專利名稱：龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類低溫生物學(xué)及魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種龍躉精子超低溫冷凍保存方法。
背景技術(shù)：
龍冤(EpinephelusIanceolatus),屬S盧形目(Perciformes)、酯科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephalus)，為暖水性、中下層珊瑚礁魚類，生長速度快，I齡魚可生長到
I.5-3. Okg, 2齡生長到5-6kg,最大可以成長至約I. 7m, 440kg,是石斑魚類中體型最大者，故也被稱為“斑王”。分布于印度洋非洲東岸至太平洋中部密克羅尼西亞，南至澳大利亞，中 國產(chǎn)于南海(南沙群島)海域，但數(shù)量稀少。龍躉人工養(yǎng)殖始于上世紀末，人工繁殖和苗種培育技術(shù)尚不成熟，人工養(yǎng)殖苗種數(shù)量不足，限制了鞍帶石斑魚養(yǎng)殖的發(fā)展。由于龍躉具有生長快的優(yōu)點，對于開發(fā)石斑魚優(yōu)良遺傳資源，培育生長快養(yǎng)殖新品種，提高養(yǎng)殖效益具有重要的意義。但是龍躉具有雌雄同體，雌性先熟的特點，同一群體中只有年齡最大，個體最大的魚才性轉(zhuǎn)化為雄性。這ー特性給龍躉的人工繁殖、生產(chǎn)和雜交育種造成一定的困難，因此研究龍躉精子超低溫冷凍保存技術(shù)，可以有效的解決為ー問題。目前國內(nèi)外僅在環(huán)境因素對龍躉精子活力影響方面進行了研究(廣東省大亞灣水產(chǎn)實驗中心，梁偉峰等，2009);但對龍躉精子超低溫冷凍保存，并利用冷凍精子進行雜交育苗及育種方面的研究，還未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種龍躉精子超低溫冷凍保存方法，以解決南北方石斑魚雜交中，雌雄魚成熟不同步、養(yǎng)殖地理隔離較大，南方魚類在北方養(yǎng)殖困難等問題，以及龍躉精子冷凍保存成活率低，難于在生產(chǎn)中大量應(yīng)用等問題。技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的I、精液的采集在繁埴季節(jié)人工采集成熟精液,利用50ppm 丁香酹麻醉龍冤,人工擠壓腹部流出乳白色精液，利用注射器吸取精液，防止尿液和海水混入，將采集的精液注入IOOml玻璃瓶，將收集精液的玻璃瓶放置在有冰塊的保溫盒中；2、精子活力檢測醮取少許精子涂在載玻片上，滴加一滴海水激活，在顯微鏡下觀察精子活力，活力達到90%以上可以進行冷凍保存；3、冷凍保存液(ELS)配制在蒸懼水中加入60g/L葡萄糖(Glucose)、10g/L NaCl>O. 5g/L NaHCO3、再加入體積比為10% DMSO和10%胎牛血清(FBS)；4、精液稀釋將冷凍保存液與精液以I : I的比例混合，放置在有冰塊的保溫盒平衡 5min ；5、精子超低溫冷凍保存利用Iml移液槍將稀釋后精液注入2ml的冷凍管中，每管加入稀釋精液1ml，再將冷凍管懸置在-60--80°C的液氮蒸氣中平衡lOmin，然后沉入液氮(-196°C )中冷凍保存；6、精子解凍和檢測將冷凍管從液氮中取出，在液氮蒸氣中平衡lmin，將冷凍管放入37°C水浴中解凍，取少許解凍后精液涂抹在載玻片上，滴加一滴海水激活，在顯微鏡下觀察精子活力；7、冷凍精子受精將解凍后精子活力達到80%以上精子加入到采集的石斑魚卵中，精卵比為I : 200ml，利用玻璃棒輕輕攪拌混合，靜置5min，加入2倍于卵量的海水受
不目o
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果I、發(fā)明了一種新的精子冷凍保存液配方(ELS :60g/L葡萄糖+10g/L NaCl+0. 5g/LNaHC03+10% DMS0+10%胎牛血清)，具有成分簡單、易操作、冷凍保存精子量大、成活率高的特點；2、精子冷凍成活率高，利用本發(fā)明方法冷凍保存龍躉精子成活率達到83. 76%，與未冷凍精子成活率無顯著差異。3、解決了石斑魚雜交育種中雌雄魚成熟不同步、各種石斑魚地理隔離較遠、雄魚數(shù)量少、精液量不足的問題。4、精液保存量大，每次冷凍保存量可達到50ml以上，可大量應(yīng)用于石斑魚人工繁殖、雜交育種等方面。具體實施方法下面結(jié)合龍躉精子冷凍保存和雜交受精來進一步解釋本發(fā)明。I、精液的采集利用海南省陵水縣新村鎮(zhèn)(海南藍海洋科技養(yǎng)殖公司)培育的龍躉雄魚6條，體長I. 3-1. 6m,體重35-40kg。在2012年4月繁殖季節(jié)人工采集成熟精液。利用50ppm 丁香酚麻醉龍躉，人工擠壓腹部流出乳白色精液，利用50ml注射器吸取精液，防止尿液和海水混入。將采集的精液注入IOOml玻璃瓶，將收集精液的玻璃瓶放置在有冰塊的保溫盒中，共采集精液55ml。2、精子活力檢測醮取精液涂片，滴加海水激活，在顯微鏡下檢測，精子活力達到93. 33±2. 89%。3、冷凍保存液(ELS)配制在蒸餾水中加入60g/L葡萄糖(Glucose)、10g/L NaCl、0. 5g/L NaHCO3、再加入體積比為10% DMSO和10%胎牛血清(FBS)；3、精子冷凍保存利用精子冷凍保存液(ELS)以I : I的比例稀釋精液，利用移液槍吸取稀釋精液Iml加入2ml的冷凍管，將冷凍管懸置在-60—80°C的液氮蒸氣中平衡lOmin，然后沉入液氮(_196°C)中冷凍保存。共冷凍保存精液110管(110ml)。4、精子解凍和檢測將冷凍管從液氮中取出，在液氮蒸氣中平衡lmin，將冷凍管放入37°C水浴中解凍。取少許解凍后精液涂抹在載玻片上，滴加一滴海水激活，在顯微鏡下觀察精子活力。解凍后精子活力達到83. 76 ±7. 45%。5、冷凍精子受精及雜交育苗在海南藍海洋科技養(yǎng)殖公司冷凍保存龍躉精液110管(IlOml)，將冷凍精液運輸?shù)缴綎|萊州明波水產(chǎn)有限公司，采集該公司培育的紅點石斑魚成熟卵子800ml，解凍龍躉精子4管(4ml)，加入采集的卵子中，用玻璃棒輕輕攪動混合，采用干法受精，靜置5ml后，加入2倍于卵子的海水。之后將受精卵置于小網(wǎng)中沖洗，洗去卵液，將受精卵放入22°C海水中孵化。受精率達到94. 56%，孵化率達到62. 5%，獲得發(fā)眼卵500ml，孵化出 魚苗40萬尾左右。
權(quán)利要求
1.一種龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，包括精子采集、精子活力檢測、冷凍保存液配制、精液稀釋、精子超低溫冷凍保存、精子解凍和檢測、冷凍精子受精，其特征在于精子冷凍保存液配制在蒸餾水中加入60g/L葡萄糖、10g/LNaCl、0. 5g/L NaHC03、10%胎牛血清和10% ニ甲基亞砜配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，其特征在于精子采集時利用50ppm 丁香酚麻醉龍躉，人工擠壓腹部采集精液，防止尿液和海水混入。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，其特征在于精子活力檢測時龍躉精子活力在90%以上的精液可用于冷凍保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，其特征在于所述的精液稀釋為冷凍保存液與精液以I : I的比例稀釋混合，放置在有冰塊的保溫盒平衡5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，其特征在于所述的精子超低溫冷凍保存為將稀釋精液Iml注入2ml冷凍管中，將冷凍管置于-60--80°C的液氮蒸氣中平衡lOmin，直接將冷凍管投入液氮中冷凍保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，其特征在于所述的精子解凍和檢測為將精子冷凍管放入37°C水浴中解凍，鏡檢后冷凍精子活力平均達83. 67%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，其特征在于所述的冷凍精子受精為將解凍精子加入未受精卵中混合均勻，精卵比例為I : 200ml，靜置5min后加入2倍于卵的海水受精。
全文摘要
一種龍躉精子超低溫冷凍保存應(yīng)用方法，屬于魚類低溫生物學(xué)及魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)領(lǐng)域，其技術(shù)方法包括精液采集、精子活力檢測、冷凍保存液(ELS)配制、精液稀釋、精子超低溫冷凍保存、精子解凍和檢測、冷凍精子受精。本發(fā)明技術(shù)方法冷凍精子活力平均達83.67％，與新鮮精子無顯著差異，能與紅點石斑進行雜交育苗。該發(fā)明技術(shù)方法利用稀釋液配方簡單、成本低，可大量冷凍保存龍躉精液，從而解決了龍躉人工繁殖中雌雄成熟不同步、與其它石斑魚雜交中地理隔離較大、精液量不足的問題。
文檔編號A01K61/00GK102726369SQ20121020830
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者楊傳軍, 梁友, 田永勝, 翟介明 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所