yang5細(xì)胞(保藏編號(hào)=CGMCC N0.3139)，放入離心管中，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，倒棄上清液后，用手指在離心管外輕輕彈擊，即可使離心管內(nèi)的沉淀細(xì)胞混勻成單個(gè)細(xì)胞懸液；(2)配制細(xì)胞凍存液:按9份血清+1份二甲基亞砜的體積比配制而成；(3)在每Iml細(xì)胞凍存液中加入所述細(xì)胞0.5-1*107個(gè)，迅速移至凍存管中；(4)在凍存管外套一個(gè)紗布口袋，懸吊在液氮的蒸汽層中放置3-5小時(shí)；(5)然后直接浸入液氣中保存。
[0025]結(jié)果顯示，本快速凍存的方法能很好的保證細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞活力好，并保持其細(xì)胞特性不變，有利于細(xì)胞的長(zhǎng)期保存，細(xì)胞活力可達(dá)到95%-99%。而且保存方法簡(jiǎn)便，避免了因操作不當(dāng)而破壞保存細(xì)胞的情況。與現(xiàn)有技術(shù)(中國(guó)專利CN1944636)比較，不但省略了步驟，簡(jiǎn)化了工藝，而`且凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后的活力更好，可以做到長(zhǎng)期保存。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，其包括如下步驟: (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，放入離心管中，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，倒棄上清液，沉淀細(xì)胞混勻成單個(gè)細(xì)胞懸液； (2)配制細(xì)胞凍存液:按體積比配制成含血清和二甲基亞砜的細(xì)胞凍存液； (3)在細(xì)胞凍存液中加入特定濃度的細(xì)胞后，迅速移至凍存管中； (4)在凍存管外套帶孔的罩袋，懸吊在液氮的蒸汽層中； (5)然后直接浸入液氮中保存。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，按9份血清加1份二甲基亞砜的體積比配制細(xì)胞凍存液。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，特定濃度的細(xì)胞為在每Iml細(xì)胞凍存液中加入細(xì)胞0.5-1*107個(gè)。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述的帶孔的罩袋為紗布口袋。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紗布口袋懸吊在液氮的蒸汽層中3-5小時(shí)。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞包括:人和動(dòng)物的原代細(xì)胞株、傳代細(xì)胞株和單抗細(xì)胞株。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103518702SQ201210226668
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】?jī)?chǔ)以微, 鄭秀娟 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)