專利名稱：一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物疾病防治領域，尤其涉及一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種及其在防治草莓炭疽病中的應用。
背景技術：
近年來，隨著公眾對食品和環(huán)境中化學農藥安全性的普遍關注，以及一些危險性化學農藥的禁用，促使人們尋求安全有效的植物病害控制新途徑，利用有益微生物防治植物病害日趨受到重視。它是向被打破了的植物自然生態(tài)系中引入對植物有益的外源拮抗菌、或通過調節(jié)環(huán)境促使自然的有益微生物群體增長，并表現(xiàn)出生防活性，通過微生物之間的相互作用達到防病目的。目前，植物病害的生防已成為各國研究重點。自然界潛在的微生物資源種類豐富，在微生物農藥的產品開發(fā)方面有明顯優(yōu)勢，因此世界各國都投入大量的人力和財力，研究、開發(fā)具有自主知識產權的新型微生物農藥，并以此帶動其他高科技產業(yè)的全面發(fā)展。我國也把微生物農藥的研制和開發(fā)列為國家重點科技攻關和聞新技術發(fā)展計劃。生物農藥(biopesticides),按照Copping和Menn的定義包含了活體微生物(真菌、細菌和病毒)，昆蟲植病線蟲，植物源農藥，微生物農藥，微生物次生代謝物(抗生素)等，用于防治各種昆蟲和病害，生物農藥(特別是微生物農藥)具有獨特的優(yōu)點是對人類健康威脅小，對環(huán)境安全，這正是全社會最關心的問題之一。因此，進入21世紀以來，各國政府和民眾更加重視生物農藥的開發(fā)和應用，已成為研究熱點。微生物農藥的特性賦予了農業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，為保護農業(yè)生態(tài)環(huán)境，保障食品安全提供物質基礎和技術支撐；同時微生物農藥產業(yè)也是未來經濟中具有發(fā)展?jié)摿Φ男略鲩L點之一。研究微生物農藥產業(yè)發(fā)展對于政府部門科學制定促進微生物農藥產業(yè)發(fā)展的政策體系，實現(xiàn)農藥產業(yè)結構調整，促進循環(huán)經濟和可持續(xù)社會發(fā)展戰(zhàn)略，保障我國經濟建設和農業(yè)生態(tài)環(huán)境的協(xié)調發(fā)展，以及建設我國農產品安全體系等都將具有十分重要的理論意義和實踐意義。草莓(Fragaria ananassa Duchesne)是一種集栽培和觀賞于一體的宿根性、多年生草本資源植物。在草莓栽培區(qū)，炭疽病、灰霉病和黃萎病是阻礙草莓產業(yè)發(fā)展瓶頸。其中草莓炭疽病(Colletotrichum fragariae A. N. Brooks)的危害最嚴重,在每年的草莓生長期危害莖、葉柄、葉片，托葉，在后期危害花和果實，直接影響到草莓產量，造成很大經濟損失。對該病害的傳統(tǒng)防治大多采用化學藥劑噴灑植株表面，造成土壤不同程度的農藥殘留和污染問題，影響產品質量和人們的身體健康。從保護生態(tài)環(huán)境和食品安全的角度出發(fā)，草莓生產需要有低毒、污染少，對人體安全的微生物制劑來控制草莓病害，已達到草莓安全食用的目的。也符合生物農業(yè)發(fā)展和政府、社會與生物農藥產業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內容
發(fā)明目的為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種對草莓炭疽菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌植物亞種。本發(fā)明的第二目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種B203在防治草莓炭疽病中的應用。本發(fā)明的第三目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制微生物生長中的應用。技術方案為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案為一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefacienssubsp. Plantarum) B203,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號為CGMCC No. 6156，保藏日期為2012年05月25日。解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillusamyloliquefaciens subsp. pl·antarum)B203的生理活性特征如下所述解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落較大，乳白色，直徑一般4_6mm,表面隆起，干燥，有皺褶，邊緣較規(guī)則，菌體桿狀，兩端鈍圓，大小為I. 23-1. 87 X 0. 62-0. 80 u m,平均1.48X0. 68iim ;芽孢兩端生，橢圓形，大小為1.01-1.41X0. 62-0. 75 u m,平均I. 14X0. 67 u mD革蘭氏染色表現(xiàn)為陽性；酪蛋白水解、淀粉水解、明膠液化為陽性，V. P反應可變，吲哚反應陰性；糖類產酸發(fā)酵。所述解淀粉芽孢桿菌植物亞種的16SrDNA序列如SEQ ID No. I所示。將所測16SrDNA序列通過BLAST比對，鑒定其為解淀粉芽孢桿菌植物亞種。所述的解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum) B203是在防治草莓炭疽病中的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種是在抑制草莓炭疽菌生長中的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種是在抑制草莓灰霉菌生長中的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種是在抑制可可球二孢生長中的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種是在抑制聚生小穴殼生長中的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種是在抑制楊擬莖點霉菌生長中的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種是在抑制不高雙孢菌生長中的應用。具體應用為將解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum) B203接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C _35°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，得到的發(fā)酵液作為防治草莓炭疽菌的菌劑。本發(fā)明中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為1000mL蒸餾水，牛肉膏2_5g，蛋白胨5-10g，氯化鈉 4-5g，pH6. 5-7.5。有益效果與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是(I)解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B203對多種植物病原菌具有抑制作用，在拮抗細菌對植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如種類和數量眾多；對病原菌的作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產應用；抗逆能力強等優(yōu)點，尤其是對真菌引起的草莓炭疽病的防治具有重要意義；也是控制鮮食水果安全的有效措施。(2)解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp. plantarum)B203培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。



圖Ia 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203 形態(tài)圖；圖Ib 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203芽抱形態(tài)圖；圖2a 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203 對草莓炭疽菌 Colletotrichum fragariae A. N. Brooks 的抑制作用；圖2b 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum) B203 對草莓灰霉菌 Botrytis cinera Pers. ex Fr.)的抑制作用；圖2c 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum) B203 對可可球二抱[Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & MaubI.的抑制作用；圖2d 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203 對聚生小穴殼(Dothiorella gregaria Sacc.)的抑制作用；圖2e 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203對楊擬莖點霉菌(Phomopsis sp.)的抑制作用；圖2f 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum) B203 對不高雙抱菌[Apiocarpella macrospore (Speg.) H. & P. Syd.]的抑制作用；圖3a 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203對草莓炭疽病的防治作用；圖3b 為解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203菌液處理過的草莓植株。
具體實施例方式下面結合實驗例詳細闡述本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌植物亞種(BacillusamyIoliquefaciens subsp. plantarum)B203 的應用。實驗例I :解淀粉芽抱桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp.plantarum)B203 對草莓炭疽菌 Colletotrichum fragariae A. N. Brooks、草莓灰霉菌Botrytis cinera Pers. ex Fr.)、可可球二抱[Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon& MaubI.、聚生小穴殼(Dothiorella gregaria Sacc.)、楊擬莖點霉菌(Phomopsis sp.)和不高雙抱菌[Apiocarpella macrospore (Speg.)H. & P. Syd.]的平板抑菌作用。將用LB斜面活化的解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefacienssubsp. plantarum) B203菌株劃線接種于直徑9cm玻璃培養(yǎng)皿中的PDA平板培養(yǎng)基一側，再將草莓炭疽菌、草莓灰霉菌、可可球二孢、聚生小穴殼、楊擬莖點霉菌和不高雙孢菌的PDA平板培養(yǎng)物用直徑5mm的打孔器打取同質同量的菌塊，接于平板另一側。28土1°C培養(yǎng)30天觀察抑菌能力，并記錄15天和30天時菌落寬度，見表1，15天時抑菌效果如圖2a至圖2f所示。試驗結果表明，解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203對6種病原菌均有拮抗作用，以占據培養(yǎng)皿的直徑判斷抑制效果，用無菌的PDA圓塊作為對照。表I B203對6種草莓和楊樹病原菌15天和30天的抑制作用
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillusamyloliquefaciens subsp. plantarum) B203,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 6156，保藏日期為2012年05月25日。
2.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在防治草莓炭疽病中的應用。
3.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制草莓炭疽菌生長中的應用。
4.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制草莓灰霉菌生長中的應用。
5.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制可可球二孢生長中的應用。
6.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制聚生小穴殼生長中的應用。
7.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制楊擬莖點霉菌生長中的應用。
8.權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種在抑制不高雙孢菌生長中的應用。
9.根據權利要求2至8任一項所述的應用，其特征在于將解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyIoliquefaciens subsp. plantarum)B203 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在280C _35°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，得到的發(fā)酵液作為防治草莓炭疽菌的菌劑。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為=IOOOmL蒸餾水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化鈉4-5g，pH6. 5-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.6156，保藏日期為2012年05月25日。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種主要用于草莓炭疽病的生物防治。本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌植物亞種B203對草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌和多種楊樹潰瘍病原真菌具有顯著抑制作用，該拮抗細菌對其他多種植物病害也有很好的防治效果；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產應用；抗逆能力強等優(yōu)點，尤其是對真菌引起的草莓炭疽病的防治具有重要意義；培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。
文檔編號A01N63/02GK102703354SQ20121018769
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權日2012年6月8日
發(fā)明者史俊, 席剛俊, 徐超, 楊鶴同, 趙桂華 申請人:江蘇農林職業(yè)技術學院