專利名稱：哈茨木霉t28抑菌成分防治致病疫霉菌制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治致病疫霉菌生物制劑的制備方法，尤其是涉及一種哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，致病疫霉(Phytophthorainfestans Montagne de Bary)是活體營養(yǎng)型的致病卵菌，在Ainsworth (1973)真菌分類系統(tǒng)中隸屬真菌界(Kingdom Fungi)、真菌門(Eumycophyta)鞭毛菌亞門(Mastigomycotina)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)真菌。在現(xiàn)代生物分類系統(tǒng)中隸屬假菌界(Kingdom Chromista)、卵菌門(Oomycota)、卵菌綱、霜霉目、腐霉科、疫霉屬。馬鈴薯是世界第四大糧食作物，也是中國的重要糧、菜、色、飼和工業(yè)兼用原料。由致 病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯的一種毀滅性病害，中國從20世紀80年代起，晚疫病的流行頻率和流行程度逐漸加重，成為馬鈴薯生產(chǎn)的I個重要障礙。黑龍江許多馬鈴薯產(chǎn)區(qū)是全國的種薯基地，雨季集中在7、8月，正值馬鈴薯的結(jié)薯期；晚疫病一旦流行，減產(chǎn)很嚴重并且造成種薯帶菌率高，成為用種地區(qū)晚疫病流行的重要原因。目前馬鈴薯晚疫病的防治極大程度上還是依賴于化學(xué)防治，這雖然給馬鈴薯生產(chǎn)帶來了很高的效益，但是，環(huán)境污染、生態(tài)系統(tǒng)自然平衡的破壞等諸多弊端也隨之而來。因此，尋找高效的生物防治菌株刻不容緩。哈茨木霉(Trichodermaharzianum)屬于半知菌亞門(Deuteromycotina),絲抱綱(Hyphomycetidae),絲抱目(Hyphomycetales),木霉屬(Trichoderma)。目前，國內(nèi)針對哈茨木霉進行生物防治的研究比較多的集中于拮抗作用、抑菌成分、抑菌機理等方面。對于哈茨木霉抑菌活性成分防治致病疫霉菌制劑的制備方法，經(jīng)檢索未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相關(guān)的報道。哈茨木霉菌株T28抑菌活性成分制劑對致病疫霉菌室內(nèi)生長抑制率接近70%，孢子囊萌發(fā)抑制率超過70%，游動孢子釋放抑制率超過75%。采用該制劑浸種后播種、生長季節(jié)噴施制劑，可有效控制馬鈴薯晚疫病發(fā)生，同時可顯著提高馬鈴薯產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)中存在的不足之處，提供一種哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制劑的制備方法。為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是哈茨木霉T28發(fā)酵液的制備(I)采用改良馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按比例組成為馬鈴薯 100g-200g、葡萄糖 10g-20g、KH2P042g-3g、MgS04lg_2g、水 500ml-1000ml,發(fā)酵液pH5. 0-6. 0，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)5-10天，接種量為發(fā)酵液體積的1%_2%，裝液量為錐形瓶容積的35%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度25°C _30°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)125r/min-150r/min ；
(2)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌活性成分提取將培養(yǎng)5-10天的哈茨木霉菌株T28發(fā)酵液用無菌紗布過濾，置于冷凍離心機中，在之后用O. 22 μ m的濾頭過濾，將濾液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h_5h，水浴加熱至50°C，攪拌、加速溶解，將濾液和乙醇的混合溶液濃縮至200ml，加入沸點為60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分離兩部分溶劑，將水層與IOOOml乙醚混合，常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，將水層與IOOOml乙酸乙酯混合，在常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，棄水層，將乙酸乙酯層以50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直至液體全部蒸發(fā)干，圓底燒瓶底部有黃褐色粉末掛壁；得到抑菌活性成分；(3)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌成分制劑的制備將抑菌活性成分用10%吐溫80溶液溶解，恢復(fù)為原發(fā)酵液過濾液體積的1/10。本發(fā)明的優(yōu)點是 本發(fā)明采用的原料為可再生的菌物資源，來源豐富、價廉，對由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病具有顯著的抑制效果，本發(fā)明具有高效、低毒、無公害等特點，對防治由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作進一步詳細描述。實施例I、哈茨木霉T28發(fā)酵液的制備(I)采用改良馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按比例組成為馬鈴薯100g、葡萄糖10g、KH 2P042g、MgS04lg、水500ml，發(fā)酵液pH5. 0，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)5天，接種量為發(fā)酵液體積的1%，裝液量為錐形瓶容積的35%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)125r/min ；(2)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌活性成分提取將培養(yǎng)5-10天的哈茨木霉菌株T28發(fā)酵液用無菌紗布過濾，置于冷凍離心機中，在之后用O. 22 μ m的濾頭過濾，將濾液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h_5h，水浴加熱至50°C，攪拌、加速溶解，將濾液和乙醇的混合溶液濃縮至200ml，加入沸點為60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分離兩部分溶劑，將水層與IOOOml乙醚混合，常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，將水層與IOOOml乙酸乙酯混合，在常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，棄水層，將乙酸乙酯層以50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直至液體全部蒸發(fā)干，圓底燒瓶底部有黃褐色粉末掛壁；得到抑菌活性成分；(3)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌成分制劑的制備將抑菌活性成分用10%吐溫80溶液溶解，恢復(fù)為原發(fā)酵液過濾液體積的1/10。實施例2、哈茨木霉T28發(fā)酵液的制備(I)采用改良馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按比例組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、KH 2P043g、MgS042g、水1000ml，發(fā)酵液pH6. 0，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)10天，接種量為發(fā)酵液體積的2%，裝液量為錐形瓶容積的35%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)150r/min ；
(2)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌活性成分提取將培養(yǎng)5-10天的哈茨木霉菌株T28發(fā)酵液用無菌紗布過濾，置于冷凍離心機中，在之后用O. 22 μ m的濾頭過濾，將濾液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h_5h，水浴加熱至50°C，攪拌、加速溶解，將濾液和乙醇的混合溶液濃縮至200ml，加入沸點為60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分離兩部分溶劑，將水層與IOOOml乙醚混合，常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，將水層與IOOOml乙酸乙酯混合，在常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，棄水層，將乙酸乙酯層以50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直至液體全部蒸發(fā)干，圓底燒瓶底部有黃褐色粉末掛壁；得到抑菌活性成分； (3)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌成分制劑的制備將抑菌活性成分用10%吐溫80溶液溶解，恢復(fù)為原發(fā)酵液過濾液體積的1/10。
權(quán)利要求
1.一種哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制劑的制備方法，其特征在于 哈茨木霉T28發(fā)酵液的制備 (1)采用改良馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按比例組成為馬鈴薯 100g-200g、葡萄糖 10g-20g、KH2P042g-3g、MgS04lg_2g、水 500ml-1000ml,發(fā)酵液pH5. 0-6. 0，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)5-10天，接種量為發(fā)酵液體積的1%_2%，裝液量為錐形瓶容積的35%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度25°C _30°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)125r/min-150r/min ； (2)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌活性成分提取將培養(yǎng)5-10天的哈茨木霉菌株T28發(fā)酵液用無菌紗布過濾，置于冷凍離心機中，在之后用0. 22 iim的濾頭過濾，將濾液200ml加入800ml95%的分析乙醇浸提3h-5h，水浴加熱至50°C，攪拌、加速溶解，將濾液和乙醇的混合溶液濃縮至200ml，加入沸點為60°C的石油醚800ml浸提2h_5h并用分液漏斗分離兩部分溶劑，將水層與IOOOml乙醚混合，常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，將水層與.1OOOml乙酸乙酯混合，在常溫下靜止放置2h-5h，分液漏斗過濾，棄水層，將乙酸乙酯層以.50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直至液體全部蒸發(fā)干，圓底燒瓶底部有黃褐色粉末掛壁；得到抑菌活性成分； (3)哈茨木霉T28發(fā)酵液中抑菌成分制劑的制備將抑菌活性成分用10%吐溫80溶液溶解，恢復(fù)為原發(fā)酵液過濾液體積的1/10。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種哈茨木霉T28抑菌成分防治致病疫霉菌制劑的制備方法，采用PD培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵，獲得T28發(fā)酵液將發(fā)酵液過濾、冷凍離心、經(jīng)0.22μm濾頭過濾后，經(jīng)乙醇浸濃縮后加入不同極性的有機溶劑分步驟進行提取(乙醚、乙酸乙酯)，將乙酸乙酯層以50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至黃色粉末掛壁；得到抑菌活性成分并溶于10%的吐溫80溶液，得到制劑。本發(fā)明采用的原料為可再生的菌物資源，來源豐富、價廉，對由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病具有顯著的抑制效果，本發(fā)明具有高效、低毒、無公害等特點，對防治由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A01N63/04GK102696687SQ20121016069
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者宋瑞清, 楊立賓 申請人:東北林業(yè)大學(xué)